Name: imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

Мы благодарим д-р U. Ashery за щедрый дар cDNA. Мы благодарим Drs. G. массовые, L. Mittleman, м. Shaharbani и Y.Zilberstein от Sackler сотовых и молекулярной визуализации Центр за их неоценимую помощь с помощью микроскопии. Эта работа была поддержана двусторонней научного фонда США Израиль (Грант 2013263 R. саги-Айзенберг, I. Хаммел и S.J.Galli) и предоставить 933/15 от Израиля научный фонд, созданная Израилем академия наук (для R.Sagi-Айзенберг ) и низ грантов U19 Ай 104209 и R01 AR067145 (чтобы S.J. Galli).

1. Подготовка
<ol><li>Подготовка RBL культуры средств массовой информации<ol>
<li>Смесь 500 мл низкий глюкозы Дульбекко изменения среднего (DMEM) орла с 56 мл плода бычьим сывороточным (ФБС), 5,5 мл раствора пенициллина стрептомицином нистатин, 5,5 мл раствора L-глютамин 200 мм. Это приводит к низкой глюк?...

Здесь мы описываем, как трассировка флуоресценции FITC-декстран загружается в SGs может использоваться для специально захвата составные экзоцитоз событий. Это было достигнуто, установив Микроскоп, чтобы получить изображение каждые 15 секунд, обеспечивая тем самым, что со временем будет за...

Регулируемые экзоцитоз является основным механизмом, который легко сделал груза освобождается от секреторных клеток в ответ на конкретного триггера. Груз предварительно сформированы и поглощенных в секреторные пузырьки, в которых он хранится до тех пор, пока триггер передает сигнал для выпуска SGs содержание. Различные типы сигналов может привести к различных режимов регулируемых экзоцитоз, или различные виды регулируемых экзоцитоз может произойти одновременно. Известны три основных видов регулируемых экзоцитоз: полный экзоцитоз, который включает в себя полное слияние одного секреторных гранул с плазматической мембраны; поцелуй и побегите экзоцитоз, который включает в себя временные синтеза секреторных гранул с плазматической мембраны, следуют его переработки; и составные экзоцитоз, которая характеризуется homotypic слияние нескольких предварительного SGs (то есть, многогранулярную экзоцитоз) или последовательный (то есть, последовательные экзоцитоз) фьюжн с плазматической мембраны1. Составные экзоцитоз считается самой обширной режим грузовой версии2, как он позволяет быстро секрецию грузов, в том числе от SGs, которые расположены дистальной от плазматической мембраны. Составные экзоцитоз задокументировано как эндокринной и экзокринной клетки3,4,5,6,,78,9, а также в иммунные клетки. В иммунных клеток, таких как эозинофилов10,,1112 и нейтрофилы13составные экзоцитоз позволяет быстрый и надежный высвобождение медиаторов, которые обязаны убить вторжение патогенов, таких как бактерии и паразитов. Тучные клетки (MCs) развернуть составные экзоцитоз для эффективного выпуска предварительно воспалительных медиаторов во время врожденные иммунные реакции, анафилактический шок и другие аллергические реакции14,,1516 , 17. Поскольку различные режимы экзоцитоз может происходить одновременно1918,, он стал проблемой различие между ними в режиме реального времени или для определения их соответствующих фьюжн механизмов, поэтому изучение их основные механизмы.
Здесь мы представляем метод, основанный на живой клетки визуализации ячейки загружен FITC-декстрана, который позволяет реального времени отслеживания событий exocytic и различия между их различными способами. В частности наш метод позволяет эксклюзивные мониторинг соединения экзоцитоз.
FITC-декстран является конъюгата Флюорофор рН чувствительных FITC с глюкан полисахарид декстрана. Дневно обозначенные декстраны показали ввести в ячейку micropinocytosis20,21 и макропиноцитозом22,23. Как endocytic отсеков перерастет лизосомы, было показано, что FITC-декстран накапливается в Лизосома без явного ухудшения качества. Однако поскольку FITC рН высокочувствительных Флюорофор24, и лизосомальных люмен является кислой, FITC-декстран флуоресценции утоляет по достижении Лизосома24. Таким образом установление декстраны как Лизосома целевых груза, наряду с рН чувствительность FITC, заложили основу для использования FITC-декстрана в исследованиях Лизосома экзоцитоз25,,2627 , 28 , 29.
В нескольких типов клеток, в том числе MCs, нейтрофилов, эозинофилов, цитотоксических Т-клеток, меланосомы и другие SGs отображения лизосомальных особенности и классифицируются как связанные с Лизосома органеллы (LROs) или секреторной лизосомы30,31 . Так как LROs имеют кислый рН Люминал, FITC-декстран может использоваться для визуализации их экзоцитоз, вследствие более высоких рН, связанные с экстериоризации LROs. Действительно FITC-декстран был использован для мониторинга экзоцитоз в МКН18,32,33. В этом методе FITC-декстран добавляется к культуре клетки, рассмотрены клетками Пиноцитоз и отсортированный в SGs. Как это лизосомы, FITC флуоресценции угасает в SGs, когда они находятся в пределах ячейки. Однако после SG сплавливание с плазматической мембраны и последующего воздействия внешней среды, FITC-декстран восстанавливает его флуоресценции SG повышением рН, позволяя простое отслеживание событий exocytic, микроскопия живой клетки. Здесь мы скорректировали этот метод, чтобы включить уникальный отслеживания составных экзоцитоз.
Два других метода ранее использовались для отслеживания составных экзоцитоз. Электронная микроскопия был первый метод для характеристики структур exocytic, которые предложили возникновение различных видов экзоцитоз. В частности замечания «секреторной туннелей» клеток поджелудочной железы ацинарной34 и MCs35,,3637 вызвал гипотеза составных экзоцитоз. Однако в то время как высокое разрешение электронной микроскопии имеет право раскрыть плавленого везикулы, он не может отслеживать динамику их синтеза и поэтому невозможно определить, соответствуют ли они SG фьюжн во время соединения экзоцитоз или фьюжн пойманных гранул после их эндоцитоз. Преодолеть это препятствие в других методах, которые можно измерить экзоцитоз в живых клетках, таких как патч зажим измерения плазматической мембраны емкости11,13,,3839 или amperometry 40 средств массовой информации. Однако пережатия патч требует специальной установки и не могут быть пригодны для всех типов клеток. Amperometry измерения имеют возможность отслеживать экзоцитоз, только если груз выпускается в непосредственной близости к электроду. Таким образом использование живых клеток предлагает преимущество над этими методами, как он позволяет не только реального времени отслеживать экзоцитоз, но он также позволяет быстро и просто приобретение данных из всей ячейки.
Отслеживания FITC-декстрана, микроскопия живой клетки также предлагает ряд преимуществ для других живых клеток изображений на основе методов. Например широко используемым методом является микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM) клеток загруженных с флуоресцентного зонда SG или выражая флуоресцентный протеин тегами SG груза или мембранный белок26,41, 42 , 43. сила этого метода заключается в его способность отслеживать только те события, которые происходят недалеко от плазматической мембраны (далее именуемая след), поэтому exocytic события. Однако это также недостаток этого метода, потому что только ячейки фракция, которая примыкает к coverglass и недалеко от Микроскоп объектив может быть воспроизведен образ44. Представляют ли такие следы действительно поверхности всей клеточной мембраны является по-прежнему спорным45,,46-47. В этой связи с помощью РН чувствительных краска например FITC-декстран и стандартный флуоресцентным микроскопом или Конфокальный микроскоп с открытым отверстием позволяет изображений всей клетки, тем самым захватив всего exocytic события, которые происходят в этой ячейке.
Дополнительные pH фактора репортеров, которые используются для изучения регулируемых экзоцитоз клеточных изображений или TIRFM включают SG груза или SG мембранных белков сливается с phlourin, вариант GFP pH фактора. Примеры включают NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin и synapto-phluorin48,49,50,,5152. В то время как выражение этих датчиков может представлять более тесно эндогенного состав SGs, это влечет за собой transfection клетки и поэтому могут быть менее пригодны для клеток, которые трудно transfect. Поэтому, когда изучение клеток, трудно transfect или в экспериментальных условиях, которые требуют нескольких геномной манипуляции, выгодно использовать соединение, которое может дополняться просто в среду культуры клеток, таких как FITC-декстрана, . FITC-декстран также предлагает преимущество над акридин оранжевый (AO), другой рН чувствительных краситель, используемый для отслеживания экзоцитоз живой клетки микроскопии53,54,55,56 , 57 , 58. было показано, что АО побудить фотолиз везикулы, что результат в ложных вспышки, которые не соответствуют фактическим секрецию процессов27. В противоположность этому FITC-декстран отражает лучше секрецию события, вероятно из-за его низкой фото индуцированной производства кислорода27.
Примечательно альтернативный подход для изучения экзоцитоз является отслеживание приток красителя, с внешнего носителя в SG через поры фьюжн, который открывается во время этого процесса. В этом случае краситель добавляется к внешней среде наряду с секреторной триггера. Затем когда открывает поры фьюжн, краситель диффундирует в SG59,60. Явным преимуществом данного метода является, что он также предлагает возможность оценить размер пор фьюжн, путем использования красителей переменного размера. К примеру декстраны разной молекулярной массы (МВт), конъюгированных с различными флуорофоров, может использоваться как внеклеточного красители, whereby максимальный размер декстрана, которые могут проникнуть SG будет соответствовать размеру фьюжн поры59, 61 , 62 , 63 , 64. Кроме того, этот подход не требует использования чувствительных рН зонд. Однако существенным недостатком является, что соотношение сигнал-шум является очень низким, поскольку большое количество красителя присутствует в средствах массовой информации во время приобретения изображений, что приводит к высокой фоновой.
В целом использование FITC-декстрана в качестве маркера для экзоцитоз преодолевает несколько недостатков в сообщалось ранее методы, такие как сигнал/шум соотношение, токсичность, динамическое отслеживание и сложности.
Здесь мы описываем использование FITC-декстран следить составные экзоцитоз в RBL - 2H 3 тучных клеток линии (далее именуемая RBL, главным образом установленные Экклстон et al. 65 и далее клонирован, Barsumian и др. 66), в ответ на иммуноглобулина Е (IgE) / Активация антигена (Ag).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep-nystatin solution</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution&#160;</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran 150K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46946-500MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution B</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top-vacuum filter of 0.22 &#181;m pore size&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 &#181;m pore size</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered coverglass&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNP-HSA (Ag)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661&#160;</td>
			<td>Avoid direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer 1M, pH 7.4</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>BDH Laboratories</td>
			<td>284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>MERK</td>
			<td>1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES dipotassium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108321-27-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>MERK</td>
			<td>6346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>105833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator&#160;</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td>
			<td>Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td>
			<td>Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td>Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBL-2H3 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis

Регулируемые экзоцитоз представляет собой процесс, по которому груз, который хранится в секреторных гранул (SGs), выпущен в ответ на триггер секреторной. Регулируемые экзоцитоз является основополагающим для межклеточные связи и является ключевым механизмом для секреция нейротрансмиттеров, гормоны, воспалительных посредников и других соединений, различных клеток. По крайней мере три отдельных механизмов известны для регулируемых экзоцитоз: полный экзоцитоз, где один SG полностью сливается с плазматической мембраны, поцелуй и побегите экзоцитоз, где один SG временно предохранители с плазматической мембраны, и составные экзоцитоз, где несколько SGs сливаются друг с другом, до или после сплавливания SG с плазматической мембраны. Тип регулируемого экзоцитоз, предпринимаемые ячейки часто продиктовано тип секреторной триггера. Однако многих клеток, секреторные один триггер может активировать несколько режимов регулируемых экзоцитоз одновременно. Несмотря на обилие и значение различных видов и типов клеток механизмы, которые определяют различные режимы секреции основном нерешенными. Одна из главных задач в расследовании различных режимов регулируемых экзоцитоз, является трудность проведения различия между ними, а также изучать их отдельно. Здесь мы описываем использование флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстран как репортер экзоцитоз и живой клетки, воображения, чтобы различать разные пути регулируемых экзоцитоз, сосредоточив внимание на составные экзоцитоз, основанный на надежность и продолжительность события exocytic.

Рисунок 1a представляет схематично как FITC-декстран могут выступать в качестве репортера регулируется экзоцитоз, и охарактеризовать различные режимы exocytic событий. Во-первых клетки инкубируют с FITC-декстрана, который интернализации, Пиноцитоз и сортирую...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imaging FITC-декстран репортером для регулируемых экзоцитоз

Здесь мы подробно метод для живых клеток изображений регулируемых экзоцитоз. Этот метод использует FITC-декстрана, который накапливается в связанных с Лизосома органеллы, как репортер. Этот простой метод также позволяет различать различные виды регулируемых экзоцитоз в клетках, которые трудно манипулировать генетически.

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Измерение экзоцитоза в Нейроны Использование FM-маркировки

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Использование Rotorod как метод Качественный анализ Прогулка по Крыса

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Изображений экзоцитоза в клетки сетчатки Биполярный с Микроскопия TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Простой метод для работы с изображениями Arabidopsis Листья Использование Perfluorodecalin как инфильтративный Средний изображений

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Процедура Скрининг Обработка глюкокортикоидных сигнализации с корреспондентом системе данио рерио Личинка люциферазы

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Дитранол в качестве матрицы для матрицы лазерной десорбцией / ионизацией изображений на преобразования Фурье ионного циклотронного резонанса Масс-спектрометр

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

РНК Catalyst в качестве корреспондента Скрининг препаратов против РНК редактирования в трипаносом

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...