Name: imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

Vi takker Dr. U. Ashery for sjenerøs gave cDNA. Vi takker Dr. G. Mass, L. Mittleman, M. Shaharbani og Y.Zilberstein fra Sackler mobilnettet og molekylære Imaging Center for deres uvurderlig hjelp med mikroskopi. Dette arbeidet ble støttet av USA-Israel Binational Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel og S.J.Galli) og gi 933/15 fra Israel Science Foundation, grunnlagt av Israel akademiet for vitenskap (til R.Sagi-Eisenberg ) og NIH tilskudd U19 AI 104209 og R01 AR067145 (å S.J. Galli).

1. forberedelser
<ol><li>Utarbeidelse av RBL kultur medier<ol>
<li>Mix 500 mL av lav glukose Dulbecco endret Eagle's medium (DMEM) med 56 mL av fetal bovin serum (FBS), 5,5 mL av penicillin streptomycin nystatin løsning, 5,5 mL av L-glutamin 200 mM løsning. Dette resulterer i lav glukose DMEM supplert med 10% FBS, 100 µg/mL streptomycin, 100 enheter/mL penicillin, 12 enheter/mL nystatin og 2 mM L-glutamin.</li>
		<li>Filtrere media ved å bruke filtere topp-vakuum 0.22 µm porestørrelse og butikk på 4 ° C.</li>
	...

Her beskriver vi hvordan sporing fluorescens av FITC-dekstran lastet inn SGs kan brukes til å fange spesielt sammensatt exocytosis hendelser. Dette ble oppnådd ved å sette mikroskop for å skaffe et bilde hvert 15 sekunder, slik at bare langvarig hendelser blir registrert over tid og dermed unntatt kort hendelser som skulle tilsvare full exocytosis eller kyss-and-run exocytosis. For å etablere metoden, viste vi at knockdown av Rab5 isoformene som uttrykkes i RBL celler, og er avgjørende for sammensatte exocytosis, e...

Regulert exocytosis er den primære mekanismen som lett gjort Last frigis fra en sekretoriske celle som svar på en bestemt utløser. Lasten er før dannet og sequestered i sekretoriske blemmer, som det er lagret til en utløser videresender signalet for utgivelsen av SGs' innhold. Forskjellige typer signaler kan resultere i forskjellige moduser av regulert exocytosis eller forskjellige moduser av regulert exocytosis oppstå samtidig. Tre viktigste formene for regulert exocytosis er kjent: full exocytosis, som innebærer full blanding av en enkelt sekretoriske granule med plasma membran; kyss-and-run exocytosis, som innebærer forbigående fusjon av det sekretoriske granulen med plasma membranen etterfulgt av sin gjenvinning; og sammensatte exocytosis, som er preget av homotypic blanding av flere SGs før (dvs., multigranular exocytosis) eller sekvensielle (dvs., sekvensielle exocytosis) til fusjon med plasma membranen1. Sammensatte exocytosis regnes som den mest omfattende modusen av Last release2, som gjør det mulig for rask utskillelsen av Last, inkludert fra SGs som ligger distale fra plasma membranen. Sammensatte exocytosis er dokumentert i begge exocrine og endokrine celler3,4,5,6,7,8,9, samt immunceller. I immunceller, som eosinofile10,11,12 og nøytrofile13, tillater sammensatte exocytosis rask og robust utgivelsen av meglere som kreves for å drepe invaderende patogener som bakterier eller parasitter. Mast celler (MCs) distribuere sammensatte exocytosis for effektiv utgivelsen av forhåndslagrede inflammatoriske mediatorer under medfødte immunreaksjoner, anafylaksi og andre allergiske reaksjoner14,15,16 , 17. siden forskjellige moduser exocytosis oppstår samtidig18,19, har det blitt en utfordring å skille mellom dem i sanntid eller til å identifisere deres respektive fusion machineries, derav Klargjørende deres underliggende mekanismene.
Her presenterer vi en metode basert på levende celle imaging cellen lastet FITC-dekstran, som gjør at sanntid sporing av exocytic hendelser og skille mellom deres forskjellige moduser. Spesielt tillater våre metoden eksklusive overvåking av sammensatte exocytosis.
FITC-dekstran er en komplekskonjugerte til pH-sensitive fluorophore FITC med Glukan polysakkarid dekstran. Fluorescently merket dextrans har vist inn i cellen av micropinocytosis20,21 og macropinocytosis22,23. Som endocytic rom eldre i lysosomer, har det vært vist at FITC-dekstran akkumuleres i lysosome uten tilsynelatende degradering. Men siden FITC er en svært pH-sensitive fluorophore24, og lysosome-lumen er surt, slukker FITC-dekstran fluorescens på å nå lysosome24. Dermed etablere dextrans som lysosome målrettet Last, tatt med pH følsomheten til FITC, har lagt grunnlaget for bruk av FITC-dekstran i studier av lysosome exocytosis25,26,27 , 28 , 29.
Flere celletyper, inkludert MCs, nøytrofile, eosinofile, cytotoxic T-celler, melanosomes og andre, SGs lysosomale funksjoner og er klassifisert som lysosome-relaterte organeller (LROs) eller sekretoriske lysosomer30,31 . Siden LROs har et surt luminal pH, kan FITC-dekstran brukes til å visualisere deres exocytosis, som følge av høyere pH knyttet til exteriorization av LROs. Faktisk, FITC-dekstran har blitt brukt til å overvåke exocytosis MCs18,32,33. I denne metoden, er FITC-dekstran lagt til i cellekultur, tatt opp av cellene av pinocytosis og sortert i SGs. Som i lysosomer, er FITC fluorescens slukket i SGs når de er inne i cellen. Men på SG fusion med plasma membranen og påfølgende eksponering for eksterne miljøet gjenvinner FITC-dekstran sin fluorescens som SG pH stiger, tillater enkel sporing av exocytic hendelser av levende celle mikroskopi. Her justert vi denne metoden å aktivere unike sporing av sammensatte exocytosis.
To andre metoder har blitt brukt tidligere spore sammensatte exocytosis. Elektronmikroskop var den første metoden å karakterisere exocytic strukturer som foreslo forekomsten av forskjellige moduser av exocytosis. Spesielt ga observasjoner av "sekretoriske tunneler" i bukspyttkjertelen acinar celler34 og MCs35,36,37 opphav til hypotesen om sammensatte exocytosis. Men mens den høye oppløsningen av elektronmikroskop har makt til å avsløre smeltet blemmer, det kan ikke spore dynamikken i sin fusion og dermed kan ikke definere om de stemmer med SG fusion under sammensatte exocytosis eller blanding av inndekning av noe granulater etter deres endocytose. Denne hindringen er overvunnet i andre metoder som kan måle exocytosis i levende celler, som oppdateringen klemme målene av plasma membranen kapasitans11,13,38,39 eller amperometry 40 av media. Imidlertid oppdateringen clamping krever en spesiell oppsett og kan ikke være egnet for alle celletyper. Amperometry mål er kunne spore exocytosis bare hvis lasten er utgitt i umiddelbar nærhet til elektroden. Derfor tilbyr med levende celle imaging fordeler over disse metodene, som det ikke bare tillater for sanntid sporing av exocytosis, men det tillater rask og enkel henting av data fra hele cellen.
Sporing av FITC-dekstran av levende celle mikroskopi tilbyr også noen fordeler til andre levende celle imaging-baserte metoder. For eksempel er en brukte metoden totalt interne refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) av celler lastet med en fluorescerende SG sonde eller uttrykke en fluorescerende protein-merket SG Last eller membran protein26,41, 42 , 43. styrken i denne metoden ligger i dens evne til å overvåke utelukkende hendelser som oppstår nær plasma membranen (heretter referert til som fotavtrykk), derav exocytic hendelser. Men er dette også ulempen med denne metoden fordi bare cellen brøkdel er coverglass og nær mikroskop linsen kan være fotografert44. Om slike fotavtrykk faktisk representerer hele cellemembranen overflaten er fortsatt diskuteres45,46,47. I denne forbindelse, lar med en pH-sensitive fargestoff som FITC-dekstran og standard fluorescens mikroskop eller AC confocal mikroskop med en åpen pinhole avbilding av hele cellen, dermed tar totale exocytic hendelser som skjer i denne cellen.
Ekstra pH-sensitive journalister som brukes til å studere regulert exocytosis av hele cellen avbildning eller TIRFM inkluderer SG Last eller SG membran protein del phlourin, en pH-sensitive GFP variant. NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin og synapto-phluorin,48,,49,,50,,51,,52eksempler. Mens uttrykket av disse sonder kan representere nærmere endogene sammensetningen av SGs, det medfører transfection cellene, og kan derfor være mindre egnet til celler som er vanskelig å transfect. Derfor, når studere celler som er vanskelig å transfect eller under eksperimentelle forhold som krever flere genomisk manipulasjoner, bruk av et stoff som du kan bare legge til celle kultur medium, for eksempel FITC-dekstran, er en fordel . FITC-dekstran tilbyr også en fordel over Akridin oransje (AO), en annen pH-sensitive fargestoff som har blitt brukt for sporing av exocytosis av levende celle mikroskopi53,54,55,56 , 57 , 58. AO har vist seg å indusere photolysis av blemmer som resulterer i USANN blinker, som ikke samsvarer med faktiske sekresjon behandler27. I kontrast, gjenspeiler FITC-dekstran bedre sekresjon hendelser, sannsynligvis på grunn av sin lave Foto-indusert produksjon av reaktive oksygen27.
Spesielt, er en alternativ tilnærming for å studere exocytosis ved å spore tilstrømningen av en farge, fra eksterne mediet i SG gjennom fusion pore som åpnes under denne prosessen. I dette tilfellet legges fargestoff til eksterne medium sammen med sekretoriske utløseren. Deretter, når fusion pore åpner, fargestoff diffunderer i SG59,60. En klar fordel med denne metoden er at det også tilbyr muligheten til å beregne fusion porestørrelse, ved bruk av fargestoffer av variabel størrelse. For eksempel kan dextrans av ulike molekylvekt (MW), konjugert til ulike fluorophores, brukes som ekstracellulære fargestoffer der den maksimale størrelsen på dekstran som kan trenge SG skulle tilsvare størrelsen på fusion pore59, 61 , 62 , 63 , 64. I tillegg denne tilnærmingen ikke krever bruk av en pH-sensitive sonde. Men er ulempe at signalet til støyforhold er svært lav, siden en stor mengde fargestoff er til stede i mediene under oppkjøpet av bildene i høye.
Bruk av FITC-dekstran som en markør for exocytosis overvinner samlet flere ulemper i tidligere rapportert metoder, som signal til støy forhold, toksisitet, dynamisk sporing og kompleksitet.
Her beskriver vi bruk av FITC-dekstran å overvåke sammensatte exocytosis i RBL - 2H 3 mast celle linje (heretter referert til som RBL, først og fremst etablert av Eccleston et al. 65 og ytterligere klonet av Barsumian et al. 66), svar på immunglobulin E (IgE) / antigen (Ag) aktivisering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep-nystatin solution</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution&#160;</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran 150K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46946-500MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution B</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top-vacuum filter of 0.22 &#181;m pore size&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 &#181;m pore size</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered coverglass&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNP-HSA (Ag)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661&#160;</td>
			<td>Avoid direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer 1M, pH 7.4</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>BDH Laboratories</td>
			<td>284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>MERK</td>
			<td>1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES dipotassium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108321-27-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>MERK</td>
			<td>6346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>105833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator&#160;</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td>
			<td>Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td>
			<td>Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td>Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBL-2H3 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis

Regulert exocytosis er en prosess som slippes Last, som er lagret i sekretoriske granulater (SGs), som svar på en sekretoriske utløser. Regulert exocytosis er grunnleggende for intercellulære kommunikasjon og en viktig mekanisme for utskillelsen av nevrotransmittere, hormoner, inflammatoriske mediatorer og andre forbindelser, av en rekke celler. Minst tre forskjellige mekanismer er kjent for regulert exocytosis: full exocytosis, der en enkelt SG fullt sikringer med plasma membran, kyss-and-run exocytosis, der en enkelt SG transiently sikringer med plasma membranen, og sammensatte exocytosis, der flere SGs sikring med hverandre, før eller etter SG sammensmelting med plasma membranen. Typen regulert exocytosis foretas av en celle er ofte diktert av sekretoriske utløser. I mange celler, kan en enkelt sekretoriske utløse derimot aktivere flere driftsmoduser regulert exocytosis samtidig. Til tross for sine overflod og betydning over celletyper og arter er mekanismer som bestemmer forskjellige moduser sekresjon i stor grad uløst. En av de største utfordringene i undersøke forskjellige moduser regulert exocytosis, er vanskeligheten i skille mellom dem, i tillegg til å utforske dem separat. Her beskriver vi bruk av fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran som exocytosis reporter, og levende celle imaging for å skille mellom forskjellige veier av regulert exocytosis, med fokus på sammensatte exocytosis, basert på robusthet og varighet for exocytic hendelser.

Figur 1a representerer skjematisk hvordan FITC-dekstran kan fungere som en reporter for regulert exocytosis og recapitulate forskjellige moduser exocytic hendelser. Først er celler ruges med FITC-dekstran, som er internalisert pinocytosis og til SGs. Siden SGs MCs LROs, deres lav pH demper fluorescens av FITC, vises her som svarte granulater (-vekselstrøm, jeg). Når cellene er utløst av et secretagogue og SGs sikringen med plasma membranen, dannes en fusi...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imaging FITC-dekstran som en Reporter regulert Exocytosis

Her detalj vi en metode for levende celle avbilding av regulert exocytosis. Denne metoden bruker FITC-dekstran, som akkumuleres i lysosome-relaterte organeller, som reporter. Denne enkle metoden kan også skille mellom ulike regulert exocytosis i celler som er vanskelige å manipulere genetisk.

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

En enkel metode for Imaging Arabidopsis Gir hjelp Perfluorodecalin som et infiltrerende Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol som en matrise for Matrix Assisted Laser desorpsjon / Ionization Imaging på en Fourier Transform Ion syklotron Resonans Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA Catalyst som reporter for Screening narkotika mot RNA Redigering i trypanosomer

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

RAW264.7 transfektere celler med en luciferasereportergenet

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...