Name: imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

Dr. U. Ashery cDNA cömert bir hediye için teşekkür ederiz. Biz Drs. G. kütle, L. Mittleman, M. Shaharbani ve Y.Zilberstein Sackler hücresel ve moleküler görüntüleme Merkezi mikroskobu ile onların çok değerli yardım için teşekkür ederim. Bu eser Amerika Birleşik Devletleri-İsrail iki uluslu Bilim Vakfı (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, ı. Hammel ve S.J.Galli) tarafından desteklenen ve 933/15 Bilimler (için R.Sagi-Eisenberg İsrail Akademisi tarafından kurulan İsrail Bilim Vakfı Hibe ) ve NIH hibe U19 AI 104209 ve R01 AR067145 (için S.J. Galli).

1. hazırlıkları
<ol><li>RBL Kültür medya hazırlanması<ol>
<li>Mix 500 mL düşük glikoz Dulbecco'nın 5.5 mL penisilin-streptomisin-nistatin çözeltisi, 5.5 mL L-glutamin 200 mM çözeltisi ile 56 mL fetal Sığır serum (FBS), kartal'ın orta (DMEM) değiştiren. Bu sonuçlarında düşük glikoz DMEM %10 FBS, 100 µg/mL streptomisin, 100 adet/mL penisilin, 12 adet/mL nistatin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir.</li>
		<li>Medya 4 ° C'de 0,22 µm gözenek boyutu ve mağaza bir üst-vakum filtre kullanar...

Burada nasıl izleme FITC dextran SGs yüklenen floresans özellikle bileşik ekzositozu olayları yakalamak için kullanılabilir açıklar. Bu her 15 saniyede bir görüntü elde etmek için mikroskop ayarlayarak, böylece yalnızca uzun ömürlü olaylar zaman içinde kaydedilecek sağlanması ve bu nedenle tam ekzositozu veya öpücük tarafından işletilen ekzositozu karşılık kısa etkinlikleri hariç sağlanır. Yöntem kurmak için RBL hücrelerde ifade edilir ve bileşik ekzositozu için hayati önem, genel s...

Düzenlenmiş ekzositozu tarafından kolayca yapılan kargo yanıt-e doğru belirli bir tetikleyicinin salgı bir hücrede bulunan serbest için birincil mekanizmasıdır. Kargo önceden oluşmuş ve salgı veziküller, tetikleyici SGs içerik sürümü için sinyal rölesi kadar bu depolandığı içine münzevi. Farklı tipteki sinyalleri düzenlenmiş ekzositozu farklı modlarda neden olabilir veya düzenlenmiş ekzositozu farklı mod aynı anda ortaya çıkabilir. Düzenlenmiş ekzositozu üç ana mod bilinmektedir: tam füzyonu ile plazma zarı; tek bir salgı granül içerir tam ekzositozu Onun geri dönüşüm tarafından takip plazma zarı ile geçici füzyon salgı granül içerir öpücük tarafından işletilen ekzositozu; ve birkaç SGs önceden (yani, multigranular ekzositozu) homotipik füzyon tarafından karakterize bileşik ekzositozu veya sıralı (yani, sıralı ekzositozu) Fusion plazma zarı1. Kargo yer alan SGs--dan da dahil olmak üzere, hızlı salgılanmasını sağlar gibi bileşik ekzositozu kargo release2, en geniş modunda plazma zarı distal kabul edilir. Bileşik ekzositozu hem ekzokrin ve endokrin hücreleri3,4,5,6,7,8,9, hem de belgelenmiş oldu bağışıklık hücreleri. Bağışıklık hücreleri, eozinofiller10,11,12 ve nötrofil13gibi bileşik ekzositozu arabulucu gibi işgal patojenleri öldürmek için gerekli olan hızlı ve sağlam sürümü sağlar bakteri ya da asalak. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, anafilaksi ve diğer alerjik reaksiyonlar14,15,16 sırasında önceden saklı inflamatuar aracılar verimli sürümü için bileşik ekzositozu mast hücreleri (MCs) dağıtma , 17. bu yana ekzositozu farklı mod18,19aynı anda ortaya çıkabilir, onları gerçek zamanlı olarak ayırt etmek için ya da bu nedenle elucidating onların anılan sıraya göre fusion makineleri belirlemek için bir meydan okuma olmuştur onların temel mekanizmaları.
Burada dayalı bir yöntem mevcut canlı hücre hücrenin görüntüleme exocytic olaylar gerçek zamanlı izleme ve onların farklı modları arasında ayrım sağlar FITC-dextran, yüklü. Özellikle, bizim Yöntem özel bileşik ekzositozu izleme sağlar.
FITC dextran glukan polisakkarit dextran ile pH duyarlı fluorophore FITC eşlenik var. Fluorescently etiketli dextrans hücre girmek için micropinocytosis20,21 ve macropinocytosis22,23tarafından gösterilmiştir. Endositik bölmeleri organellerin olgun olarak FITC dextran hiçbir belirgin bozulma ile lysosome içinde biriken gösterilmiştir. Ancak, beri FITC çok pH hassas fluorophore24ve lysosome lümen asittir, lysosome24ulaşan üzerine FITC dextran floresans quenches. Bu nedenle dextrans lysosome kurulması, FITC pH hassasiyeti ile birlikte alınan kargo, hedeflenen çalışmalar lysosome ekzositozu25,26,27 FITC dextran kullanımında temeli atılmıştır var , 28 , 29.
MCs, nötrofiller, eozinofiller, sitotoksik T hücreleri, melanosomes ve diğerleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin SGs lizozomal özellikleri görüntülemek ve organelleri (LROs) lysosome ile ilgili ya da salgı organellerin30,31 sınıflandırılır . LROs asidik bir luminal pH var, FITC dextran daha yüksek pH LROs exteriorization ile ilişkili bir sonucu olarak kendi ekzositozu görselleştirmek için kullanılabilir. Nitekim, FITC dextran ekzositozu MCs18,32,33içinde izlemek için kullanılır. Bu yöntemde, FITC dextran hücre kültürü için eklendi, hücreler tarafından pinocytosis tarafından alınan ve SGs sıralanmış. Organellerin içinde olduğu gibi hücre içinde oldukları zaman FITC floresans SGs söndürülür. Ancak, plazma zarı ve bunun sonucunda maruz kalma dış çevre ile SG fusion FITC dextran onun floresans SG pH yükselir olarak basit bir izleme exocytic olayları canlı cep mikroskobu tarafından izin kavuşur. Burada, bileşik ekzositozu benzersiz izlemeyi etkinleştirmek için bu yöntemi ayarlanır.
Diğer iki yöntem daha önce bileşik ekzositozu izlemek için kullanılmaktadır. Elektron mikroskobu ekzositozu farklı mod oluşumunu önerdi exocytic yapıları karakterize etmek için ilk yöntem oldu. Özellikle, "salgı tünellerde" pankreas acinar hücreleri34 ve MCs35,36,37 gözlemleri bileşik ekzositozu hipotez için doğuran. Ancak, elektron mikroskobu yüksek çözünürlüklü erimiş veziküller ortaya çıkarmak için güç olsa da, onların füzyon dinamikleri takip edemez ve bu nedenle onlar SG füzyon bileşik ekzositozu sırasında veya alınmış granül füzyonu karşılık tanımlayamazsınız onların endositoz takip. Plazma zarı kapasite11,13,38,39 veya amperometry düzeltme eki kelepçe ölçülerini gibi canlı hücrelerdeki ekzositozu ölçebilirsiniz diğer yöntemleri bu engeli aşmak 40 medya. Ancak, özel bir kurulum gerektirir yama sıkma ve tüm hücre türleri için uygun olmayabilir. Amperometry ölçümler elektrot birbirine çok yakın kargo yayımlanırsa ekzositozu takip edebiliyoruz. Bu nedenle, canlı hücre Imaging'i kullanma gibi sadece ekzositozu gerçek zamanlı izleme için sağlar, ama aynı zamanda tüm cep telefonu veri hızlı ve basit edinimi sağlar Bu yöntemler üzerinde bir avantaj sağlar.
FITC dextran izleme canlı cep mikroskobu tarafından bazı avantajları diğer canlı hücre için görüntüleme tabanlı yöntemleri sunuyor. Örneğin, yaygın olarak kullanılan bir yöntem bir floresan SG sonda ile yüklenen veya bir floresan protein öğesini SG kargo veya membran protein26,41, ifade hücrelerinin toplam iç yansıma floresans mikroskobu (TIRFM) olduğunu 42 , 43. sadece (burada ayak izi adlandırılır), plazma zarı yakın meydana gelen olayları izlemek için onun yetenek bu yöntemin gücü yatıyor dolayısıyla exocytic olaylar. Bu coverglass için bitişik ve mikroskop objektif yakın olabilir hücre Kesir44yansıma ancak, aynı zamanda bu yöntemin dezavantajı olmasıdır. Böyle ayak izleri gerçekten tüm hücre membran yüzey temsil olup olmadığını hala tartışmaya açık45,46,47yaşında. Bu bağlamda, bir pH duyarlı boya gibi FITC dextran ve Standart Floresan mikroskop ya da confocal mikroskop ile açık bir iğne deliği kullanarak böylece o hücrede oluşan toplam exocytic olayları yakalama tüm cep telefonu, görüntüleme sağlar.
Tüm cep telefonu görüntüleme veya TIRFM tarafından düzenlenir ekzositozu eğitim için kullanılan ek pH duyarlı gazetecilere SG kargo veya phlourin için bir pH duyarlı GFP değişken erimiş SG membran protein içerir. Örnek NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin ve synapto-phluorin48,49,50,51,52verilebilir. Bu sondalar ifade daha yakından SGs endojen bileşimi temsil ederken, transfection hücre gerektirir ve bu nedenle daha az transfect zor olan hücreler için uygun olabilir. Bu nedenle, ne zaman eğitim bu hücreleri transfect zor veya birden çok genomik manipülasyonlar gerektiren deneysel koşullar altında sadece FITC-dextran gibi hücre kültür ortamına içine desteklenebilir bir bileşik kullanımı avantajlıdır . FITC dextran akridin turuncu (AO), üzerinde bir avantaj sunduğu diğer ekzositozu izleme için canlı cep mikroskobu53,54,55,56 tarafından kullanılan başka bir pH duyarlı boya , 57 , 58. AO gerçek salgılanması için karşılık gelmeyen yanlış yanıp söner, sonucu27işler veziküller photolysis ikna etmek için gösterilen. Buna ek olarak, FITC dextran düşük fotoğraf kaynaklı üretim / reaktif oksijen27nedeniyle muhtemelen daha iyi salgı olayları yansıtır.
Özellikle, ekzositozu eğitim için alternatif bir boya, bu işlem sırasında açılır füzyon gözenek aracılığıyla SG içine dış ortamdan akını izleyerek yaklaşımıdır. Bu durumda, boya salgı tetik yanında dış ortama eklenir. O zaman, Füzyon gözenek açıldığında, boya SG59,60dağılır. Bu yöntemin açık bir avantaj bu da füzyon gözenek boyutu, değişken boyutu boyalar kullanılarak tahmin olanağı sunuyor olmasıdır. Örneğin, farklı molekül ağırlığı (MW), farklı fluorophores için Birleşik dextrans ekstrasellüler boyaları nereye SG nüfuz dextran en büyük boyutunu füzyon gözenek59, boyutuna karşılık olarak kullanılabilir 61 , 62 , 63 , 64. Buna ek olarak, bu yaklaşım bir pH duyarlı sonda kullanımı gerektirmez. Ancak, önemli bir dezavantaj boya büyük miktarda alım kaynaklanan yüksek arka planda görüntülerin sırasında medyada mevcut olduğu için sinyal gürültü oranı çok düşük olmasıdır.
Genel olarak, ekzositozu avans olarak FITC dextran kullanımı daha önce raporlanmış yöntemleri, sinyal gürültü oranı, toksisite, dinamik izleme ve karmaşıklık gibi çeşitli dezavantajları üstesinden gelir.
Burada FITC dextran (burada RBL, öncelikle Eccleston vd tarafından kurulan denir RBL - 2 H 3 mast hücresi doğrultusunda bileşik ekzositozu izlemek için nasıl kullanılacağını açıklar 65 ve daha da klonlanmış tarafından Barsumian vd. 66), yanıt immünglobulin E (IgE) / antijen (Ag) etkinleştirme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep-nystatin solution</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution&#160;</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran 150K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46946-500MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution B</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top-vacuum filter of 0.22 &#181;m pore size&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 &#181;m pore size</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered coverglass&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNP-HSA (Ag)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661&#160;</td>
			<td>Avoid direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer 1M, pH 7.4</td>
			<td>Biological Inductries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>BDH Laboratories</td>
			<td>284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>MERK</td>
			<td>1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES dipotassium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108321-27-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>MERK</td>
			<td>6346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERK</td>
			<td>105833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MERK</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator&#160;</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td>
			<td>Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td>
			<td>Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled 
			airstream incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td>Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBL-2H3 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis

Düzenlenmiş ekzositozu tarafından salgı granül (SGs) depolanan, kargo, yanıt salgı tetikleyici olarak yayımlanan bir süreçtir. Düzenlenmiş ekzositozu hücreler arası iletişim için temel ve nörotransmitter, hormonlar, inflamatuar aracılar ve diğer bileşenleri, hücreler çeşitli tarafından salgılanmasını için önemli bir mekanizma. En az üç farklı mekanizmaları için düzenlenmiş ekzositozu bilinir: tam ekzositozu nerede tek bir SG tam olarak plazma zarı, nerede bir tek SG geçici plazma zarı ile sigortalar, öpücük ve çalıştırma ekzositozu ve bileşik ekzositozu, sigortalar, nerede birkaç SGs ile her diğer, önce veya sonra SG füzyon plazma zarı ile sigorta. Düzenlenmiş ekzositozu bir hücre tarafından üstlenilen tipi kez salgı tetikleyici türü tarafından belirlenir. Ancak, birçok hücrelerde, tek bir salgı tetikleyici düzenlenmiş ekzositozu birden çok modları aynı anda etkinleştirebilirsiniz. Bereket ve hücre tipleri ve türler arasında önem rağmen salgı farklı mod belirlemek mekanizmaları büyük ölçüde çözümlenmemiş. Düzenlenmiş ekzositozu, farklı mod soruşturma içinde ana sorunlardan biri onları ayrı ayrı keşfetmek gibi aralarında ayrım zorluk var. Burada floresein isothiocyanate (FITC) nasıl kullanılacağını açıklar-dextran bir ekzositozu gazeteci ve canlı hücre düzenlenmiş ekzositozu bileşik ekzositozu üzerinde odaklanarak, farklı yollar arasında ayırt etmek için Imaging olarak dayalı sağlamlık ve exocytic olaylar süresi.

Şekil 1a şematik nasıl FITC dextran muhabir olarak ekzositozu düzenlenmekte ve exocytic olayları farklı mod özetlemek için hareket edebilir temsil eder. İlk olarak, hücre hangi pinocytosis tarafından içselleştirilmiş ve SGs için sıralanmış FITC-dextran ile inkübe. MCs SGs LROs olduğundan, onların düşük pH FITC, burada gösterildiği gibi siyah granül floresans bozamıyor (A-C, ben). Hücreleri bir salgılatıcı ve plazma zarı ile SG...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

Burada biz ayrıntılı olarak düzenlenmiş ekzositozu canlı hücre görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem lysosome ilgili organelleri içinde birikir, FITC-dextran muhabir olarak kullanır. Bu basit yöntem aynı zamanda genetik olarak işlemek zor olan hücrelerdeki düzenlenmiş ekzositozu farklı modları arasında ayrım sağlar.

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Rotorod Rat Yürüyüş Kalitatif Analiz için bir yöntem olarak kullanımı

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Bir Zebra balığı Larva Lusıferaz Muhabir Sistemi ile glukokortikoid Signaling&#39;den için bir Kimyasal Tarama Prosedürü

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...