Name: imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00
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Wir danken Dr. U. Ashery für das großzügige Geschenk von cDNA. Wir danken Dr. G. Masse, L. Mittleman, M. Shaharbani und Y.Zilberstein vom Sackler Cellular & Molecular Imaging Center für ihre unschätzbare Hilfe für Mikroskopie. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Vereinigten Staaten und Israel binationale Wissenschaftsstiftung (Grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel und S.J.Galli) und 933/15 zu gewähren, die Israel Science Foundation, gegründet von der Israel-Akademie für Wissenschaften (zu R.Sagi-Eisenberg ) und NIH-Stipendien U19 AI 104209 und R01 AR067145 (, S.J. Galli).

1. Vorbereitungen
<ol><li>Vorbereitung der RBL Nährmedien<ol>
<li>Mix 500 mL niedrige Glukose Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 56 mL fetalen bovine Serum (FBS), 5,5 mL Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung, 5,5 mL L-Glutamin 200 mM Lösung. Dies führt zu niedrigen Blutzucker DMEM mit 10 % FBS, 100 µg/mL Streptomycin, 100 Einheiten/mL Penicillin, 12 Einheiten/mL Nystatin und 2 mM L-Glutamin ergänzt.</li>
		<li>Filtermedien Sie die mit einem Top-Vakuum-Filter von 0,22 µm Porengröße und Store bei 4 °...

Hier beschreiben wir wie Tracing die Fluoreszenz der FITC-Dextran in SGs geladen verwendet werden kann um speziell zusammengesetzte Exozytose Ereignisse zu erfassen. Dies wurde erreicht durch das Mikroskop, alle 15 Sekunden ein Bild zu erwerben, damit nur lang andauernde Ereignisse im Laufe der Zeit aufgezeichnet werden und daher ohne kurze Ereignisse, die volle Exozytose oder Kiss-and-Run Exozytose entsprechen würde. Um die Methode zu etablieren, haben wir gezeigt, dass Knockdown von Rab5-Isoformen, die sind in RBL Zel...

Regulierten Exozytose ist der primäre Mechanismus durch die leicht gemachte Cargo von sekretorischen Zellen als Reaktion auf einen bestimmten Auslöser freigegeben wird. Die Ladung ist vorgeformt und abgesondert in sekretorischen Vesikel, in denen es gespeichert wird, bis ein Auslöser das Signal für die Veröffentlichung von Inhalten der SGs überträgt. Verschiedene Arten von Signalen können in verschiedenen Modi der regulierten Exozytose, oder verschiedene Modi der regulierten Exozytose können gleichzeitig auftreten. Drei Hauptmodi des regulierten Exozytose sind bekannt: volle Exozytose, einhergehende vollständige Verschmelzung von einem einzigen sekretorischen Granulat mit der Plasmamembran; Kiss-and-Run Exozytose, die vorübergehende Verschmelzung von sekretorischen Granulat mit der Plasmamembran, gefolgt von seiner Wiederverwertung beinhaltet; und zusammengesetzte Exozytose, charakterisiert durch homotypische Verschmelzung von mehreren SGs vor (d.h. multigranular Exozytose) oder sequenziell (d.h., sequentielle Exozytose) zur Fusion mit der Plasmamembran1. Zusammengesetzte Exozytose den umfangreichsten Modus der Fracht Release2, gilt als es die schnelle Sekretion von Fracht ermöglicht, einschließlich von SGs, die sich distal von der Plasmamembran. Zusammengesetzte Exozytose ist dokumentiert worden, in beiden exokrinen und endokrinen Zellen3,4,5,6,7,8,9, sowie in Immunzellen. In Immunzellen, wie eosinophile10,11,12 und neutrophile13ermöglicht zusammengesetzte Exozytose die schnelle und robuste Freisetzung von Mediatoren, die eindringende Krankheitserreger wie töten müssen Bakterien oder Parasiten. Mastzellen (MCs) bereitstellen zusammengesetzte Exozytose für die effiziente Freisetzung von Entzündungsmediatoren vorgespeicherten während der angeborenen Immunantwort, Anaphylaxie und andere allergische Reaktionen14,15,16 , 17. da die verschiedenen Modi der Exozytose18,19gleichzeitig auftreten können, ist es eine Herausforderung unterschieden in Echtzeit oder zu identifizieren, ihre jeweiligen Fusion Maschinen, daher verdeutlichend geworden die zugrunde liegenden Mechanismen.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, basierend auf live Cell Imaging Zelle geladen FITC-Dextran, das Echtzeit-Tracking der Exocytic Ereignisse und die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Modi erlaubt. Unsere Methode ermöglicht insbesondere, exklusive Überwachung der zusammengesetzten Exozytose.
FITC-Dextran ist ein Konjugat pH-Sensitive Fluorophor FITC mit Glucan Polysaccharid Dextran. Eindringmittel beschrifteten Dextrans nachweislich in die Zelle eindringen von Micropinocytosis20,21 und Macropinocytosis22,23. Als endocytic Fächer in Lysosomen Reifen, hat sich gezeigt, dass FITC-Dextran sammelt sich in den Lysosomen mit keine offensichtliche Verschlechterung. Jedoch da FITC ein hochsensibler pH Fluorophor-24 istund das Lysosomen Lumen sauer ist, stillt FITC-Dextran Fluoreszenz bei Erreichen der Lysosomen-24. So gezielt Fracht, zusammen mit der pH-Empfindlichkeit der FITC Dextrans als Lysosomen zu etablieren, haben den Grundstein für die Nutzung der FITC-Dextran in Studien der Lysosomen Exozytose25,26,27 , 28 , 29.
In mehreren Zelltypen, einschließlich MCs, neutrophile, eosinophile, zytotoxischen T-Zellen, Melanosomen und andere die SGs lysosomale Anzeigefunktionen und gelten als Lysosomen-bezogene Organellen (LROs) oder sekretorische Lysosomen30,31 . Da LROs einen sauren luminalen pH haben, kann FITC-Dextran verwendet werden, ihre Exozytose, als Folge der höheren pH-Wert, verbunden mit der Auslagerung der LROs zu visualisieren. In der Tat, FITC-Dextran wurde zur Exozytose MCs18,32,33zu überwachen. Bei dieser Methode ist FITC-Dextran hinzugefügt, um die Zellkultur, durch Pinocytose von den Zellen aufgenommen und in die SGs sortiert. Wie es in Lysosomen, wird FITC Fluoreszenz in der SGs abgeschreckt, wenn sie innerhalb der Zelle sind. Allerdings gewinnt bei SG Fusion mit der Plasmamembran und konsequente Exposition gegenüber dem äußeren Milieu, FITC-Dextran seine Fluoreszenz steigendem pH-Wert SG ermöglicht die einfache Verfolgung von Exocytic Veranstaltungen live Zelle Mikroskopie. Hier haben wir diese Methode, um einzigartige Tracking von zusammengesetzten Exozytose ermöglichen angepasst.
Zwei andere Methoden haben zuvor verwendet worden, um zusammengesetzte Exozytose zu verfolgen. Elektronenmikroskopie war die erste Methode zur Charakterisierung von Exocytic Strukturen, die das Auftreten von verschiedenen Modi der Exozytose vorgeschlagen. Insbesondere führte zu der Hypothese des zusammengesetzten Exozytose Beobachtungen "sekretorischen Tunnel" in pankreatischen acinar Zellen34 und MCs35,36,37 . Jedoch während die hochauflösende Elektronenmikroskopie verschmolzenen Vesikel offenbaren kann, kann nicht verfolgen die Dynamik ihrer Fusion und daher kann nicht festlegen, ob sie SG Fusion bei zusammengesetzten Exozytose oder Verschmelzung von zurückeroberten Granulat entsprechen nach ihrer Endozytose. Dieses Hindernis ist in anderen Methoden überwinden, die Exozytose in lebenden Zellen, wie z. B. Patch Clamp-Messungen der Plasmamembran Kapazität11,13,38,39 oder strommesstechnik messen können 40 der Medien. Allerdings spannen Patch erfordert eine spezielle Set-up und möglicherweise nicht geeignet für alle Zelltypen. Strommesstechnik Messungen sind in der Lage, Exozytose zu verfolgen, nur dann, wenn die Ladung in unmittelbarer Nähe an der Elektrode freigegeben wird. Mit live Cell Imaging bietet daher einen Vorteil gegenüber diesen Methoden, da es nicht nur Echtzeit-Tracking der Exozytose ermöglicht, sondern es auch schnelle und einfache Erfassung von Daten aus der gesamten Zelle erlaubt.
Das Tracking der FITC-Dextran live Zelle Mikroskopie bietet auch einige Vorteile zu anderen live Cell Imaging-basierte Methoden. Zum Beispiel ist eine weit verbreitete Methode Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) der Zellen geladen mit einer fluoreszierenden SG-Sonde oder mit dem Ausdruck eine fluoreszierende Protein markiert SG Fracht oder Membran Protein26,41, 42 , 43. die Stärke dieser Methode liegt in seiner Fähigkeit, ausschließlich Ereignisse zu überwachen, die auftreten, in der Nähe der Plasmamembran (hier "Fußabdruck" bezeichnet), daher Exocytic Veranstaltungen. Dies ist jedoch auch der Nachteil dieser Methode, da nur die Zelle Teil, die grenzt an das Deckglas und nah an den Mikroskop-Objektiv kann44abgebildet. Ob solche Fußabdrücke in der Tat die gesamte Zelle Membranoberfläche darstellen ist noch fraglich45,46,47. In dieser Hinsicht ermöglicht die Verwendung eines pH-sensitiven Farbstoffs wie FITC-Dextran und ein standard Fluoreszenzmikroskop oder ein confocal Mikroskop mit einer offenen Lochkamera Bildgebung der ganzen Zelle, so erfassen die totale Exocytic Ereignisse, die in dieser Zelle auftreten.
Weitere pH-Sensitive-Reporter, die verwendet werden, um regulierte Exozytose studieren durch ganze Zelle Bildgebung oder TIRFM gehören SG Fracht oder SG Membranprotein verschmolzen, Phlourin, eine pH-Sensitive-GFP-Variante. Beispiele sind NPY - Phlourin-, β-Hexoseaminidase-Phlourin und Synapto-Phluorin48,49,50,51,52. Während Ausdruck dieser Sonden die endogene Zusammensetzung des SGs genauer darstellen kann, es beinhaltet Transfektion von Zellen, und kann daher für die Zellen, die schwer zu transfizieren sind weniger geeignet. Daher, wenn Studium Zellen sind schwer zu transfizieren oder unter experimentellen Bedingungen, die mehrere genomische Manipulationen erfordern die Verwendung einer Verbindung, die einfach in das Zellkulturmedium wie FITC-Dextran, ergänzt werden kann ist vorteilhaft . FITC-Dextran bietet auch einen Vorteil gegenüber Acridin orange (AO), ein anderer pH-Sensitive-Farbstoff, der für die Verfolgung von Exozytose von live Zelle Mikroskopie53,54,55,56 verwendet wurde , 57 , 58. AO hat gezeigt, dass die Photolyse von Vesikeln zu induzieren, dass führen zu falschen Blitze, die nicht zum eigentlichen Sekretion entsprechen27verarbeitet. Im Gegensatz dazu reflektiert FITC-Dextran bessere Sekretion Veranstaltungen, wahrscheinlich aufgrund seiner geringen Foto-induzierte Produktion von reaktiven Sauerstoff-27.
Bemerkenswert ist ein alternativer Ansatz für das Studium Exozytose durch die Verfolgung des Zustroms von ein Farbstoff aus dem externen Medium in der SG durch die Fusion Pore, die während dieses Prozesses wird geöffnet. In diesem Fall wird der Farbstoff auf das externe Medium neben der sekretorischen Trigger hinzugefügt. Dann, wenn die Fusion Pore geöffnet wird, diffundiert der Farbstoff in der SG59,60. Ein klarer Vorteil dieser Methode ist, dass es auch die Möglichkeit bietet, die Fusion Porengröße, durch den Einsatz von Farbstoffen von variabler Größe zu schätzen. Beispielsweise können Dextrans von unterschiedlichem Molekulargewicht (MW), konjugiert zu verschiedenen Fluorophore, als extrazelluläre Farbstoffe verwendet werden wobei die maximale Größe der Dextran, die die SG durchdringen kann die Größe der Fusion Pore59, entsprechen würde 61 , 62 , 63 , 64. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht erfordern den Einsatz einer pH-Sensitive-Sonde. Ein wesentlicher Nachteil ist jedoch, dass das Signal-Rausch-Verhältnis sehr gering ist, da eine große Menge an Farbstoff während der Aufnahme von Bildern, was zu hohen Hintergrund in den Medien präsent ist.
Die Verwendung von FITC-Dextran als ein Marker für die Exozytose überwindet insgesamt mehrere Nachteile in zuvor gemeldeten Methoden wie Signal-Rausch-Verhältnis, Toxizität, dynamische Tracking und Komplexität.
Hier beschreiben wir die Verwendung von FITC-Dextran, zusammengesetzte Exozytose in der RBL - 2 H-3 Mast Zell-Linie (hier bezeichnet als RBL, in erster Linie festgelegten Eccleston Et Al. zu überwachen 65 und weitere geklont von Barsumian Et Al. ( 66), als Reaktion auf Immunglobulin E (IgE) / Antigen (Ag) Aktivierung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep-nystatin solution</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution&#160;</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran 150K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46946-500MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution B</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top-vacuum filter of 0.22 &#181;m pore size&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 &#181;m pore size</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered coverglass&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNP-HSA (Ag)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661&#160;</td>
			<td>Avoid direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer 1M, pH 7.4</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>BDH Laboratories</td>
			<td>284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>MERK</td>
			<td>1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES dipotassium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108321-27-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>MERK</td>
			<td>6346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>105833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator&#160;</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td>
			<td>Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td>
			<td>Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td>Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBL-2H3 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis

Regulierten Exozytose ist ein Prozess, der durch den Ladung, die in sekretorischen Granulat (SGs) gespeichert ist, als Reaktion auf einen sekretorischen Auslöser freigegeben wird. Regulierten Exozytose ist von grundlegender Bedeutung für die interzelluläre Kommunikation und ist ein wichtiges Instrument für die Sekretion von Neurotransmitter, Hormone, Entzündungsmediatoren und andere Verbindungen, durch eine Vielzahl von Zellen. Mindestens drei verschiedene Mechanismen sind bekannt für regulierte Exozytose: volle Exozytose, wo ein einziges SG voll mit der Plasmamembran, Kiss-and-Run Exozytose verschmilzt, wo ein einziges SG vorübergehend mit der Plasmamembran verschmilzt, und zusammengesetzte Exozytose, wo mehreren SGs verschmelzen miteinander, vor oder nach SG-Fusion mit der Plasmamembran. Die Art der regulierten Exozytose durchgeführt von einer Zelle wird häufig durch die Art der sekretorischen Trigger vorgeschrieben. Jedoch kann in vielen Zellen, sekretorische einabzug mehrere Modi der regulierten Exozytose gleichzeitig aktivieren. Trotz ihrer Fülle und Bedeutung über Zelle Arten und Arten sind die Mechanismen, die die verschiedenen Modi der Sekretion bestimmen weitgehend ungelöst. Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung der verschiedenen Verkehrsträger regulierten Exozytose ist die Schwierigkeit bei der Unterscheidung zwischen ihnen, als auch separat zu erkunden. Hier beschreiben wir die Verwendung von Fluorescein erfolgt (FITC)-Dextran als Exozytose Reporter und live Cell imaging, um zu unterscheiden, die verschiedene Wege der regulierten Exozytose, mit Schwerpunkt auf zusammengesetzte Exozytose, basierend auf die Robustheit und Dauer der Exocytic Ereignisse.

Abbildung 1a stellt schematisch wie FITC-Dextran als Reporter tätig werden kann für die Exozytose reguliert und die verschiedenen Modi der Exocytic Ereignisse zu rekapitulieren. Erstens sind Zellen mit FITC-Dextran, inkubiert, die durch Pinocytose verinnerlicht und sortiert die SGs. Da die SGs MCs LROs sind, ihre niedrige pH-Wert dämpft die Fluoreszenz der FITC, hier gezeigten Schwarz Granulat (A-C, ich). Wenn Zellen durch eine sekretagog und SGs verschmel...

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Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

Hier zeigen wir eine Methode für das live Cell Imaging von regulierten Exozytose. Diese Methode nutzt FITC-Dextran, die reichert sich in Lysosomen-bezogene Organellen, als Reporter. Diese einfache Methode ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen verschiedenen Modi der regulierten Exozytose in Zellen, die schwer zu genetisch zu manipulieren sind.

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

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