Name: generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00
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Los autores desean reconocer Marc Ferrer en el centro nacional para el avance de Ciencias traslacionales, institutos nacionales de salud por su apoyo y orientación sobre el desarrollo inicial de estos ensayos. Además, nos gustaría agradecer a Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling y Vesselina Cooke por sus contribuciones científicas y discusión como miembros del equipo del proyecto.

1. cultivo de esferoides de Tumor bien 1536 3D
<ol><li>Preparar un tallo mediano fresco 3D tumor esferoide (medio celular + recambio de nocaut suero insulina-transferrina-selenio) mediante la adición de los reactivos siguientes a 500 mL de medio de águilas modificado de Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL de humanos factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL de humano factor de crecimiento epidérmico (EGF), 0.4% albúmina de suero bovino (BSA) (fracción V), 1 x insulina-...

<ol>
	<li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor.">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice.">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Registered+report:+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976 (2016).</li><li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells.">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267 (2010).</li><li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer.">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li><li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells.">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li><li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells.">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li><li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells.">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells.">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li><li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells.">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents.">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li></ol>

Los métodos presentados aquí demuestran un protocolo detallado en cómo producir esferoides tumorales en placas 1536 pocillos para proyecciones a gran escala de compuestos. Estos métodos fueron inicialmente adaptados del trabajo del Instituto Nacional del cáncer donde esferoides tumorales fueron cultivadas en los ensayos de rendimiento bajo en placas bien 6 y 96 pocillos para hacer preguntas sobre las dependencias genéticas y sensibilidad compuesto13, 14 <su...

En la última década, cada vez más estudios han implementado el uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceptos que no son completamente recapitulados por cultivo de células en 2D en el plástico. Ejemplos de estos conceptos incluyen las alteraciones en células epiteliales normales polaridad1 donde la orientación espacial de las capas basals y apicales de las células se pierden, así como el papel de la matriz extracelular en la regulación de la supervivencia y el destino celular. Investigación oncológica, en particular, ha utilizado modelos 3D para entender la biología básica de las células cancerosas y las diferencias entre 2D y 3D de la célula cultura sistemas3,4. El desarrollo de técnicas más sofisticadas de la cultura de célula y su posterior adaptación a formatos múltiples bien ha permitido la búsqueda de nuevos fármacos en entornos 3D. En contraste con las células cultivadas bajo condiciones de 2D, modelos en 3D de la gama de tumores en la complejidad de sistemas celulares5 esferas solo tipo de células de diferentes tamaños, esferas de celdas de tipo complejo6,7, 8. el descubrimiento de nuevos compuestos o productos biológicos que potentemente inducen muerte celular en estos sistemas de modelo 3D es, por tanto, de gran interés en las campañas de desarrollo de drogas. Puntos finales de estos ensayos son a menudo idénticos a los realizados en culturas 2D para evaluar los cambios en la proliferación celular, pero cuando llevó a cabo en un entorno más fisiológicamente relevante, puede revelar el verdadero nivel de dependencia de la gene de la blanco o vía interrogado.
Como anteriormente, se han desarrollado una variedad de sistemas modelo para estudiar las respuestas de la droga en los sistemas de cultivo 3D, pero la mayoría utiliza o placas de microtitulación de 96 o 384 pocillos y no es fácilmente adaptable a los formatos de high-throughput screening (HTS) de uso frecuente en campañas de proyección de descubrimiento de drogas. Tales sistemas incluyen el uso de colgantes tecnologías de gotita, culturas del esferoide, pulsátil de las células con partículas magnéticas para inducir la levitación y las culturas incorpora geles naturales o sintéticos tales como colágeno, Matrigel o polietilenglicol (PEG)2 . Aquí, presentamos los métodos detallados de una técnica previamente desarrollado para producir cultivos 3D esferoide de líneas celulares de cáncer establecido en un formato de placa de la pozo 1536. En este protocolo, se utiliza un medio altamente definido que evita que el accesorio de celular normalmente adherente líneas9. Este sistema tiene limitaciones (es decir, no puede recapitular completamente un sistema modelo complejo de cáncer), pero sin embargo, estos ensayos permiten una proyección de alto rendimiento de grandes colecciones de moléculas pequeñas y transversales comparaciones de la respuesta de la droga entre las culturas 2D y 3D contra una variedad de líneas de células y compuestos.
Las líneas celulares seleccionaron para demostrar los métodos en este artículo todo Puerto mutaciones en genes relacionados con la vía, un camino que es muy desequilibrada en el cáncer, de señalización de MAPK y de que muchos tratamientos están disponibles. Muchas de las líneas tienen activación oncogénicas mutaciones en el virus del Sarcoma de rata Kirsten también denominado KRAS, el RAS de Neuroblastoma o ANR, oncogene del virus del Sarcoma de Harvey rata o HRAS y las quinasas asociadas rápidamente acelerado Fibrosarcomas, también conocido como RAFs. La literatura reciente sugiere que los inhibidores de distintos nodos de esta vía son únicamente más eficaces en un subgrupo de las líneas celulares cuando se cultivan bajo condiciones 3D9,10. Un estudio encontró que cuando las células cancerosas con RAS activa fueron cultivadas en 3D, demostró una mayor sensibilidad a los inhibidores de la MAPK y además, que este enfoque podría identificar vías y dirigido inhibidores que podrían perderse en el tradicional 2D ajuste. El objetivo de este estudio es presentar los métodos utilizados para estas líneas celulares de la cultura, y además, para demostrar el diferencial de las respuestas a estos inhibidores que se pueden observar solamente cuando se usa 3D celular sistemas de cultivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-115Q</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Resuspend in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Resuspend in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>Resuspend in sterile PBS and filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% KnockOut (KO) Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Add fresh right before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7573</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Combi Cassette</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>24073295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Multiflow Cassette</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>294085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-well sterile TC plates (white)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-well sterile TC plates (black)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scivax Plates</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>NCP-LH384-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives seals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Incubator</td>
			<td>LiCONiC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Lids</td>
			<td>The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATS Acoustic Dispensor</td>
			<td>EDS Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo Acoustic Dispensor</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Envision-Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump- Multidrop Combi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Handler-Multiflow FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening

Las células cancerosas han sido cultivadas habitualmente en dos dimensiones (2D) en una superficie de plástico. Esta técnica, sin embargo, carece de un tumor verdadero medio ambiente masa está expuesta a en vivo. Tumores sólidos crecen no como una hoja de plástico, pero en su lugar como una colección de células clonales en una tridimensional (3D) espacio interactuando con sus vecinos y con distintas propiedades espaciales como la alteración de la polaridad celular normal. Estas interacciones provocan las células cultivadas 3D adquieren características morfológicas y celulares que son más relevantes para tumores en vivo . Además, un tumor masa está en contacto directo con otros tipos celulares como células stromal e inmunes, así como la matriz extracelular de todos los tipos de célula. La matriz depositada se compone de macromoléculas como colágeno y fibronectina.
En un intento por aumentar la traducción de resultados de la investigación en oncología de banco a cabecera, muchos grupos han comenzado a investigar el uso de sistemas de modelo 3D en sus estrategias de desarrollo de drogas. Estos sistemas son probablemente más fisiológico relevantes porque intentar recapitular el ambiente complejo y heterogéneo de un tumor. Estos sistemas, sin embargo, pueden ser bastante complejos y, aunque susceptibles de crecimiento en formatos de 96 pozos y algunos incluso en 384, ofrecen pocas opciones para el crecimiento a gran escala y proyección. Esto observado diferencia ha conducido al desarrollo de los métodos descritos aquí en detalle esferoides tumorales de cultura en una capacidad de alto rendimiento en placas 1536 pocillos. Estos métodos representan un compromiso para los sistemas basados en matriz muy complejos, que son difíciles de pantalla y los análisis 2D convencionales. Una variedad de líneas celulares de cáncer que diferentes mutaciones genéticas son correctamente evaluados, examinar eficacia compuesto mediante el uso de una biblioteca de comisariado de compuestos contra el camino del Kinase de proteína Mitogen-Activated o MAPK. Las respuestas de la cultura de esferoide entonces se compararon con la respuesta de las células cultivadas en 2D, y se divulgan actividades diferenciadas. Estos métodos proporcionan un protocolo único para las pruebas de actividad compuesto en un entorno 3D de alto rendimiento.

Una variedad de células de cáncer establecido líneas que crecen bien bajo condiciones de cultivo 2D se analizaron usando los métodos descritos aquí. Imágenes representativas de una variedad de cáncer mutante MAPK líneas celulares (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS y KNS-62:HRAS) se ven en la figura 1. Estas imágenes demuestran que aunque las líneas celulares tienen morfologías diferentes, cada uno formado estructuras 3D en las placas de e...

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Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

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Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

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Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

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A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

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High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

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