Name: microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing at JoVE.com

Это исследование финансировалось USDA-НИФА награду 2015-67015-23488 Роджер конуса. Авторы благодарят Доктор Рональд Phelps для описания критериев выводок фондовый отбора в видео. Ахмед Elaswad и Карима Халиля хотел бы поблагодарить египетские культурные и образовательные бюро в Вашингтон Округ Колумбия, для финансирования их кандидат исследований.

Этот эксперимент был проведен на рыбу генетики исследовательское подразделение, E. W. оболочки рыболовству научно-исследовательский центр, Университет Оберн, Алабама. Все экспериментальные протоколы, используемые в этом эксперименте были утверждены Auburn университета институциональны?...

Был представлен подробный протокол для микроинъекции канального сома эмбрионов для достижения Нокаут гена. Инъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в желток намного проще, экономит время и не требует обучения по сравнению с microinjecting blastodisc один клеток эмбриона, который является самым распростране?...

Микроинъекции является общей лаборатории метод, используемый для доставки небольшое количество вещества, такие как ДНК, РНК, белков и других макромолекул в клетки или эмбрионов через капиллярные стеклянные1. Микроинъекции осуществляется с помощью установки специального оборудования, включая microinjector, микроманипулятор и Микроскоп2. Этот метод был использован исследователями генетически изменить многих организмов через поколение мутация гена нокауты и генной терапии, с целью понимания динамики внутриклеточных компонентов3,4 , 5.
Канальный сомик (сомик punctatus) является наиболее популярных видов сома в аквакультуре и любительского рыболовства в Соединенных Штатах. Существует возрастает необходимость изучения функциональной геномики в канального сома, и секвенирования генома полный канал Сома повышает полезность последних достижений в геноме редактирования инструменты6,7. Понимание функции гена не только обогатит исследований, которые проводятся на сома, но также может привести к более эффективные программы улучшения генетических качеств для расширения индустрии сом. После выявления критических генов для данного признака интерес, они могут использоваться для генетически улучшения производства сом посредством изменения генома для создания полезных аллелей, выбор для этих аллелей, пресечению пагубных аллелей, передача благотворное аллели через трансгенез, или некоторая комбинация этих вариантов. Объединяя лучшие гены для различных коммерчески выгодные черты из различных видов в одной рыбы позволит значительно повысить производительность и рентабельность операций производства рыбы8.
Нокаут гена является прямой метод для изучения функций генов в естественных условиях. Мутации на уровне ДНК будет наследоваться будущих поколений, которые будут способствовать изучению их последствий в разных поколений. Инструменты редактирования разных генома были развитые включая цинковый палец nucleases (ZFNs), транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9 ) системы9,10,,1112.
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система является мощный и эффективный инструмент, используемый для редактирования геномных последовательностей ДНК, включая Нокаут гена в рыбы через РНК руководствуясь участкам ДНК расщепления5,13. Система состоит из руководство РНК (gRNA), который определяет целевой последовательности генома и ДНК эндонуклеазы фермента, Cas9. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система может быть сконструирована для любой последовательности генома с рядом преимуществ перед ZFNs и Таленс: (1) ниже стоимости (2) легче инженерных (3) более конкретной привязки руководство РНК последовательности целевых объектов и снижение пробить мутации (4) несколько последовательностей могут быть направлены с различными gRNA такими же темпами время (5) высокая мутагенеза в генах, которые могут не быть мутировал Таленс и (6) скорость передачи улучшение герминальных мутаций для до шестикратно по сравнению с ZFNs и Таленс14, 15,16,17,18.
Основные альтернативный метод для микроинъекции – электропорация, в котором применяются электрические импульсы эмбрионов или ячейки для увеличения проницаемости мембран и освоения биологических молекул19,20. Несколько трансгенных рыбы были созданы с помощью электропорации оризии (Oryzias latipes), данио рерио (Danio рерио), чавычи (Oncorhynchus tshawytscha), канального сома, морской лещ (Sparus Сарбой), и Общие Карп (Cyprinus Карпио)21,,2223,24,25,26.
Электропорация был использован для доставки плазмида ДНК, РНК и Cas9 белка для Нокаут гена. В mammalian клетках, Cas9/gRNA плазмидной ДНК, Cas9 мРНК/gRNA и Cas9 белка/gRNA комплексы были доставлены с помощью электропорации и мутагенез ставки были высокими, используя Cas9 белка/gRNA комплексы для большинства условий испытания электропорации27. В асцидии Хордовые (Ciona интестиналис) electroporated в оплодотворенных яиц побудить нокаут нескольких генов28. выражая конструкции Таленс ZFNs, выражая плазмидные конструкции были electroporated выбить лютеинизирующего гормона в Канальный сомик29. Однако, после того, как введены в ячейку, плазмидные конструкции нужно будет быть транскрибируется в РНК и переведено на функциональных белков, прежде чем они могут быть нацелены нужный последовательности ДНК, который вероятно задержит время мутагенеза, по сравнению с микроинъекции РНК / белка. Как развивается эмбрион, задержка мутагенеза увеличивает мозаичностью вводят учредителей. Кроме того трансгенных выражение маловероятно для достижения уровня выражения с микроинъекции, снижение эффективности мутагенеза.
Как средства для внедрения инструментов редактирования генома в клетки микроинъекции имеет ряд преимуществ над электропорации. Геном редактирования молекул можно надежно вводят в клетки или эмбрионов путем микроинъекции30. Требуется меньше материала инъекций. Это легко определить количество материала вводили. Выше мутации, ставки с низкой мозаичностью основатель рыб может быть достигнуто, который позволит улучшить передачу герминальных мутаций F1. Меньше основатель рыбы должны быть проанализированы для производства первого поколения, благодаря более высокой скорости мутации. В электропорация больше основатель рыбы должны быть проанализированы которые увеличат расходы. Однако выживаемости эмбрионов канального сома microinjected меньше чем electroporated, хотя это может быть преодолено путем инъекций больше эмбрионов31,32. Канальный сомик, выживаемости эмбрионов желток microinjected, варьировались от 16 до 55%, в зависимости от гены мишенью и дозировка gRNA/Cas9 белок32.
Регулярное микроинъекции Сома эмбрионов является технически сложным и много времени, однако, быстрое и эффективное ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка микроинъекции протокол представляется для канального сома эмбрионов. Этот протокол требует меньше времени и опыта, поскольку вводят раствор белка ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в желток одного клеток эмбрионов. Сотни оплодотворенных яиц может быть введен в 1 h (примерно время, необходимое для первого деления клеток происходят). Чтобы проверить протокол, два заболевания связанные с восприимчивость гены были выбиты в канального сома, платных/интерлейкина 1 домена содержащих адаптер молекулы (TICAM1) ген рецептора и рамноза привязки Лектин (RBL) ген. TICAM 1 участвует в сигнальный путь, начатый Толл подобный рецептор (TLR) 3. В канального сома TICAM 1 была резко upregulated после бактериальной вызов с Edwardsiella ictaluri, в то время как он был downregulated в blue сома, видов, устойчивых к э. ictaluri33. RBL играет важную роль в ранней инфекции с флавобактерии Колончатая, возбудителя болезни columnaris, где острые и надежные upregulation был записан в columnaris чувствительными канального сома штамма, по сравнению с 34columnaris резистентными штаммами.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

Полный геном канального сома, сомик punctatus, была последовательной, приводит к более широкие возможности для изучения функции гена канального сома. Нокаут гена был использован для изучения функции этих генов в естественных условиях. Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система представляет собой мощный инструмент, используемый для редактирования геномных последовательностей ДНК изменить функции гена. В то время как традиционный подход был ввести ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мРНК в одну ячейку эмбрионов путем микроинъекции, это может быть медленным и неэффективным процессом в Сома. Здесь описан подробный протокол для микроинъекции канального сома эмбрионов с ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка. Вкратце яйца и спермы были собраны и затем искусственное оплодотворение выполняется. Оплодотворенные яйца были переведены в чашку Петри, содержащие Holtfreter в раствор. Объем впрыска был откалиброван и затем руководство РНК/Cas9 ориентация которую платных/интерлейкина 1 рецептора домена содержащих адаптер молекулы (TICAM 1) гена и рамноза привязки Лектин (RBL) гена были microinjected в желток одного клеток эмбрионов. Нокаут гена был успешным, как indels были подтверждены секвенирования ДНК. Изменения последовательности предсказал белка из-за эти мутации включены фреймшифт и усечение белка из-за преждевременной остановки кодонов.

Чтобы продемонстрировать эффективность микроинъекции протокола, были microinjected оформления, предназначенных для целевой канал Сома платных/интерлейкина 1 домена содержащих адаптер молекулы (TICAM1) ген рецептора и рамноза привязки Лектин (RBL) ген.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing at JoVE.com

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Простой и эффективный микроинъекции протокол для гена редактирования в Канальный сомик эмбрионов, с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 представлен. В этом протоколе, руководство РНК и белка Cas9 были microinjected в желток одного клеток эмбрионов. Этот протокол был утвержден путем стучать вне двух Канальный сомик иммунной связанных генов.

Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 protein into channel catfish, Ictalurus punctatus embryos for gene editing. The development of a reliable and efficient protocol for targeted gene editing in channel catfish, is crucial to studying functional genomics. Especially after the genomic resources have been enriched by the sequencing of the channel catfish genome.Here we present a detailed protocol for CRISPR/Cas9 genome editing in channel catfish. This protocol has been developed and validated by targeting two channel catfish immune related genes. The Toll/interleukin-1 receptor domain containing adapter molecule, or TICAM1 gene, and the rhamnose-binding lectin or RBL gene.All of the procedures were performed at the fish genetics research unit of the EW Shell Fisheries Research Center at Auburn University in Alabama. Brood stock selection and spawning. Choose healthy channel catfish brood stock from a strain or genetic line that you would like to edit.Channel catfish males and females should exhibit good secondary sex characteristics. Select males that have broad muscular head that is wider than the rest of their body with a well developed genital papilla. Dark color and scarring wounds from territorial fighting are also signs of sexual readiness.Select females that have heads that are narrower than the rest of their bodies and have a soft palpable well-rounded abdomen. For accuracy and to avoid stressing the fish during initial handling, stop feeding females two to three days before examining their readiness for spawning. Fish handling should be done quickly but carefully to reduce handling stress.All procedures that require handling of the females should be done while fish are held in spawning bags. Just before hormone injection, obtain the body weight of the females. Spawning bags with females inside can then be hung in a flowthrough tank with continuous water flow and adequate aeration.Aseptically load the implanter that has a 14 gauge needle with 85 micrograms per kilogram of luteinizing hormone releasing hormone analog.LHRHA. Rinse the injection site and the dorsal musculature with 0.9%sterile saline solution before the injection. Insert the implanter at a 45 degree angle and release the implant.Withdraw the needle and wipe the injection site with a cotton previously soaked in 70%ethanol. Place the spawning bag in the holding tank so the fish is completely submerged in water 15 to 20 centimeters below the water surface. Adequate aeration including five or more parts per million of dissolved oxygen, good water quality are important for ovulation of high quality eggs.Predict the ovulation time based on water temperature using the degree hour relationship. Usually the first check for eggs is done at about 36 hours after hormone injection and then at four hour intervals. To check for ovulation gently lift the spawning bag above the water surface while you're looking for the eggs that are attached to the inside of the bag.When you see eggs at least 10 or so this female is ovulating and ready for hand stripping. Sperm preparation. Sperm can be prepared a few hours before the expected ovulation time.The male fish are euthanized and the testes are collected in a small weighing pan. Determine the weight of the testes. Remove any tissue and wash the testes with a 0.9%saline to remove blood if necessary.Well developed testes are white with many villiform projections. Crush the testes and filter the sperm using a 100 micron mesh. Use 0.9%saline solution to wash the sperm from the mesh into a 50 milliliter tube.Saline solution can be added up to 10 milliliters per gram of testes. Determine the concentration of the sperm. Check the motility and viability.However, for these procedures this is not necessary if the testes are well developed. Sperm can then be stored at four degree C and should be used within 24 hours after preparation. Egg collection and fertilization.Apply a very thin layer of vegetable shortening to a 20 centimeter diameter clean dry spawning pan. Place the female in an anesthetic solution containing 100 parts per million of buffered tricaine methanesulfonate with sodium bicarbonate until the fish is completely anesthetized. Carefully remove the fish from the spawning bag and dip it in 0.9%saline to wash off the anesthetic.Dry the fish off completely using a clean towel avoiding removal of the mucus layer on the fish body surface. Apply vegetable shortening to the area around the vent including the pelvic fins to present attachment of the eggs during hand stripping. Hand strip the eggs into the greased spawning pan by applying gentle pressure to the ovaries.Good eggs should flow freely, be golden yellow in color and have minimal or no clumps or blood clots. Avoid contact between the eggs and the water before fertilization as water can stimualte the micropyle closure. To fertilize the eggs for micro injection, transfer to 200-300 eggs to greased spawning pan.Add one to two milliliters of the sperm solution to the eggs and mix gently. Add fresh water to the eggs to activate the sperm and eggs. Enough water should be added to slightly cover the eggs.Gently swirl the eggs for 30 seconds. Fertilization should occur in one to two minutes. It's important to fertilize the eggs in a single layer.Catfish eggs adhere to each other making it difficult to micro inject multiple layers of embryos. Add more fresh water to the fertilized eggs and allow the eggs to harden for 10 to 15 minutes. The remaining unfertilized eggs can be covered by wet towel to prevent drying and can be fertilized over a few hours.Fertilization can be done in a staggered manner. One batch of two to 300 eggs can be fertilized every 30 to 60 minutes to ensure the continuous supply of embryos at the one Cell stage for the micro injection and control non-injected embryos. Needle pulling and loading.Pull a one millimeter OD borosilicate glass capillary into two needles. Store the needles in a paper box with a piece of sponge in which several incisions have been made. To avoid breaking the needle, the diameter of the sponge should be smaller than the length of the needle stem.The needle tip can then be opened by breaking a small piece of the needle in the finest region using a sharp object. Alternatively the needle can be opened by pinching off the thinnest region of the tip with a pair of forceps under the microscope. Prepare the injection solution by mixing guide RNAs with Cas9 protein.Phenol red can be added to color the guide RNA Cas9 protein mix, with phenol red constituting up to one third of the total volume. The mixture is then incubated for 10 minutes on ice before use. With a micro loader, load 5-10 microliters of the guide RNA Cas9 mixture into the injection needle.By inserting the micro loader into the needle stem and expelling the mixture slowly while retracting the micro loader tip. Avoid trapping air bubbles inside. Attach the needle to the micro pipette holder and ensure tight connection.And then attach the holder to the micro manipulator. Ensure free and stable movement. Apply pressure for micro injection by opening the nitrogen cylinder and adjusting the pressure regulator.The volume of injection can be affected by the pressure, the diameter of the needle aperture and the duration of the injection. To determine the volume you wish to inject, inject into a drop of mineral oil placed on a hemocytometer. If needed, the pressure and the needle diameter can be adjusted to increase or decrease the volume of the injection.Inject multiple times in the mineral oil to ensure consistent volume. Micro injection of catfish embryos. Apply a very thin layer of vegetable shortening to 100 millimeter clean Petri dish.Transfer 50 to 100 eggs from the fertilization pan to the Petri dish and cover them with Holtfreter's solution. The eggs should be aligned against each other in a single layer. This alignment should hold the eggs in place during the micro injection process.Place the Petri dish with the eggs on the stage of the microscope and hold it with one hand. Lower the needle with the other hand until it pierces the chorion and yolk in a single smooth movement. The tip of the needle should be as close as possible to the blastodisc before delivering the injection material.Depress the pedal and deliver the injection material into the yolk. If the blastodisc is not clearly visible, then the injection material can be spread into different locations throughout the yolk. To do that, the needle is inserted to the far end of the yolk.Then depress the pedal and withdraw the needle simultaneously. This spreads the injection material at different locations throughout the yolk. 50 nanoliters containing 2.5 nanograms of guide RNA and 7.5 nanograms of Cas9 protein can be injected into the yolk without any problems.Retract the needle smoothly as to not damage the egg. Then move the Petri dish to inject another egg with the same procedure. Avoid movement of the Petri dish during the injection process as this may damage the egg or break the needle.Remove the eggs that are ruptured or damaged due to micro injection. Injection can be started 15 to 20 minutes after fertilization, and continue as long as the embryos are still in the one cell stage. Injected embryos are placed back in Holtfreter's solution with 10 PPM of doxycycline and continuous aeration for six to seven days until hatch.The solution is changed daily and dead embryos are removed.Results. This figure shows the CRISPR/Cas9 induced mutations in the TICAM1 gene of channel catfish. The blue sequence represents the protospacer adjacent motif or PAM, while the green sequence represents the target for the guided RNA.A double strand break induced by Cas9 protein was expected to occur at the site of the two red triangles. Deletion mutations are represented by a dash line, in which each dash corresponds to a nucleotide that has been deleted. Red sequences are insertions while purple represents substitution mutation.Fractions of 78 represent the number of mutated alleles in 78 sequencing reactions. For example, 3/78 means an allele was detected in three sequencing reactions from a total of 78 reactions. The mutation rate was 79.2%in 24 individuals analyzed.Mutations resulted in removal of a few too many amino acids from the protein, changing the downstream reading frame and premature termination of translation. In most mutations, more than 80%of TICAM1 predicted protein sequence was truncated due to premature stop codon. This figure shows CRISPR/Cas9 induced mutations in the RBL gene of channel catfish.Exonic sequences are upper case while intronic sequences are lower case letters. Blue sequences represent the protospacer adjacent motif while the green sequence represents the target for guided RNA. A double strand break induced by Cas9 protein was expected to occur at the site of the two red triangles.Deletion mutations are represented by a dash line in which each dash corresponds to a nucleotide that has been deleted. Red sequences are insertions. Fractions of 40 represent the number of mutated alleles in 40 sequencing reactions.For example, 2/40 means that an allele was detected in two sequencing reactions from a total of 40 reactions. The mutation rate was 87.5%in 40 individuals analyzed. Deletions range from five base pairs to 183 base pairs while up to 20 base pairs were inserted.More than 70%of indels resulted in truncated protein that was 10%or less than the length of the wild type protein. In this video, we demonstrated how to micro inject CRISPR/Cas9 protein into one cell channel catfish embryos. The procedures described are simple, rapid, and efficient.And successfully achieved gene knockout in two channel catfish genes. TICAM1 and RBL. Depending on what is being injected, the protocol can be modified to include other biologically active substances.It can also be modified to micro inject other catfish species or other fish species that have similar egg structure and composition.

Research

JoVE Journal

Genetics

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping и CRISPR / Cas9 для определения гена резистентности к лекарственным средствам в<em&gt; Токсоплазма гондии</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования чтобы сделать условное мутантов из человека малярийного паразита P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Представляя ген нокаут непосредственно в Amastigote Этап trypanosoma cruzi Использование CRISPR / Cas9 системы

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Опосредованное редактирование генома в filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

В Vivo CRISPR/Cas9 Скрининг для одновременной оценки функции гена в коже мыши и полости рта

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...