Name: imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

Wij danken Dr. U. Ashery voor de gulle gift van cDNA. Wij danken Drs. G. massa, L. Mittleman, M. Shaharbani en Y.Zilberstein van de Sackler mobiele & Molecular Imaging Center voor hun onschatbare hulp met microscopie. Dit werk werd gesteund door de Verenigde Staten-Israël binationale Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel en S.J.Galli) en het verlenen van 933/15 vanaf de Israël Science Foundation, opgericht door de Israël-Academie voor Wetenschappen (te R.Sagi-Eisenberg ) en NIH grants U19 AI 104209 en R01 AR067145 (naar S.J. Galli).

1. voorbereiding
<ol><li>Bereiding van de voedingsbodems RBL<ol>
<li>Mix 500 mL van lage glucose Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 56 mL foetale runderserum (FBS), 5,5 mL penicilline-streptomycine-nystatine oplossing, 5,5 mL van L-Glutamine 200 mM oplossing. Dit resulteert in lage glucose DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 µg/mL streptomycine, 100 eenheden/mL penicilline, 12 eenheden/mL nystatine en 2 mM L-glutamine.</li>
		<li>De media filteren met behulp van een top-vacuüm-filter van 0,22 µm poriegrootte en ...

Hier beschrijven we hoe traceren de fluorescentie van FITC-dextran in SGs geladen kan worden gebruikt om het speciaal samengestelde exocytose van gebeurtenissen. Dit werd bereikt door de Microscoop te verwerven van een afbeelding elke 15 seconden, aldus voor te zorgen dat alleen langdurige gebeurtenissen na verloop van tijd worden vastgelegd en dus met uitzondering van korte gebeurtenissen die zou overeenkomen met volledige exocytose of kus-en-run exocytose. Om vast te stellen van de methode, toonden we dat knockdown van...

Gereglementeerde exocytose is het primaire mechanisme waarmee gemakkelijk gemaakt lading wordt vrijgelaten uit een secretoire cel in antwoord op een specifieke trigger. De lading is pre gevormd en afgezonderd in secretoire blaasjes, waarin het is opgeslagen totdat een trigger Relais het signaal voor de vrijlating van de SGs inhoud. Verschillende soorten signalen kunnen resulteren in verschillende modi van gereglementeerde exocytose of verschillende modi van gereglementeerde exocytose tegelijkertijd kunnen optreden. Drie belangrijkste wijzen van gereglementeerde exocytose zijn bekend: volledige exocytose, waarbij volledige fusie van een enkele secretoire submodule met het plasmamembraan; kus-en-run exocytose, waarbij voorbijgaande fusie voor de secretoire granule met het plasma-membraan gevolgd door haar recycling; en samengestelde exocytose, die wordt gekenmerkt door homotypic fusie van verschillende SGs prior (dat wil zeggen, multigranular exocytose) of na elkaar (dat wil zeggen, sequentiële exocytose) tot fusie met het plasmamembraan1. Samengestelde exocytose wordt beschouwd als de meest uitgebreide modus van lading release2, omdat het zorgt voor de snelle afscheiding van vracht, met inbegrip van die van SGs die zich bevinden distale uit het plasma-membraan. Samengestelde exocytose is gedocumenteerd in beide exocrine en endocriene cellen3,4,5,6,7,8,9, evenals in immuuncellen. Samengestelde exocytose kunt immune cellen, zoals eosinofielen10,11,12 en neutrofielen13, de snelle en robuuste versie van bemiddelaars die nodig zijn voor het doden van invasie ziekteverwekkers zoals bacteriën of parasieten. Mastcellen (MCs) implementeren samengestelde exocytose voor de efficiënte introductie van vooraf opgeslagen inflammatoire mediatoren tijdens aangeboren immuunresponsen, anafylaxie en andere allergische reacties14,15,16 , 17. aangezien de verschillende modi van exocytose gelijktijdig18,19 treedt, is het een uitdaging onderscheid maken tussen hen in real-time of identificeren van hun respectieve fusion machineries, vandaar ophelderen geworden hun onderliggende mechanismen.
Hier presenteren we een methode, gebaseerd op de levende cel beeldvorming van cel geladen FITC-dextran, waarmee real-time tracking van exocytic evenementen en onderscheid te maken tussen hun verschillende modi. Onze werkwijze zorgt voor met name de exclusieve opvolging van samengestelde exocytose.
FITC-dextran is een geconjugeerde van de pH-gevoelige fluorophore FITC met de glucan polysaccharide dextran. Fluorescently geëtiketteerde dextrans hebben aangetoond dat de cel invoeren door micropinocytosis20,21 en macropinocytosis22,23. Naarmate endocytotische compartimenten in de lysosomen rijpen, is gebleken dat de FITC-dextran in het lysosoom met geen zichtbare aantasting accumuleert. Echter, aangezien FITC een zeer pH-gevoelige fluorophore24 is, en het lysosoom lumen zuur is, Lest FITC-dextran fluorescentie bij het bereiken van het lysosoom24. Dus, tot vaststelling van dextrans als lysosoom lading, samen met de gevoeligheid van de pH van FITC gericht, hebben de basis gelegd voor het gebruik van FITC-dextran in studies van lysosoom exocytose25,26,27 , 28 , 29.
In verschillende celtypen, met inbegrip van MCs, neutrofielen eosinofielen, cytotoxische T-cellen, melanosomes en anderen, de SGs lysosomale functies weergegeven en zijn geclassificeerd als lysosoom-gerelateerde organellen (LROs) of secretoire lysosomen30,31 . Aangezien LROs een zure luminal pH hebben, kan FITC-dextran worden gebruikt om te visualiseren van hun exocytose, als gevolg van hogere pH die is gekoppeld aan de exteriorization van de LROs. Inderdaad, FITC-dextran is gebruikt om te controleren van exocytose in MCs18,32,33. Bij deze methode is FITC-dextran toegevoegd aan de celcultuur, in beslag genomen door de cellen door Pinocytose en gesorteerd in de SGs. Aangezien er in de lysosomen, is FITC fluorescentie uitgeblust in de SGs wanneer zij binnen de cel. Echter bij SG fusion met het plasmamembraan en daaruit voortvloeiende blootstelling aan de externe omgeving herwint de FITC-dextran zijn fluorescentie als de SG pH stijgt, waardoor het eenvoudig volgen van exocytic evenementen door levende cel microscopie. Hier, we deze methode zodat unieke tracking van samengestelde exocytose aangepast.
Twee andere methoden hebben eerder is gebruikt voor het bijhouden van samengestelde exocytose. Elektronenmicroscopie was de eerste methode te karakteriseren exocytic structuren die het vóórkomen van de verschillende vervoerswijzen exocytose voorgesteld. Met name gaf opmerkingen van "secretoire tunnels" in de alvleesklier acinaire cellen34 en MCs35,36,,37 aanleiding tot de hypothese van samengestelde exocytose. Maar terwijl de hoge resolutie van elektronenmicroscopie bevoegd is om te onthullen gesmolten blaasjes, kan de dynamiek van hun fusie niet bijhouden en dus geen definiëren of ze overeenkomen met SG fusion tijdens samengestelde exocytose of fusie van heroverde korrels na hun endocytose. Dit obstakel overwonnen in andere methoden die exocytose in levende cellen, zoals patch klem metingen van het plasmamembraan capaciteit11,13,38,39 of amperometry meten kunnen 40 van de media. Echter patch klemmen vereist een speciale set-up en mogelijk niet geschikt voor alle celtypes. Amperometry metingen kunnen bijhouden van exocytose alleen als de lading in zeer dicht bij de elektrode wordt vrijgegeven. Dus, met behulp van levende cellen imaging biedt een voordeel ten opzichte van deze methoden, zoals het niet alleen voor real-time tracking van exocytose staat, maar het biedt ook snelle en eenvoudige overname van gegevens uit de hele cel.
Het volgen van FITC-dextran door levende cel microscopie biedt ook enkele voordelen naar andere levende cel imaging gebaseerde methoden. Bijvoorbeeld, is een veel gebruikte methode totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) van cellen met een fluorescente sonde SG geladen of uiting van een fluorescente proteïne-gelabeld SG vracht of membraan eiwit26,41, 42 , 43. de kracht van deze methode ligt in zijn vermogen om uitsluitend gebeurtenissen die zich voordoen vlak bij het plasma-membraan (hierna te noemen voetafdruk), te controleren dus exocytic gebeurtenissen. Dit is echter ook het nadeel van deze methode omdat slechts in het geval van de cel-fractie dat grenst aan het dekglaasje en dicht bij de lens Microscoop kan worden beeld44. Of dergelijke voetafdrukken inderdaad het gehele celmembraan oppervlak vertegenwoordigen is nog betwistbaar45,46,47. In dit verband kunt met behulp van een pH-gevoelige kleurstof zoals FITC-dextran en een standaard fluorescentie Microscoop of een confocal microscoop met een open pinhole beeldvorming van de hele cel, dus het vastleggen van de totale exocytic-gebeurtenissen die in die cel plaatsvinden.
Extra pH-gevoelige verslaggevers die worden gebruikt voor het bestuderen van gereglementeerde exocytose door hele cel beeldbewerkings- of TIRFM bevatten SG vracht of SG membraan eiwit gesmolten tot phlourin, een pH-gevoelige GFP variant. Voorbeelden zijn NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, en synapto-phluorin48,49,50,51,52. Terwijl uitdrukking van deze sondes de endogene samenstelling van de SGs nauwer vertegenwoordigen kan, het impliceert transfectie van de cellen, en kan dus minder geschikt voor cellen die moeilijk te transfect. Daarom, wanneer bestuderen van cellen die zijn moeilijk te transfect of onder experimentele omstandigheden waarvoor meerdere genomic manipulaties, is het gebruik van een stof die eenvoudig kan worden aangevuld in het kweekmedium cel, zoals FITC-dextran, voordelig . FITC-dextran biedt ook een voordeel ten opzichte van acridine oranje (AO), een andere pH-gevoelige kleurstof die is gebruikt voor het volgen van exocytose door levende cel microscopie53,54,55,56 , 57 , 58. AO is gebleken voor het opwekken van fotolyse van blaasjes dat resultaat in valse flitsen, die niet met werkelijke secretie overeen komen27verwerkt. Daarentegen weerspiegelt de FITC-dextran beter secretie evenementen, waarschijnlijk als gevolg van zijn lage foto-geïnduceerde productie van reactieve zuurstof27.
Met name is een alternatieve benadering voor het bestuderen van exocytose door het bijhouden van de instroom van een kleurstof, uit het externe medium in de SG via de porie van fusie dat wordt tijdens dit proces wordt geopend. In dit geval wordt de kleurstof toegevoegd aan het externe medium naast de secretoire trigger. Vervolgens, wanneer de fusie porie opent, de kleurstof diffundeert in de SG59,60. Een duidelijk voordeel van deze methode is dat het biedt ook de mogelijkheid om het inschatten van de fusion porie maat, door het gebruik van kleurstoffen van variabele grootte. Bijvoorbeeld, kunnen dextrans met verschillende molecuulgewicht (MW), geconjugeerd met verschillende fluorophores, worden gebruikt als extracellulaire kleurstoffen waarbij de maximale grootte van Dextraan die de SG doordringen kan zou overeenkomen met de grootte van de fusion porie59, 61 , 62 , 63 , 64. Bovendien deze aanpak vereist niet het gebruik van een pH-gevoelige sonde. Een aanzienlijk nadeel is echter dat de signaal / ruisverhouding zeer laag is, is aangezien een grote hoeveelheid kleurstof aanwezig in de media tijdens de overname van beelden, wat resulteert in hoge achtergrond.
Globaal, het gebruik van FITC-dextran als een marker voor exocytose overwint verschillende nadelen in reeds gerapporteerde methoden, zoals de signaal-ruis verhouding, toxiciteit, dynamische tracering en complexiteit.
Hier beschrijven we het gebruik van FITC-dextran samengestelde exocytose in de RBL - 2H 3 mestcel lijn (hierna te noemen RBL, voornamelijk opgericht door Eccleston et al. volgen 65 en verder door Barsumian et al. gekloond 66), in reactie op immunoglobuline (IgE) / antigeen (Ag) activering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep-nystatin solution</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution&#160;</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran 150K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46946-500MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution B</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top-vacuum filter of 0.22 &#181;m pore size&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 &#181;m pore size</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered coverglass&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNP-HSA (Ag)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661&#160;</td>
			<td>Avoid direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer 1M, pH 7.4</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>BDH Laboratories</td>
			<td>284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>MERK</td>
			<td>1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES dipotassium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108321-27-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>MERK</td>
			<td>6346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>105833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator&#160;</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td>
			<td>Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td>
			<td>Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td>Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBL-2H3 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis

Gereglementeerde exocytose is een proces dat door die lading, die is opgeslagen in secretoire korrels (SGs), is uitgebracht in reactie op een secretoire trigger. Gereglementeerde exocytose is van fundamenteel belang voor de intercellulaire communicatie en is een belangrijk mechanisme voor de secretie van neurotransmitters, hormonen, inflammatoire mediatoren en andere verbindingen, door een aantal cellen. Ten minste drie verschillende mechanismen staan bekend om gereglementeerde exocytose: volledige exocytose, waar een enkele SG volledig met het plasma-membraan, kus-en-run exocytose versmelt, waar een enkele SG Transient met het plasma-membraan combineert, en samengestelde exocytose, waar verschillende SGs zekering met elkaar, vóór of na SG fusion met het plasma-membraan. Het soort gereglementeerde exocytose ondernomen door een cel wordt vaak bepaald door het soort secretoire trigger. Echter in veel cellen, kunt één secretoire trigger activeren meerdere modi van gereglementeerde exocytose gelijktijdig. Ondanks hun overvloed en belang in de celtypen en soorten zijn de mechanismen die bepalend zijn voor de verschillende vervoerstakken secretie grotendeels onbekend. Een van de belangrijkste uitdagingen bij het onderzoeken van de verschillende modi van gereglementeerde exocytose, is het moeilijk onderscheid te maken tussen hen, evenals het verkennen van hen afzonderlijk. Hier beschrijven we het gebruik van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran als exocytose verslaggever en levende cel imaging, om te differentiëren tussen de verschillende trajecten van gereglementeerde exocytose, gericht op samengestelde exocytose, op basis van de robuustheid en duur van de exocytic gebeurtenissen.

Figuur 1a vertegenwoordigt schematisch hoe FITC-dextran kan fungeren als een verslaggever voor geregeld exocytose en herhalen van de verschillende modi van exocytic gebeurtenissen. Ten eerste, de cellen worden geïncubeerd met FITC-dextran, die door Pinocytose geïnternaliseerd en gesorteerd naar de SGs. Aangezien de SGs van MCs LROs, hun lage pH dempt de fluorescentie van FITC, hier weergegeven als zwarte korrels (A-C, ik). Wanneer cellen worden getriggerd d...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Hier detail we een methode om levende cellen beeldvorming van gereglementeerde exocytose. Deze methode maakt gebruik van FITC-dextran, die hoopt zich op in lysosoom-gerelateerde organellen, als verslaggever. Deze eenvoudige methode kan ook onderscheid te maken tussen de verschillende modi van gereglementeerde exocytose in cellen die moeilijk zijn te genetisch manipuleren.

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Gebruik van Rotorod als een methode voor de kwalitatieve analyse van Wandelen in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Een chemische Screening Procedure voor Glucocorticoid Signalering met een zebravis larve luciferasereporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...