Name: dna polymerase activity assay using near-infrared fluorescent labeled dna visualized by acrylamide gel electrophoresis
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da Research Corporation per l'avanzamento scientifico (Cottrell College Scholar Award n. 22548) e da TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).

1. analisi di attività Nota: ci sono due tipi comuni di saggi che vengono spesso eseguiti per caratterizzare le polimerasi del DNA utilizzando i metodi descritti qui. Essi si differenziano se qualitativamente caratterizzano sintesi complessiva (che comprende numerosi passaggi della sintesi del DNA) o se essi si concentrano quantitativamente su singoli passaggi. Descriviamo qui di seguito i passi necessari per ognuno di questi. 
Nota: Poiché l'assemblaggio di materiali è relativamente c...

<ol>
	<li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+DNA+polymerase,+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide.">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li><li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+polymerase+evolution.">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li><li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+DNA+polymerases+for+next-generation+sequencing.">Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).</li><li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+novel+polymerase+activities:+mutation+of+a+DNA+polymerase+into+an+efficient+RNA+polymerase.">Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2'-modified+DNA.">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li><li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+2'-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties.">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li><li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers.">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li><li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide+(FANA)+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity.">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li><li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2'-Modified+Sugar+Recognition.">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li><li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates.">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li><li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li><li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerase+fidelity:+kinetics,+structure,+and+checkpoints.">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li><li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet.">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequencing+by+Capillary+Electrophoresis.">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li><li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression,+purification,+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5'+to+3'+exonuclease+activity.">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li><li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus.">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li><li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+DNA+polymerase+I+(Klenow+fragment)+with+reduced+fidelity.">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics.">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235 (2016).</li><li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2'-5'+Linkages.">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li></ol>

Qui, abbiamo descritto un test per caratterizzare la sintesi di DNA polimerasi-mediata di M-DNA. Utilizzando primer di DNA con etichetta vicino infrarosso, e utilizzando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide denaturante per risolvere diverse dimensioni oligonucleotidi, possiamo ottenere risoluzione di singolo nucleotide su oligonucleotidi, consentendo la misurazione precisa di sintesi. Questi approcci possono essere usati per misurare l'attività complessiva dell'enzima (sezione 2.1) o per misurare i parametri di Mi...

DNA polimerasi eseguire accurata ed efficiente sintesi di DNA e sono essenziali per mantenere l'integrità genomica. La capacità di sintetizzare centinaia di nucleotidi al secondo senza fare errori fa anche strumenti essenziali di DNA polimerasi in biologia molecolare e biotecnologie. Tuttavia, queste proprietà anche limitano le applicazioni per substrati M-DNA; in linea generale, naturale polimerasi del DNA non possono sintetizzare molti potenzialmente preziosi substrati di M-DNA, probabilmente dovuta alla alta pressione selettiva contro l'uso di substrati non standard in vivo. Molti gruppi hanno sviluppato approcci evoluzione diretto per generare la polimerasi del DNA mutante capace di M-DNA sintesi1a,2,3,4,5; questi sforzi hanno ampliato l'utilità biotecnologica del DNA6,7,8.
Per valutare la capacità della polimerasi del DNA mutante di sintetizzare M-DNA, abbiamo9,10e gli altri11,12,13 in genere utilizzano misurazioni in vitro del DNA attività della polimerasi, che sono descritte in questo manoscritto. In questi esperimenti, la polimerasi del DNA sono co-incubate con un primer con etichettato/modello duplex e nucleosidi trifosfato substrati; i prodotti sono valutati mediante elettroforesi in gel. A seconda della specifica domanda sperimentale, polimerasi del DNA mutante, modificate gli iniettori, modelli modificati, o trifosfati del nucleoside modificato possono essere utilizzato, consentendo la valutazione biochimica sistematica dell'attività dell'enzima mutante.
Storicamente, questi saggi hanno fatto affidamento su un'etichetta radioattiva 5' per tenere traccia di sintesi del DNA; più comunemente, sono stati utilizzati 32P e 33P; tipicamente, etichettatura è realizzato utilizzando T4 polinucleotide chinasi11. Tuttavia, a causa della durata limitata nel tempo e il costo relativamente elevato di etichette radioattive e del loro smaltimento sicuro, il nostro gruppo utilizza invece un fluoroforo vicino infrarosso sintetico 5' DNA contrassegnato. Utilizzando un costo relativamente basso vicino infrarosso gel imager, abbiamo osservato i limiti di rilevazione simile ai precedenti studi utilizzando etichette radioattive (dati non pubblicati). Abbiamo riprodotto con successo passato osservazioni9, e non abbiamo osservato alcuna grande differenza quantitativa con costanti di tasso precedentemente misurato (dati non pubblicati).
Per analizzare la dimensione del DNA e quindi, nella misura della sintesi del DNA, ci basiamo su metodi di elettroforesi del gel di poliacrilammide sviluppati originariamente per di sequenziamento Sanger14 prima dell'avvento di elettroforesi capillare15. La distanza di separazione o di mobilità può essere utilizzata come una misura di peso molecolare; grande formato, i gel di poliacrilammide verticali può raggiungere la risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l'osservazione quantitativa di oligonucleotidi di DNA di lunghezza variabile.
Collettivamente, questi esperimenti sono un metodo affidabile per la caratterizzazione della polimerasi. A causa del tempo natura sensibile delle reazioni, la preparazione e la cura è necessaria per ottenere risultati riproducibili. Ulteriormente, mentre il gel dell'acrilamide è un modo molto efficace per misurare la sintesi del DNA, così come numerose altre reazioni modificazione di DNA, con risoluzione di singolo nucleotide, può essere tecnicamente difficile. Il protocollo qui speriamo che consentirà agli utenti di eseguire questi esperimenti, evitando gli errori più comuni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylated BSA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>PR-R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (i.e. DTT)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC42374-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O3756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-701-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-dNTPs (riboNTPs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-001-341 (343, 345, 347)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-dNTPs (all other modified NTPs)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>assorted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer 1</td>
			<td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td>
			<td>Custom Syntheses</td>
			<td>We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5&#8217;-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>template 1</td>
			<td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td>
			<td>Custom Syntheses</td>
			<td>We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5&#8217;-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11405</td>
			<td>38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Borate/EDTA (TBE) solid</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T22020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea ultrapure</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>U20200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel tape</td>
			<td>CBS Scientific</td>
			<td>GT-72-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large white spring clamp polypropylene</td>
			<td>CBS Scientific</td>
			<td>GPC-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP15020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm spacers</td>
			<td>CBS Scientific</td>
			<td>SGS-20-0740A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33x42 Notched Glass Plate Set</td>
			<td>CBS Scientific</td>
			<td>SGP33-040A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wedge plate separator</td>
			<td>CBS Scientific</td>
			<td>WPS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comb for gel electrophoresis</td>
			<td>CBS Scientific</td>
			<td>SG33-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis rig</td>
			<td>CBS Scientific</td>
			<td>SG-400-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we use a Milli-Q system from Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerases</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we prepare these in our laboratory using published protocols.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna polymerase activity assay using near-infrared fluorescent labeled dna visualized by acrylamide gel electrophoresis

Per qualsiasi enzima, robusti, quantitativi metodi sono necessari per la caratterizzazione degli enzimi sia nativi che derivati dal. Per le polimerasi del DNA, sintesi del DNA possono essere caratterizzato usando un in vitro del DNA sintesi analisi seguito da elettroforesi in gel di poliacrilammide. L'obiettivo di questo test è quello di quantificare la sintesi di DNA naturale e di DNA modificato (M-DNA). Questi approcci sono particolarmente utili per la risoluzione dei oligonucleotides con risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l'osservazione delle singole fasi durante la sintesi del oligonucleotide enzimatica. Questi metodi sono stati applicati per la valutazione di una matrice di proprietà biochimiche e biofisiche quali la misurazione delle costanti di tasso costante di singoli passaggi della sintesi del DNA, il tasso di errore della sintesi del DNA e affinità di legame del DNA. Utilizzando componenti tra cui, ma non limitatamente a, i trifosfati del nucleoside modificato (NTP), M-DNA, e/o mutante polimerasi del DNA, il relativo programma di utilità di substrato-DNA polimerasi coppie possono essere efficacemente valutate modificati. Qui, abbiamo dettaglio il dosaggio stesso, comprese le modifiche che devono essere fatte per ospitare contrassegno strategie quali DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso del DNA primer non tradizionali. Inoltre, abbiamo dettagliate passi fondamentali tecnici per colata di gel di acrilammide e in esecuzione, che spesso può essere tecnicamente impegnativo.

Un'analisi di successo del gel di poliacrilammide di una caratterizzazione qualitativa della attività complessiva (descritto nella sezione 2.1, Figura 1) e della cinetica allo stato stazionario (descritto nella nota in conclusione del punto 2.1, Figura 2) sono mostrati. Un'analisi di infruttuoso del gel di poliacrilammide è anche mostrata (Figura 3).
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis at JoVE.com

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

Questo protocollo descrive la caratterizzazione della sintesi di DNA polimerasi di DNA modificato attraverso l'osservazione dei cambiamenti al DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso mediante elettroforesi su gel e gel di imaging. Gel di acrilammide sono usati per l'imaging ad alta risoluzione della separazione degli acidi nucleici breve, che migrano a velocità diverse a seconda delle dimensioni.

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Ricerca

Biochimica

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Monitoraggio in tempo reale della separazione del frammento di DNA tramite smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...