Name: characterization of human monocyte subsets by whole blood flow cytometry analysis
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

フローサイトメトリーは、ウエストミード研究所医学研究評議会と国立保健医療研究・ ウエストミード研究ハブ、がん所ニューサウス ウェールズ州に支えられて流れ Cytometry 中核施設で行われました。本研究は、臨床化学研究・教育基金によって支えられました。

本研究は、WSLHD 人間研究倫理委員会 (HREC) (承認 AU レッド HREC/15/WMEAD/289) によって承認されています。
1. 全血フローサイトメトリー用試料
注: 人間の血液は感染の危険性、サンプル セットアップはバイオハザード フード実行必要があります。
<ol><li>参加者から 3 mL エチレン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) チューブに血液サンプルを収集します。</li>
	<li>血球計数装置または検定を使用して白血球 (WBC) 数を決定します。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 〜 10 倍に濃度を調整する (pH 7.4 〜) に希釈6 WBC/mL。</li>
	<li>(マスター ミックス x 16 の準備など14 管) 管の数を 50 μ L の血液量、抗 CD14 V450 0.75 μ L、0.5 μ L 抗 CD16 APC、0.625 μ x 16 を組み合わせることにより十分なマスター ミックスを準備 HLA DR PerCP アンチ。各チューブ (表 1) にミックスの渦とピペット 51.9 μ L 注: 抗体は蛍光抗体の至適染色濃度を決定する滴定する必要があります。</li>
	<li>表面マーカー (M1 や M2 アイソタイプ コントロール、フィコエ リスリン (PE) ラベル) を追加 (例表 2に従って) 抗体と PE 標識 (CD3) T 細胞、B 細胞 (CD19)、好中球 (CD66b) のためのマーカーとナチュラル キラー (NK) 細胞 (CD56) (表 3)。渦と暗闇の中で 4 ° C 30 分間インキュベートします。 注: リンパ球、好中球、NK 細胞のマーカー、ゲーティング法の検証についてのみ含まれます。</li>
	<li>結合赤血球溶解/WBC 定着液、優しくすぐに、渦の 250 μ L を追加し、4 ° C で暗闇の中で 10 分間インキュベート</li>
	<li>室温で 10 分間 260 x gで 250 μ L の PBS とスピンのセルを追加します。</li>
	<li>上清を除去、再 1% のホルムアルデヒドの 300 μ L のセルを中断します。 注: ホルムアルデヒドは有毒です。ニトリル手袋、発煙のフードで使用します。</li>
	<li>解析が実行されるまでを光から保護 4 ° C で保存します。 注: サンプル調製の 48 時間以内に完了するには、フローの分析の使用をお勧めします。</li>
</ol>2. フローサイトメトリー
<ol><li>チェック施設スタッフを確保するための流れの cytometer ログは品質管理のチェックを実行しています。 注: 一貫した解析、計測器品質管理と維持の整合性を確保するには、対象の蛍光強度制御ビーズを使用してお勧めします。</li>
	<li>流れの cytometry 実験を設定、するをクリックして"新しい実験し、「新しい見本」と「新しいチューブ」チューブを追加します。アイコンをクリックして 2 変量プロットを選択し、軸パラメーターを選択するドロップ ダウン メニューを使用します。CD16/CD14 プロットと買収を監視する時間と一緒に検出器を表示するプロットを含めることを確認します。</li>
	<li>チューブを挿入し、「取得」をクリックします。検出器信号がスケールをオフではないことを確保する機器の電圧設定を確認します。</li>
	<li>CD14/CD16 プロットの単球ゲートに落ちる細胞を観察します。古典的な単球ゲートの 5,000 イベント記録しきい値を設定し、「記録」をクリックします。</li>
	<li>残りのチューブのデータを記録し続けます。すべてのチューブのデータが記録されている後は、分析のための .fcs ファイルとしてフロー データをエクスポートします。 注: 精度を確保するには、単一のカラー補正コントロールを記録すべき。補償行列を計算して15,16にスペクトルの流出を考慮する解析の前にデータに適用できます。</li>
</ol>3. 単球ゲート
<ol><li>解析ソフトウェアでファイルを開きます。管名と前方散乱領域 FSC (A) の細胞を可視化する/高さ FSC(H) 散布するドロップ ダウン メニューから選択パラメーターをダブルクリックします。ダブレット除外ゲートを作成するには、多角形のゲートのツール アイコンをクリックして (図 1 a) のように細胞を囲みます。</li>
	<li>ゲートのセルを選択 (ダブル クリック ゲート領域) から、新しいディスプレイでボックスが FSC (A) のセルを表示するドロップ ダウン メニューのパラメーターを調整/側方散乱 SSC(A) プロットします。長方形のゲートのアイコンをクリックし、惜しみなくリンパ球、NK 細胞、顆粒球 (図 1 b) の大半を除外する前方および側面拡散プロパティに基づいて単球人口を選択します。</li>
	<li>ゲートのセルを選択し、ドロップ ダウン メニューを使用してパラメーターを選択する CD14/CD16 プロットを再表示します。多角形ゲート特性「┐」形 (図 1) に基づく単球を選択するをクリックします。</li>
	<li>ゲートのセルを選択し、パラメーターを選択するドロップ ダウン メニューを使用して、CD16/HLA-DR プロット上、単球を表示します。HLA-DR 陽性細胞を選択、残り NK 細胞と好中球17 (図 1) を排除する多角形ゲートをクリックします。</li>
	<li>ゲートのセルを選択し、ドロップ ダウン メニューを使用してパラメーターを選択する CD14/HLA-DR プロットの HLA-DR 陽性細胞を表示します。多角形ゲートをクリックし、HLA-DR 高/CD14 低細胞 (B 細胞は HLA がない CD14 の高レベルを表現) を除外するゲートを引く (図 1E)。 注: B 細胞汚染が発生し、したがって、調査する必要があります。図 1の非古典的な人口は、異なるセルの左側には、汚染が可能性があります。B 細胞非古典的な単球と重複していない場合、3.5 のステップをスキップできます。</li>
	<li>ゲートのセルを選択し、ドロップ ダウン メニューを使用して、CD16/CD14 プロット上に表示。プロット オプションから「ゼブラ プロット」サブセットの割合 (図 1 f) を決定する描画する単球サブセット ゲートを可能にするを選択します。 注:ゼブラ プロットは擬似カラー (スムース) の解析ソフトウェアで使用可能なかどうか、またはコンター プロットが適さない場合があります。</li>
	<li>長方形のゲートのアイコンをクリックし、CD14 CD16/高低、古典球人口のまわりのおおよそ長方形ゲートを描画することによって古典的な単球を選択します。「中央分離帯を表示する」を選択「表示」の下で古典的な単球の平均蛍光強度を表示します。人口が左にセルをすべて含む左右の中央から均等にゲートを調整します。</li>
	<li>古典的なゲートの右側にセルを含む長方形ゲートを描画することによって中間の人口を選択します。により、中間のサブセットに匹敵する CD14 式古典球のゲート内に完全にある同心円の下部に門を合わせ、クラシック以外のセルを除外するゲートの底を調整、現在の名目で一貫性のある主要な古典的な人口。</li>
	<li>非古典的なサブセットをゲート人口 (図 1 f) の下のすべてのセルを選択する、中間のサブセットの下端から下の長方形のボックスを描画します。</li>
	<li>「ゲートの周波数を表示する」を選択「表示」の下で各 monocyte のサブセットの割合を決定します。</li>
</ol>4. ゲーティング法の検証
<ol><li>潜在的汚染の種類の細胞が効果的にゲート アウトであるかどうかを調べるには、まず T 細胞 (サブセット CD3)、B 細胞 (CD19)、(CD66b)、好中球、NK 細胞 (CD56) に対する抗体で異なる細胞集団を特定 (図 2)。 注: ここで T 細胞と好中球単球の「┐」図形の近くに座っていないと図 1にいるゲートします。</li>
	<li>NK 細胞は 3.4 (図 1) の手順で削除された B 細胞は、図 3に示すように、ステップ (図 1E) 3.5 で削除されますを確認します。NK 細胞または B 細胞のゲート外でできない場合は、ゲートを再調整します。</li>
</ol>5. 表現型単球マーカー式
<ol><li>各 monocyte のサブセットからセルを選択します。各 monocyte のサブセット (図 1 f) の各マーカーとそのマッチング アイソタイプ (図 4) を表示するヒストグラムを作成するパラメーターのドロップダウン リストを変更します。</li>
	<li>それぞれアイソタイプ コントロールと比較してそれぞれのマーカー (中央値または幾何学的平均値) の式の次数を計算します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood.">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li><li>Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD14(bright)+CD16++monocyte+subset+is+expanded+in+rheumatoid+arthritis+and+promotes+expansion+of+the+Th17+cell+population.">The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).</li><li>Wildgruber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;Intermediate&amp;#34;+CD14++CD16++monocyte+subset+increases+in+severe+peripheral+artery+disease+in+humans.">The &amp;#34;Intermediate&amp;#34; CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans.</a> Scientific Reports. 6, 39483 (2016).</li><li>Heine, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+subpopulations+and+cardiovascular+risk+in+chronic+kidney+disease.">Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease.</a> Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+independently+predict+cardiovascular+events:+a+cohort+study+of+951+patients+referred+for+elective+coronary+angiography.">CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li><li>Bories, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+alternative+macrophage+differentiation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+obese+subjects.">Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).</li><li>Fadini, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbalanced+monocyte+polarisation+in+peripheral+blood+and+bone+marrow+of+patients+with+type+2+diabetes+has+an+impact+on+microangiopathy.">An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy.</a> Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).</li><li>Satoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+M1/M2+phenotype+of+peripheral+blood+monocytes+in+obese+diabetic+patients:+effect+of+pioglitazone.">Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone.</a> Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).</li><li>Chen, X., Devaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+from+metabolic+syndrome+subjects+exhibit+a+proinflammatory+M1+phenotype.">Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).</li><li>Williams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+classical+monocytes+display+unbalanced+M1/M2+phenotype+with+increased+atherosclerotic+risk+and+presence+of+disease.">Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease.</a> International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).</li><li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical,+intermediate,+and+nonclassical+human+monocyte+subsets.">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li><li>Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+human+intermediate+monocytes.">Phenotypic characterization of human intermediate monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+different+strategies+for+human+monocyte+subsets+gating+within+the+large-scale+prospective+CARE+FOR+HOMe+Study.">Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study.</a> Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).</li><li>Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+inflammatory+profile+is+specific+for+individuals+and+associated+with+altered+blood+lipid+levels.">Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels.</a> Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).</li><li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry.">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).</li><li>Szaloki, G., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+in+multicolor+flow+cytometry.">Compensation in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).</li><li>Abeles, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14,+CD16+and+HLA-DR+reliably+identifies+human+monocytes+and+their+subsets+in+the+context+of+pathologically+reduced+HLA-DR+expression+by+CD14(hi)+/CD16(neg)+monocytes:+Expansion+of+CD14(hi)+/CD16(pos)+and+contraction+of+CD14(lo)+/CD16(pos)+monocytes+in+acute+liver+failure.">CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).</li><li>Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Classical+monocytes+display+inflammatory+features:+Validation+in+Sepsis+and+Systemic+Lupus+Erythematous.">Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous.</a> Scientific Reports. 5, 13886 (2015).</li><li>Lundahl, J., Halld&#233;n, G., Hallgren, M., Sk&#246;ld, C. M., Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+CD11b/CD18+and+CD62L+on+human+monocytes+after+cell+preparation+procedures.">Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).</li><li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets.">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).</li><li>Dagur, P. K., McCoy, J. P., Robinson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+Storage,+and+Preparation+of+Human+Blood+Cells.">Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells.</a> Current protocols in cytometry. 73, (2015).</li><li>Einwallner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+matters:+Red+cell+lysis+with+FACS+Lyse+affects+the+flow+cytometric+enumeration+of+circulating+leukemic+blasts.">Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).</li><li>Tsujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Heterogeneity+of+Human+Peripheral+Blood+Monocyte+Subsets+on+Myocardial+Salvage+in+Patients+With+Primary+Acute+Myocardial+Infarction.">Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).</li><li>Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+lymphocyte,+monocyte+and+dendritic+cell+subsets+in+normal+rhesus+macaques+by+12-color+flow+cytometry:+Clarification+on+DC+heterogeneity.">Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity.</a> Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).</li><li>Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+protocol+for+enumeration+of+endothelial+progenitor+cells+and+monocyte+subsets+in+human+blood.">A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood.</a> Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+human+cardiovascular+disease.">Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease.</a> Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SuperSAGE+evidence+for+CD14++CD16++monocytes+as+a+third+monocyte+subset.">SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset.</a> Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).</li><li>Heimbeck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+single-platform+assay+for+human+monocyte+subpopulations:+Lower+CD14+CD16+++monocytes+in+females.">Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females.</a> Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Refined+Definition+of+Monocyte+Subsets.">Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets.</a> Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).</li><li>Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+analysis+of+monocyte+subsets+in+cardiovascular+disease.+Joint+consensus+document+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC)+Working+Groups+"Atherosclerosis+&amp;+Vascular+Biology"+and+"Thrombosis".">Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis &amp; Vascular Biology" and "Thrombosis".</a> Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).</li><li>Shantsila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+characterization+of+human+monocyte+subsets:+possible+implications+for+cardiovascular+disease+pathophysiology.">Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).</li><li>Hofer, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=slan-defined+subsets+of+CD16-positive+monocytes:+impact+of+granulomatous+inflammation+and+M-CSF+receptor+mutation.">slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation.</a> Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).</li><li>Thomas, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Blood+Monocyte+Subsets:+A+New+Gating+Strategy+Defined+Using+Cell+Surface+Markers+Identified+by+Mass+Cytometry.">Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

全血フローサイトメトリーは、感染症と炎症性条件での役割に洞察力を提供する彼らの生理学的微小環境に近い状態でセルを調べると単球の研究に理想的なアプローチです。さらに、新鮮な (すなわち、未処理) の血液サンプルは、変更またはストレージまたは18,19, 凍結融解の単球で発生すること知られているなどの処理によって発生する細胞への変換を最小限に抑えます20します。 いくつかのマーカーは、サンプルが19を処理する前に室温で保たれる誘導、プロンプトのサンプル準備お勧めします。M1 と M2 のマーカーの至適濃度は、滴定により求めたし、の変化の度合いは抗原の発現によるものですし、抗体の不足によって制限されていませんを確保しながら、非特異的結合を制限する任意の新しい抗体これ行う必要があります。赤血球細胞の除去と白血細胞換散ソリューションとの固定は、赤色の血液細胞の存在は流れ cytometry21,22を妨げることがこのプロトコルの重要なステップです。いくつかの換散のソリューションは無洗米を汚すと互換性のある、明確な集団は明らかに私たちの手で洗浄ステップを使用する場合に注意してください。
流れの cytometer の正しい設定は、単球のマーカーの発現を比較するときにも重要です。研究者コントロール ビーズの一貫したターゲット蛍光強度を維持し、異なるサンプルの間で一貫性のある結果を別の日に実行を提供するために使用する計測器の品質管理を行うことをお勧めします。これに加えて、アイソタイプ コントロールを支援非特異抗体の結合によって生成された任意の非固有バック グラウンド信号を解釈するために使用します。単球 Fc 受容体11のレベルが高い、したがって非特異的結合しやすい。注記のうち、非特異的結合のレベルは異なるサブセットの異なるし、サブセット間マーカー発現の程度を比較するときにこのようにアイソタイプ コントロールの使用が重要になります。
考慮すべきもう一つの重要な基準は採用されているゲートの手順です。いくつかの研究は FSC(A)/SSC(A) の人口を非単球 CD16 陽性細胞23,24,25のほとんどの解消を取得するプロット単球の周りタイトなゲートを描画するが、これはいくつかの損失につながる可能性があります重要な勧めFSC/SSC の球をオーバー ラップできる非単球細胞と単球26がプロットされます。むしろ、単球を汚染する可能性があります他の血液細胞を除外する CD14 と CD16、に加えて第 3 単球マーカーの包含は不可欠な26,27。このため、HLA-DR は頻繁に使用され、それは、NK 細胞や好中球17,28に示されていないので理想的であります。リンパ球 (B 細胞と T 細胞) は、HLA を述べることができる、単球 CD14 表現する点で異なります。CD86 も5,27,29を推奨されていますが、使用されませんでした HLA-DR は理想的な 3 マーカーが、また M1 マーカーだし、こうして monocyte のサブセットの発現の程度が評価されました。
使用されるゲートの戦略の検証は非常に重要です。一方、NK 細胞は、彼らは28をゲートがない場合、非 classicals と重複する知られている、我々 は B 細胞ことができる (図 2 b); 非-classicals とも重なり、気づく螢光色素選択、楽器構成、検出器感度、または検討されている病状にこれは他の研究の場合であるかどうかによって異なります。ここでは、重複する B 細胞 HLA-DR の示した高発現し、図 1における HLA-DR 陽性細胞の選択によってをゲートがないです。むしろ、B 細胞を除去する CD14 の追加プロットを用いて/HLA-DR、B 細胞が彼らの高い HLA による非 classicals から分離し、CD14 式を低します。
また自身単球のためのゲートが文学; 描かれてされている多くの異なる方法があります。さらに 1 つのサブセットが終了し、別の開始を区切るための配置で異なる (のサブセットごとの描画の別々 の箱) と長方形または台形ボックス13象限 (サブセットは象限マーカーで区切られた) が含まれます。これらの違いは、おそらくは、明らかに異なる集団としてではなく、細胞、非クラシック、古典的な区別の連続とに単球が存在している事実を反映しています。しかし、自身のサブセットを識別するためのテクニックのバリエーションは、計算された単球サブセットの割合の違いにつながることができます、ためになりますゲーティング法が合理的な客観的ではなく主観的、これ重要です堅牢性と再現性のあるメソッドになります。いくつかの研究は、古典と中間のサブセット30間の境界を決定するのに CD16 のアイソタイプ コントロールを使用します。一方、中間体と非 classicals の分離を定義する提案されている垂直または斜め、調査官、それは再現性のある、する必要があります。 されているただし書が長方形のゲートまで選択で切断線があります。研究13,30,31の間の比較を容易にするために推奨されています。ここでは、増加の客観性は、ゼブラ プロットは伝統的なコンター プロットに等しい確率の各箱に色のグラデーションを混合することによって追加の可視化キューを提供するためゼブラ プロット上のデータをプロットし、客観的視覚的ルールを適用することによって得られました。古典的なサブセットの右側の境界線は、人口は母集団のメディアンを均等に分散させるように描かれました。中間体と非 classicals の部門も古典的な集団内で同心円の下部に揃えて中間体の基盤を持っていることによって標準化された (すなわち、中間人口はっきり1標準的な命名法に従って、CD14 の高レベルを表現する)。
一方、いくつかの研究は、単球とその臨床的意義32,33を明らかにする成功の列挙を取得するため 6-スルホ LacNAc (SLAN) または (CCR2) C C ケモカイン受容体 2 型など、追加のマーカーの使用を示唆しています。、我々 の手で多くの単球機能マーカーの発現のレベルが広く個人14によって異なります。このような変化は、自分の式に基づくサブセットを定義するこれらのマーカーの有用性を制限があります。自動計算のアプローチは、視覚化し、視覚的対話型確率隣人の埋め込み (viSNE)、t 分散確率隣人を埋め込む (恒常的な)、スパニング ツリーの進行など単球サブセットをクラスターに使用されています。解析密度-正規化イベント (スペード)34,35、使用される複数のマーカーのセットに基づいてセルのビジュアル表現を提供することができます。これは単球サブセット分類のゲーティング戦略の精度を高めるために示されている、一方欠点が必要な抗体 (および対応する fluorophore チャンネル) の数であることが認識されます。その有用性について、質問がされて質問; によって異なります余分な複雑性は保障されていない、たとえば、列挙体の研究。
当社の技術でゲート単球が文献に合わせて比率を示す、3 つのサブセットによって表面マーカーの発現を容易に定めることができます。全体的にみて、技術と方法論の紹介は単球サブセットの割合を列挙して同様、それにより他のマーカーを含むように拡張することができます表面マーカー式の評価の標準化され、簡単なメソッドを提供します。各種の状況における機能的な役割を検証しています。

単球は、促進し、炎症を解決する主要な役割を果たしている白血球のタイプです。認識、古典球 (~ 85%)、中級 (~ 5%)、非古典的な (~ 10%) 単球は、分化 (CD) 14 のクラスターと CD16 式1のレベルによって特徴付けられるの 3 つの主要なサブセットがあります。中間体、中間体のレベルは心血管疾患を含むさまざまな炎症状態2,3の割合が増加するなどの疾患の有無と単球サブセットの割合が異なることが臨床イベント4,5に関連付けられています。さらに、疾患条件で単球は表面マーカー式6、7の違いによって検出可能な多くの変更と機能の変更をまた受けることができます。一例として、単球 M1 傾斜、心血管疾患、糖尿病、肥満およびメタボリック シンドローム7,8,9で観察された M1 マクロファージに関連付けられたマーカーの増加,10。
単球サブセットの割合と機能を評価するためにフローサイトメトリーの人気にもかかわらず、サンプル準備およびサブセットはこのような研究の調査結果を比較することは困難になる研究間ゲートにかなり変動があります。重要なは、単球サブセットの分界のコンセンサスがないまだ標準化されたアプローチは不可欠ないくつかの疾患でサブセットの割合で変化の臨床的意義を与えられました。ゲートの難しさの一部は非古典的なサブセット11中間を通して古典的な区別の単球と単球が異なる集団12 よりもむしろ連続スペクトルとして存在するなどという事実から生じる.興味深いことに、ザワダらは、いずれか、長方形または台形ゲートの中間のサブセットを使用して、両方の結果を心血管エンドポイント13を予測したより高い中間のサブセットを示した。これは、少なくともプロポーションを計算する、重要な問題は戦略を適用する一貫性のあるゲート間異なるサンプル (研究)、決定的にサブセットを区別しようとするのではなくを示しています。決定的なゲートは、関数を評価するときより重要かもしれないが、サブセット間マーカー式の変更はインクリメンタル12,14, とゲートの一貫性、おそらくキーのもう一度、したがって。そのため、目的の異なるサンプル間単球サブセットを再現性をもって配分法をゲートが必要です。ここで紹介した方法の目的は、明確な説明と単球サブセットをゲートに、ゲーティング技術の正当性の採用しこのようにして研究者を可能にする手法を提供する表面マーカー式のサブセットを評価この手法の異なるサンプルを評価する際の使用で安心。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>7128959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style)</td>
			<td>Invitro technologies</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [M&#966;P9]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8]</td>
			<td>Abcam Australia</td>
			<td>ab140477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1 &#954; Isotype Control [MOPC-21]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Lot # 4283901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556018</td>
			<td>Lot # 2335626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558592</td>
			<td>Lot # 36768</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555658</td>
			<td>Lot # 3109766</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561001</td>
			<td>Lot # 3228959</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2A Isotype control [20102]</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC003P</td>
			<td>Lot # 1212031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235]</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB226P</td>
			<td>Lot # 612051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control [MOPC-21]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Lot # B220359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>336107</td>
			<td>Lot # B143544</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347347</td>
			<td>Lot # 3010929</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561741</td>
			<td>Lot # 2307721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561903</td>
			<td>Lot # 3011796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305105</td>
			<td>Lot # B154037</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiLyse C</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A11895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic haematology analyser, XT-1800i</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge GS-6R</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software v10.0.7</td>
			<td>Tree Star Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of human monocyte subsets by whole blood flow cytometry analysis

単球が様々 な炎症性疾患で重要な投稿者とサブセットの割合などの機能、これらの細胞に変化が病理学的意義を持つことができます。単球への変更を調べるための理想的な方法は、この方法による試料の最小の処理制限人工細胞の活性化全血フローサイトメトリー。ただし、さまざまなアプローチは、研究間のサブセットの矛盾の識別につながる単球サブセットをゲートにされます。ここで我々 は識別し、人間の monocyte のサブセット (古典, 中間, と非古典) を特徴付ける全血フローサイトメトリーを使用してメソッドを示します。フローサイトメトリー用血液サンプルを準備、ゲート (汚染のセルが削除されていることを確認) サブセット、および表面のマーカーの単球サブセットを特定する方法の概要を説明-この例で M1 と M2 のマーカー。単球サブセットの割合や他の機能のマーカーの単球サブセットの式を評価するため標準的なゲートの開閉方法を必要とする他の研究には、このプロトコルを拡張できます。

単球ゲート戦略と流れの cytometry 分析ここで使用される (図 1) 単球サブセットをゲートし、相対的な比率を明らかにしました。(この例の割合は 88.1 %classicals, 4.33% 中間 7.49% 非-classicals と計算されました。これらのサブセットのゲートで B 細胞、T 細胞、好中球や NK 細胞マーカー CD19、CD3、CD56、CD66b、それぞれ確認された汚染は。他の人口の相対的な位置を評価することによって T 細胞と好中球は CD16/CD14 プロット (図 2 aおよび2 D) 単球「┐」図形の外側も落ちることは明らかです。ただし、NK 細胞と B 細胞の両方は非古典的な単球人口 (図 2 bおよび2 C) と重なります。NK 細胞 (図 3 a) と B 細胞 (図 3 b) を除外する (図 1と1E) ゲート戦略のステップを認めた。B 細胞の人口には、非古典的な単球のごく一部が含まれています、量はごくわずかだった。
サブセットは、彼らが異なる表面マーカー、M1 を表現度を持つゲート (CD64、CD86、CD120b) と M2 (CD163、CD11b、CD93) 評価されました。ヒストグラム (図 4) のシフトを見てマーカーを肯定的な表現に対応するアイソタイプ コントロールと比較して示した。アイソタイプ コントロールよりもマーカーの中央値が大きかった。
このゲート戦略の 4 つの管に分割された、血のサンプルへの適用はステンド グラスし、個別に、チューブ (表 4) の利回りと同等の結果を分析します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg"> 図 1: 代表的な単球全体の人間の血で戦略をゲーティングします。(A) FSC(A)対FSC(H) プロット: ゲーティング セル面積と高さを持つ、塊を取り除き (FSC(H)) および破片 (非常に低い FSC) を基準として大きい FSC(A) K = 1000。(B) FSC(A)対SSC(A) プロット: SSC/FSC プロパティに基づいて単球の幅広い選択。(C) CD16対CD14 プロット: その特性「┐」形状に基づく単球を選択するゲート。(D) CD16対HLA-DR プロット: ゲーティング HLA-DR 陽性細胞を選択し、NK 細胞を削除します。(E) CD14対HLA-DR: 単球から B 細胞 (HLA CD14 高/低) を除外するゲート。(F) 単球単球サブセットをゲートにプロット対CD14 CD16 に再び表示されますを選択します。A ~ F の色は、青と緑色の低密度、赤と高密度を示すオレンジとミッドレンジ密度を示すオレンジの細胞密度を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg"> 図 2: 潜在的汚染細胞の同定戦略をゲートの検証します。可能性のある汚染細胞がマーカーで示された(A) T 細胞 (サブセット CD3)、(B) B 細胞 (CD19)、(C) NK 細胞 (CD56) および (D) 好中球 (CD66b)。左側パネル地図を高細胞密度を表す色で図 1 aと1 b、に従ってゲーティング後各集団の識別を低 (青) (赤)。右側にあるパネルを表示各細胞集団 (青) 単球 (赤) にこれらの集団の近さを明らかにする最終的な単球 CD16/CD14 プロットの上に重ね。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg"> 図 3: ゲーティング手順が汚染のセルを削除することを確認します。熱マップ (青) CD56 (A) と (B) CD19 の高低 (赤) からの表現の程度を示します。ゲートの手順が正常に高い CD56 を持つセルを除外 (NK 細胞) と高い CD19 (B 細胞)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg"> 図 4: M1 の単球式 (CD120b) と M2 (CD93) マーカー 。平滑化されたヒストグラム単球 M1 と M2 のマーカー式 (青)、(A) classicals、中間体 (B)、(C) 非-classicals (赤)、アイソタイプから明確なシフトを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>抗体</td>
			<td>量 (50 μ L の血液)</td>
			<td>ボリューム (16 x) 800 μ L の血液</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14 - V450</td>
			<td>0.75 Μ L</td>
			<td>12 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16 - APC</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
			<td>8 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA DR PerCP</td>
			<td>0.625 Μ L</td>
			<td>10 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 抗体の全血流・ マスター ミックス。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>チューブ</td>
			<td>PE 抗体</td>
			<td>コード</td>
			<td>アイソタイプの一致</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>作業ボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.0 μ g/20 μ L</td>
			<td>0.625 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.125 μ g/20 μ L</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.06 μ g/20µL</td>
			<td>10 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.0 μ g/20 μ L</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1.0 μ g/20 μ L</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1.0 μ g/20 μ L</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Igg2a 産</td>
			<td>R & D (IC003P)</td>
			<td>NA</td>
			<td>25 μ g/mL</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>R & D (FAB226P)</td>
			<td>R & D igg2a 産</td>
			<td>25 μ g/mL</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
			<td>2.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>BL IgG1</td>
			<td>50 μ G/ml</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: M1 ・ M2-PE 螢光色素標識全体の血流のためのモノクローナル抗体です。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>チューブ</td>
			<td>抗体</td>
			<td>作業ボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>CD3</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>CD19</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>CD66b</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>CD56</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: PE 螢光色素標識、リンパ球 (T 細胞、B 細胞)、好中球、NK 細胞に対するモノクローナル抗体です。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>チューブ</td>
			<td>% クラシック</td>
			<td>% 中級</td>
			<td>非古典 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.11</td>
			<td>10.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>84.2</td>
			<td>5.05</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.03</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>81.6</td>
			<td>5.03</td>
			<td>12.1</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: 単球サブセット比率 1 つ血液サンプル染色し、個別に分析します。

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

ここで全血フローサイトメトリーによる単球サブセットを特徴付けるためのプロトコルを提案する.これには、サブセットのゲートおよび表面マーカーの発現を評価する方法を概説し、(炎症性) M1 と M2 マーカー (抗炎症) の式の評価の例を与えることが含まれます。

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

この手法は、免疫学分野の主要な質問に答える助けとなります。例えば、疾患状態における単球サブセットの割合、または異なるマーカーの発現がどのように変化するかを決定する。この手法の主な利点は、細胞がネイティブ状態に近い、そして明確な指示と正当化が使用され、標準化された格言法を提供することです。一般的に、この方法に新しい個人は、多くの論文が細胞の格座がどのように行われたかについて明確な指示を与えていないので、苦労するかもしれません。テキストプロトコルで詳述されているように、血液サンプルの収集と白血球数の決定でこのプロトコルを開始します。リン酸緩衝生理食塩水で血液を希釈し、1ミリリットル当たり約500万個の白血球に濃度を調整する。血液、抗CD14-V450、抗CD16-APCおよび抗HLA-DR-PerCPを組み合わせることによって、チューブの数のための十分なマスターミックスを準備します。各チューブに51.9マイクロリットルの混合の渦およびピペット。PE標識M1およびM2マーカー抗体、ならびにT細胞、B細胞、好中球、およびナチュラルキラー細胞のマーカーを対応するチューブに加えます。渦と暗闇の中で摂氏4度で30分間インキュベートします。さて、赤血球溶解と白血球固定溶液を合わせた250マイクロリットルを加え、すぐに混合物を穏やかに渦液にします。渦液混合物を暗闇の中で摂氏4度で10分間インキュベートします。10分後、PBSを250マイクロリットル加え、室温で10分間、260gで細胞をスピンダウンします。上清を取り除き、細胞を1%ホルムアルデヒドの300マイクロリットルで再懸濁する。細胞を摂氏4度で保存し、分析が行われるまで光から保護します。フローサイトメトリーは、サンプル調製の48時間以内に行う必要があります。まず、フローサイトメーターのログをチェックして、施設スタッフが品質管理チェックを行っていることを確認します。フローサイトメトリー実験を設定するには、新しい実験をクリックし、新しい標本と新しいチューブをクリックしてチューブを追加します。アイコンをクリックして二変量プロットを選択し、ドロップダウンメニューを使用してアクセスパラメータを選択します。CD16/CD14プロットと時間と共に検出器を表示するプロットを含めて、取得を監視します。チューブを挿入し、クリックし、取得します。計測器の電圧設定を確認し、検出器の信号がスケールをオフにしていないことを確認します。CD14/CD16プロットの単球ゲートに落ちる細胞を観察します。記録しきい値を 5,000 イベントに設定し、レコードをクリックします。残りのチューブのデータを記録し続けます。すべてのチューブのデータが記録されたら、解析のためにフローデータを fcs ファイルとしてエクスポートします。単球ゲートを実行するには、解析ソフトウェアでファイルを開き、チューブ名をダブルクリックし、ドロップダウンメニューからパラメータを選択して、前方散乱領域と前方散乱高さプロットのセルを視覚化します。ポリゴン ゲート ツール アイコンをクリックし、セルを囲んで、二重除外ゲートを作成します。ゲート領域をダブルクリックして、ゲートセルを選択します。新しい表示ボックスで、ドロップダウンメニューパラメータを調整して、前方散布領域と側面散布図のセルを表示します。長方形のゲートアイコンをクリックし、前方および側面散乱特性に基づいて、単球集団を寛大に選択して、リンパ球、ナチュラルキラー細胞および顆粒球の大部分を除外する。ゲートセルを選択し、CD14/CD16 プロットで再表示し、ドロップダウンメニューを使用してパラメータを選択します。ポリゴン ゲートをクリックして、その特性、反転 l 形状に基づいて単球を選択します。非古典的な集団が細胞から左に区別されない場合、汚染が発生する可能性が高く、調査する必要があります。ゲートセルを選択し、CD/16 HLA-DR プロットで単球を表示するには、ドロップダウンメニューを使用してパラメータを選択します。ポリゴンゲートをクリックしてHLA-DR陽性細胞を選択し、残りのナチュラルキラー細胞と好中球を除外します。ゲートセルを選択し、パラメータを選択するためのドロップダウンメニューを使用して、CD14/HLA-DRプロット上にHLA-DR陽性セルを表示します。ポリゴン ゲートをクリックし、ゲートを描画して HLA-DR ハイ/CD14 低 B セルを除外します。ゲートセルを選択し、ドロップダウンメニューを使用してCD16/CD14プロットに表示します。プロットオプションから、単球サブセットゲートを描画できるゼブラプロットを選択して、サブセットの比率を決定します。さて、長方形のゲートアイコンをクリックし、CD14高/CD16低古典的な単球集団の周りに近似長方形のゲートを描くことによって、古典的な単球を選択します。ディスプレイの下で、選択して中央値を示し、古典的な単球の蛍光強度の中央値を表示する。母集団が左と右の中央値から等しい分布を持ち、左のすべてのセルを包含するようにゲートを調整します。古典的なゲートの右側にあるセルを囲む長方形のゲートを描画して、中間母集団を選択します。ゲートの下部を調整して非古典的なセルを除外し、古典的な単球ゲート内にある同心円の底にゲートを整列させます。非古典的なサブセットをゲートし、中間サブセットの下端から下に矩形のボックスを描き、すべてのセルを母集団の下端まで選択します。[表示]で、[ゲート周波数を表示]を選択して、各単球サブセットの割合を決定します。最後に、各単球サブセットからセルを選択します。ドロップダウン パラメータを変更して、各マーカーを表示する各単球サブセットのヒストグラムを作成します。次に、テキストプロトコルに記載されているように、中央値または幾何平均を用いて式の程度を計算する。正しくゲートされた単球集団がここに示されています。そして、プロポーションは文献のものと一致しています。このサンプルの割合は、88.1%古典、4.33%中間体、7.49%非古典的として計算された。他の集団の相対的な位置を評価することによって、ここに示すT細胞および好中球が青色で、CD16/CD14プロット上の単球、反転l形状の外側によく従うことは明らかである。しかしながら、ナチュラルキラー細胞とB細胞集団の両方が、ここに青色で示され、非古典的な単球集団と重なった。汚染する細胞タイプが除去されたことを確認するヒートマップを、ここに示す。ナチュラルキラー細胞はHLA-DR CD16ステップによってゲートアウトされているのに対し、B細胞はHLA-DR CD/14ステップによってゲートアウトされている。M1 および M2 マーカーの表現を、赤で示したアイソタイプ コントロールに対して、青で示します。CD120bはM1マーカーであり、そのアイソタイプ制御の上に、すべての単球サブセットについて明確なシフトを示す。これは、CD93のM2マーカーの場合でもあり、表現は古典的に高く、中間体では中程度で、非古典では低い。この手順を試みる間、汚染細胞は定量化された表現に寄与する可能性があるため、必ず汚染細胞がゲートアウトされていることを覚えておくことが重要です。この手順に従って、他のマーカーを調べてもよい。病気における単球マーカー発現の変化などの追加の質問に答えるために。人間の血液やホルムアルデヒドを使用することは危険であり、個人的な保護具やバイオハザードフードの使用などの予防措置は、常にこの手順を実行するときに取られるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...