Name: assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por la Fundación Suiza de ciencia nacional (FNS, Grant No. 320030_156193). Los autores agradecen a Dr. Benoît Werlen para proporcionar los granos de potencia Biosilon. También agradecemos el Prof. Hans Peter Kohler y Prof. André Haeberli ayuda para configurar el modelo de grano potencia.

se utilizaron cerdos Landrace alemán (tipo salvaje criado en una granja local y transgénico criados en el Instituto de reproducción Animal Molecular y biotecnología, Universidad Ludwig-Maximilian, Munich, Alemania), peso entre 30 kg a 40 kg, en Este estudio. Todos los animales fueron alojados bajo condiciones estándar con alimentos y agua ad lib. Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a la ley de animales de Reino Unido (procedimientos científicos) y la guía de NIH para el cuidado y u...

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	<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li><li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children.">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li><li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation.">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li><li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro.">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li><li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation:+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood.">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li><li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation.">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li><li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx:+composition,+functions,+and+visualization.">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li><li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces.">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li><li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium:+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions.">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li><li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles.">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li><li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs.">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li></ol>

El modelo presentado aquí es conveniente para la coagulación relacionados con estudios, que permite el análisis de diferentes aspectos de la coagulación y su interacción con EC. 8 en la investigación del xenotransplantation, es un sistema útil para probar las propiedades anticoagulantes de la ECs porcinos genéticamente diferentes después de la incubación con sangre humana 9.
Los pasos más críticos del protocolo son los asegurar cobert...

El endotelio vascular consiste en una monocapa de células endoteliales (CE) que recubren el lumen de los vasos sanguíneos. En un estado fisiológico, CE quieto son responsables por el mantenimiento de un entorno antiinflamatorio y anticoagulante. 1 esto es mediado por la expresión de anticoagulantes y antiinflamatorias proteínas en la superficie de la CE. Por ejemplo, activación de CE causada por isquemia/reperfusión lesiones o rechazo vascular (xeno-) trasplantados resultados de órganos en un cambio de la superficie endotelial de un anticoagulante y antiinflamatorio estado Pro coagulante y pro-inflamatoria Estado. 1
Para estudiar la fascinante y compleja interacción entre los factores del endotelio y coagulación, en vitro modelos que imitan como posible la situación en vivo son altamente deseables. Una limitación común que caracteriza a ensayos de coagulación convencional en vitro es el uso de sangre con anticoagulante que hace que el análisis de los efectos de la coagulación mediada por ardua y no se puede reproducir incluso recalcificación de la sangre entera citratado resultados obtenibles con sangre fresca sin anticoagulante. 2 además, en los sistemas de cultivo celular de plano tradicional es imposible explotar las propiedades anticoagulantes del endotelio como una suficiente superficie de la célula endotelial por el volumen de sangre no se puede llegar. El modelo presentado aquí supera estas limitaciones por CE el cultivo en la superficie de los granos de la potencia esférica, de modo que una proporción de superficie a sangre CE de &#62; 16 cm2/ml puede ser alcanzado, que es similar a la situación en las pequeñas arteriolas o venas, y que fue descrito para ser suficiente para permitir la "natural" anticoagulación de la sangre por la superficie de la CE. 3 , 4 puede utilizarse sangre entera sin agregado anticoagulantes en este contexto. Muestras de sangre se pueden recoger durante el experimento y citoquinas, factores de coagulación y marcadores de la activación de complemento soluble pueden ser detectados y cuantificados. Además, granos recubiertos de CE potencia pueden analizarse para la deposición del complemento y de inmunoglobulinas así como la expresión de marcadores de activación de CE por microscopia confocal. Otra aplicación interesante incluye la prueba de drogas que se suponen para evitar la coagulación y, por tanto, la activación endotelial de la célula. 5 aunque este modelo no puede sustituir completamente los experimentos con animales, ofrece un método para probar hipótesis funcionales específicas ex vivo con células y reducir así el número de animales utilizados en investigación básica en isquemia/reperfusión trasplante de la lesión o (xeno).
El modelo descrito fue utilizado para imitar un xenotrasplante en que células endoteliales aórticas porcinas (PAEC) son cultivadas en los granos de potencia y se incubaron con todo, no anticoagulada sangre humana. Se analizaron diferentes PAEC transgénico, portadores de varios genes humanos como CD46 para la regulación del sistema del complemento o trombomodulina (hTBM) para la regulación del sistema de coagulación, por sus propiedades anticoagulantes. Sistemas de activación de complemento y coagulación de células endoteliales bien controlados y conectadas entre sí. 6 por lo tanto es importante entender cómo se comportan las células transgénicas diferentes tras la exposición a sangre humana con respecto a la expresión de la molécula de adhesión y liberación de citoquinas, vertimiento del glicocálix y pérdida de proteínas anticoagulantes. 7

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PAEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from pig aorta in our Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcarrier beads (Biosilon)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Bovine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10644-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1726.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T406-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer flasks</td>
			<td>Tecnomara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological stirrer</td>
			<td>Brouwer</td>
			<td>MCS-104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti CD31</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB33871</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-166-003</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6458</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti vWF</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dk anti Gt IgG &#8211; Alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit - FITC</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-25MG-F</td>
			<td>Dilution 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Concentration: 10% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td>Size: 0.8x19 mm (21&#610; 3/4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>14.1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Available for free at: https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td>2mL in 500mL of DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinun natricum</td>
			<td>Drossa Pharm AG</td>
			<td></td>
			<td>Stock concentration: 5000 U.I./ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamberslides</td>
			<td>Bioswisstec AG</td>
			<td>30108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x6 H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.5833.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood

In vivo, las células endoteliales son cruciales para la anticoagulación natural de sangre circulante. En consecuencia, activación de la célula endotelial conduce a la coagulación de la sangre. Este fenómeno se observa en muchas situaciones clínicas, como el trasplante de órganos en presencia de formados anticuerpos de anti-donantes, como xenotrasplante, así como en la isquemia/reperfusión. Con el fin de reducir la experimentación animal según el 3R estándares (reducción, reemplazo y refinamiento), en vitro modelos para estudiar el efecto de la célula endotelial, activación de la coagulación de la sangre sería muy deseable. Sin embargo, sistemas comunes de plano de la cultura de célula endotelial ofrecen una relación superficie a volumen de 1-5 cm2 de endotelio por mL de sangre, que no es suficiente para la anticoagulación natural, mediada por el endotelio. Cultivo de células endoteliales en la cuenta de la potencia puede aumentar la relación superficie-volumen 40-160 cm2/ml. Este ratio mayor es suficiente para asegurar la anticoagulación "natural" de sangre, por lo que puede evitarse el uso de anticoagulantes. Aquí se describe para estudiar los efectos de la modificación genética de las células endoteliales porcinas en coagulación de la sangre no anticoagulada todo, un en vitro potencia-sistema basado. En el análisis descrito, células endothelial aórticas porcinas primarias, ya sea tipo salvaje (WT) o transgénicos para humanos CD46 y trombomodulina, crecido en granos de potencia y luego expuesto a sangre humana recién extraída sin anticoagulante. Este modelo permite la medición y cuantificación de la liberación de citoquinas y activación marcadores de complemento y coagulación en el plasma sanguíneo. Además, la proyección de imagen de células endoteliales activadas y la deposición de inmunoglobulinas, complemento y coagulación de proteínas en los granos endotelizados fueron realizadas por microscopia confocal. Este ensayo también puede utilizarse para probar fármacos que se suponen para evitar la coagulación y, por tanto, la activación endotelial de la célula. Encima de su potencial para reducir el número de animales utilizados para tales investigaciones, el ensayo descrito es fácil de realizar y consistentemente reproducible.

Después de 7-10 días de cultivo en el matraz de spinner (figura 1) las células eran confluentes, cubriendo toda la superficie de los granos de potencia (figura 2). Verificación del estado confluency es un paso importante porque una monocapa no confluentes de CE de los microbeads conducirá a una disminución marcada en el tiempo de coagulación, dada la potencia superficie de granos de la es fuertemente Pro coagulante (tiempo...

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Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Se presenta un modelo en vitro que permite el estudio y análisis de la coagulación en sangre no anticoagulada todo. Anticoagulación en el sistema depende el efecto de anticoagulación natural de las células endoteliales sanas y activación de células endoteliales resultará en la coagulación.

Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Investigación

Medicina

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Rapid Point-of-Care Ensayo de la eficacia anticoagulante enoxaparina en sangre entera

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

La evaluación no invasiva de la función endotelial microvascular y

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

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Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

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Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

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Ultrasound Assessment of Endothelial Function: A Technical Guideline of the Flow-mediated Dilation Test

La evaluación ecográfica de la función endotelial: Una guía técnica de la prueba de dilatación mediada por flujo

Cardiovascular disease is the primary cause of mortality and a major cause of disability worldwide. The dysfunction of the vascular endothelium is a ...