Name: characterization of human monocyte subsets by whole blood flow cytometry analysis
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Flowcytometri ble utført i Flow cytometri Core anlegget som støttes av Westmead Institutt for medisinsk forskning, Westmead forskning Hub, Cancer Institute New South Wales, og National Health and Medical Research Council. Denne studien ble støttet av klinisk kjemi forskning og utdanning fondet.

Denne studien har blitt godkjent av WSLHD menneskelige forskning etikk (HREC) (godkjenning AU RED HREC/15/WMEAD/289).
1. sample forberedelse til fullblod flowcytometri
Merk: Menneskelig blod er potensielt, prøve opplegget skal utføres i en biohazard hette.
<ol><li>Samle blodprøvene fra deltakerne i 3 mL etylen diamine tetra eddiksyre (EDTA) rør.</li>
	<li>Avgjøre antallet hvite blodlegemer (WBC) bruker en hematologi analyzer eller hemocytometer.</li>
	<li>Fortynnet med fosfat bufret saltvann (PBS) (pH ~ 7.4) å justere til konsentrasjonen til ~ 5 x 106 WBC/mL.</li>
	<li>Forbered tilstrekkelig master blanding av rør (f.eks for 14 rør, forberede 16 x master mix) ved kombinerer 16 x mengder 50 µL blod, 0,75 µL anti CD14-V450, 0,5 µL anti CD16-APC, og 0.625 µL anti HLA-DR-PerCP. Vortex og pipette 51.9 µL av blandingen i hver rør (tabell 1). Merk: Antistoffer bør være titreres for å bestemme optimale flekker konsentrasjoner for fluorescerende antistoffer brukes.</li>
	<li>Legg til overflaten markør (M1 og M2 eller isotype kontroll, phycoerythrin (PE) merket) antistoffer (eksempel per tabell 2) og PE merket markører for T-celler (CD3), B-celler (CD19), nøytrofile (CD66b), og naturlig killer (NK) celler (CD56) (tabell 3). Vortex og Inkuber i 30 min, 4 ° C i mørket. Merk: Markører for lymfocytter, nøytrofile og NK celler er inkludert bare for validering av metoden gating.</li>
	<li>Legge til 250 µL av kombinerte røde blodlegemer lysis/WBC fikse løsning, vortex forsiktig umiddelbart, og ruge i 10 min i mørket på 4 ° C.</li>
	<li>Legge til 250 µL PBS og spinn celler ned på 260 x g i 10 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Fjern nedbryting, å suspendere celler i 300 µL av 1% formaldehyd. Merk: Formaldehyd er giftig. Bruk nitrilhansker og i avtrekksvifte.</li>
	<li>Lagre på 4 ° C beskyttet fra lys før analysen utføres. Merk: Flyt analyse bør gjøres innen 48 timer prøve forberedelser.</li>
</ol>2. flowcytometri
<ol><li>Sjekk flyt cytometer Logg å sikre anlegget ansatte har utført kvalitetskontroller. Merk: For å sikre konsekvens mellom analyser, instrument kvalitetskontroll og opprettholde konsekvent målet fluorescens intensiteter bruker kontroll perler anbefales.</li>
	<li>Sette opp flyt cytometri eksperimentet, klikk på "nytt eksperiment deretter"ny prøve"og"ny tube"legge rør. Velg bivariate plott ved å klikke på ikonet og bruke rullegardinmenyene til å velge parameterne akse. Sikre inkludering av en CD16/CD14 plott og et plott viser en detektor sammen med tid å overvåke oppkjøpet.</li>
	<li>Sett røret og klikk "Hent". Kontroller instrument spenning innstillingene for å sikre at detektor signaler ikke er av skalaen.</li>
	<li>Merke celler i monocytt porten av CD14/CD16 handlingen. Angi opptak terskelen til 5.000 arrangementer for klassisk monocytt gate og klikk på "Record".</li>
	<li>Fortsette å registrere data for gjenværende rør. Når dataene for alle rør er registrert, kan du eksportere flyt data som .fcs filer for analyse. Merk: For å sikre nøyaktighet, enkelt erstatning kontroller skal registreres. En kompensasjonsmatrise kan beregnes og brukt på dataene før analyse å gjøre rede for spectral oljeutslipp over15,16.</li>
</ol>3. monocyte Gating
<ol><li>Åpne filer i analyseprogramvare. Dobbeltklikk tube navn og velg parametere fra rullegardinmenyene til å visualisere cellene i en frem scatter arealet FSC / videresende spredningsdiagram høyde FSC(H). Opprette en doublet utelukkelse gate ved å klikke på verktøysymbolet polygon gate og tilhørende cellene som (figur 1A).</li>
	<li>Merk gated cellene (ved å dobbeltklikke på gated regionen) og i den nye skjermen boksen justere dropdown menyen parametere for å vise cellene på en FSC (A) / side scatter SSC(A) plot. Klikk på ikonet rektangulære gate og sjenerøst Velg monocytt befolkningen basert på fremover og side scatter egenskaper å utelate fleste lymfocytter NK celler og granulocytter (figur 1B).</li>
	<li>Velg gated cellene og vise på CD14/CD16 tomten, velge parametre ved å bruke rullegardinmenyene. Klikk polygon porten velge monocytter basert på karakteristisk "┐" formen (figur 1 c).</li>
	<li>Velg gated cellene og vise monocytter på CD16/HLA-DR tomten ved å bruke rullegardinmenyene til å velge parametere. Klikk polygon porten å velge HLA-DR positiv cellene og ekskludere eventuelle gjenværende NK celler og nøytrofile17 (figur 1 d).</li>
	<li>Velg gated cellene og vise HLA-DR positiv cellene på CD14/HLA-DR tomten bruke rullegardinmenyer til å velge parametere. Klikk på en polygon og tegn en gate for å utelate HLA-DR høy/CD14 lav cellene (B celler uttrykke høye nivåer av HLA-DR men ikke CD14) (figur 1E). Merk: B celle forurensning kan oppstå og derfor bør undersøkes. Hvis den ikke-klassiske befolkningen i figur 1 c ikke er forskjellig fra cellene til venstre, deretter er forurensning sannsynlig. Steg 3.5 kan hoppet hvis B-celler ikke er overlapper med ikke-klassiske monocytter.</li>
	<li>Velg gated cellene og bruke rullegardinmenyer til å vise dem på en CD16/CD14 tomt. Velg "Zebra tomten" som gjør monocytt delsett porter skal trekkes for å fastslå delsett proporsjoner (figur 1F) plot alternativer. Merk: hvis sebra tomten er utilgjengelig på analyseprogramvare, pseudo farge (glatte) eller kontur tomten kan være egnet.</li>
	<li>Klikk på ikonet rektangulære gate og velg de klassiske monocytter ved å tegne en omtrentlig rektangulære gate rundt CD14 høy/CD16 lav, klassisk monocytt befolkningen. Velg "Vis medians" under "Vis" vise median fluorescens intensiteten for klassisk monocytter. Justere porten slik at befolkningen har en lik fordeling fra medianen på venstre og høyre omfatter alle cellene til venstre.</li>
	<li>Velg middels befolkningen ved å tegne et rektangulært gate som omfatter cellene til høyre for klassisk porten. Justerer bunnen av porten ekskludere ikke-klassiske cellene ved å justere gate med bunnen av de konsentriske sirklene som er helt innenfor klassisk monocytt porten, som sikrer at mellomliggende delsettet har et CD14 uttrykk sammenlignes med den Hovedformålet klassisk befolkningen samsvar med gjeldende nomenklaturen.</li>
	<li>Gate ikke-klassiske delsettet ved å tegne en rektangulær boks fra nedre kant av mellomliggende delsettet, velge alle cellene til bunnen av befolkningen (figur 1F).</li>
	<li>Velg "Vis gate frekvenser" under "Vis" å finne ut prosentandelen av hvert monocytt delsett.</li>
</ol>4. validering av Gating metode
<ol><li>For å avgjøre om potensielt skadelige celletyper effektivt gated ut, først identifisere ulike celle populasjoner med antistoffer mot T-celler (CD3), B-celler (CD19), nøytrofile (CD66b) og NK celler (CD56) (figur 2). Merk: Her T celler og nøytrofile ikke sitte nær "┐" form av monocytter er gated ut i figur 1 c.</li>
	<li>Kontroller at celler NK er fjernet i trinn 3.4 (figur 1 d), og B-cellene er fjernet i trinn 3.5 (figur 1E) som vist i Figur 3. Hvis celler NK eller B-celler ikke er gated ut, re-justere portene.</li>
</ol>5. fenotypiske Monocyte markør uttrykk
<ol><li>Merk cellene fra hver monocytt delsett. Endre dropdown parametere for å opprette et histogram for hvert monocytt delsett (figur 1F) hver indikator og dens samsvarende isotype (Figur 4).</li>
	<li>Beregne graden av uttrykk for hver merketråd (median eller geometriske gjennomsnittet) sammenlignet med respektive isotype kontrollen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood.">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li><li>Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD14(bright)+CD16++monocyte+subset+is+expanded+in+rheumatoid+arthritis+and+promotes+expansion+of+the+Th17+cell+population.">The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).</li><li>Wildgruber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;Intermediate&amp;#34;+CD14++CD16++monocyte+subset+increases+in+severe+peripheral+artery+disease+in+humans.">The &amp;#34;Intermediate&amp;#34; CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans.</a> Scientific Reports. 6, 39483 (2016).</li><li>Heine, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+subpopulations+and+cardiovascular+risk+in+chronic+kidney+disease.">Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease.</a> Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+independently+predict+cardiovascular+events:+a+cohort+study+of+951+patients+referred+for+elective+coronary+angiography.">CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li><li>Bories, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+alternative+macrophage+differentiation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+obese+subjects.">Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).</li><li>Fadini, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbalanced+monocyte+polarisation+in+peripheral+blood+and+bone+marrow+of+patients+with+type+2+diabetes+has+an+impact+on+microangiopathy.">An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy.</a> Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).</li><li>Satoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+M1/M2+phenotype+of+peripheral+blood+monocytes+in+obese+diabetic+patients:+effect+of+pioglitazone.">Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone.</a> Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).</li><li>Chen, X., Devaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+from+metabolic+syndrome+subjects+exhibit+a+proinflammatory+M1+phenotype.">Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).</li><li>Williams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+classical+monocytes+display+unbalanced+M1/M2+phenotype+with+increased+atherosclerotic+risk+and+presence+of+disease.">Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease.</a> International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).</li><li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical,+intermediate,+and+nonclassical+human+monocyte+subsets.">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li><li>Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+human+intermediate+monocytes.">Phenotypic characterization of human intermediate monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+different+strategies+for+human+monocyte+subsets+gating+within+the+large-scale+prospective+CARE+FOR+HOMe+Study.">Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study.</a> Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).</li><li>Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+inflammatory+profile+is+specific+for+individuals+and+associated+with+altered+blood+lipid+levels.">Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels.</a> Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).</li><li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry.">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).</li><li>Szaloki, G., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+in+multicolor+flow+cytometry.">Compensation in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).</li><li>Abeles, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14,+CD16+and+HLA-DR+reliably+identifies+human+monocytes+and+their+subsets+in+the+context+of+pathologically+reduced+HLA-DR+expression+by+CD14(hi)+/CD16(neg)+monocytes:+Expansion+of+CD14(hi)+/CD16(pos)+and+contraction+of+CD14(lo)+/CD16(pos)+monocytes+in+acute+liver+failure.">CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).</li><li>Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Classical+monocytes+display+inflammatory+features:+Validation+in+Sepsis+and+Systemic+Lupus+Erythematous.">Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous.</a> Scientific Reports. 5, 13886 (2015).</li><li>Lundahl, J., Halld&#233;n, G., Hallgren, M., Sk&#246;ld, C. M., Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+CD11b/CD18+and+CD62L+on+human+monocytes+after+cell+preparation+procedures.">Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).</li><li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets.">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).</li><li>Dagur, P. K., McCoy, J. P., Robinson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+Storage,+and+Preparation+of+Human+Blood+Cells.">Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells.</a> Current protocols in cytometry. 73, (2015).</li><li>Einwallner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+matters:+Red+cell+lysis+with+FACS+Lyse+affects+the+flow+cytometric+enumeration+of+circulating+leukemic+blasts.">Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).</li><li>Tsujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Heterogeneity+of+Human+Peripheral+Blood+Monocyte+Subsets+on+Myocardial+Salvage+in+Patients+With+Primary+Acute+Myocardial+Infarction.">Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).</li><li>Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+lymphocyte,+monocyte+and+dendritic+cell+subsets+in+normal+rhesus+macaques+by+12-color+flow+cytometry:+Clarification+on+DC+heterogeneity.">Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity.</a> Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).</li><li>Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+protocol+for+enumeration+of+endothelial+progenitor+cells+and+monocyte+subsets+in+human+blood.">A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood.</a> Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+human+cardiovascular+disease.">Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease.</a> Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SuperSAGE+evidence+for+CD14++CD16++monocytes+as+a+third+monocyte+subset.">SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset.</a> Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).</li><li>Heimbeck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+single-platform+assay+for+human+monocyte+subpopulations:+Lower+CD14+CD16+++monocytes+in+females.">Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females.</a> Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Refined+Definition+of+Monocyte+Subsets.">Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets.</a> Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).</li><li>Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+analysis+of+monocyte+subsets+in+cardiovascular+disease.+Joint+consensus+document+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC)+Working+Groups+"Atherosclerosis+&amp;+Vascular+Biology"+and+"Thrombosis".">Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis &amp; Vascular Biology" and "Thrombosis".</a> Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).</li><li>Shantsila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+characterization+of+human+monocyte+subsets:+possible+implications+for+cardiovascular+disease+pathophysiology.">Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).</li><li>Hofer, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=slan-defined+subsets+of+CD16-positive+monocytes:+impact+of+granulomatous+inflammation+and+M-CSF+receptor+mutation.">slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation.</a> Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).</li><li>Thomas, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Blood+Monocyte+Subsets:+A+New+Gating+Strategy+Defined+Using+Cell+Surface+Markers+Identified+by+Mass+Cytometry.">Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Fullblod flowcytometri er en ideell tilnærming til å studere monocytter som cellene er undersøkt i forhold nær sine fysiologiske microenvironment gir et innblikk i deres roller i infeksjon og inflammatoriske tilstander. Videre bruk av fersk (dvs. ikke behandlet) blodprøver minimerer endringer eller cellen transformasjoner som kan skyldes lagring eller håndtere18,19, som de oppstå med fryse-tint monocytter 20. rask eksempel forberedelse anbefales som noen markører er upregulated hvis prøver oppbevares ved romtemperatur før behandling19. De optimale konsentrasjonene av M1 og M2 merkene ble fastsatt av titrering, og dette bør gjøres for noen nye antistoff begrense uspesifisert bindingen samtidig som at graden av Skift av antigen uttrykk og ikke begrenset av mangel på antistoff. Fjerning av røde blodlegemer og fiksering av hvite blodlegemer lysis løsning er et viktig skritt i denne protokollen som tilstedeværelse av røde blodlegemer kan forstyrre flyten cytometri21,22. Merk at mens noen lyse løsninger er kompatibel med no-vask flekker, klarere populasjoner er tydelig i våre hender når en wash trinn.
Riktig oppsett av flyt-cytometer er også avgjørende når man sammenligner uttrykket av monocyte markører. Vi anbefaler at forskere opprettholde konsekvent målet fluorescens intensiteter av kontroll perler og utføre kvalitetskontroll på instrumentet brukes til å gi konsistente resultater på tvers av forskjellige prøver kjøre på ulike dager. I tillegg brukes isotype kontroller til å bistå i tolkningen av alle ikke-spesifikk bakgrunn signal generert av ikke-spesifikke antistoffer bindingen. Monocytter har høye nivåer av Fc reseptorer11 og derfor er utsatt for ikke-spesifikk bindende. Av notatet, nivået av ikke-spesifikk bindingen er forskjellig for ulike delsettene, og dermed bruk av en isotype kontroll blir viktig når du sammenligner graden av markør uttrykk mellom undergrupper.
Et annet viktig kriterium vurderes er gating trinnene ansatt. Noen studier antyder at det er avgjørende for å trekke en stram gate rundt monocytt befolkningen i FSC(A)/SSC(A) plot å kvitte seg med de fleste av de ikke-monocytic CD16 positive celler23,24,25, men dette kan føre til tap av noen monocytter som ikke-monocytt celler kan overlappe monocytter på FSC/SSC tomter26. Hvis du vil utelate noen andre blod celler som kan smitte av monocytter, er heller inkludering av en tredje monocytt markør i tillegg CD14 og CD16, essensielle26,27. Derfor HLA-DR brukes ofte og er ideelt som det ikke er uttrykt av NK celler eller nøytrofile17,28. Men lymfocytter (B-celler og T celler) kan uttrykke HLA-DR, avviker de fra monocytter i forhold til CD14 uttrykk. Mens HLA-DR er en ideell tredje, CD86 også anbefaler5,27,29 , men ikke som det er også en M1 markør og dermed graden av uttrykk på monocytt delsett ble vurdert.
Validering av gating strategien som brukes er av avgjørende betydning. Mens Celler NK er kjent for å overlappe med ikke-classicals hvis de ikke er gated ut28, ser vi at B-cellene også kan overlappe med den ikke-classicals (figur 2B); om dette er tilfelle i andre studier kan avhenge av fluorochrome valg, instrument konfigurasjon, detektor følsomhet eller selv sykdom tilstanden undersøkt. Her, overlappende B celler viste høy uttrykk for HLA-DR og var ikke gated ut av HLA-DR positiv celleutvalg i figur 1 d. Snarere for å fjerne B celler vi brukte en ekstra tomten av CD14 / HLA-DR, der B-cellene skille ut fra ikke-classicals på grunn av deres høyere HLA-DR og lav CD14 uttrykk.
Det er også mange forskjellige måter som portene for monocytter selv har blitt trukket i litteraturen; Disse inkluderer kvadranter (delsettene skilles med kvadrant markører) og rektangulære eller trapes13 (med separate bokser trukket for hver undergruppe) som videre varierer i plasseringen skildre der ett delsett slutter og en annen begynner. Disse forskjellene sannsynligvis gjenspeiler det faktum at monocytter finnes som et kontinuum av celler, skille fra klassisk til ikke-klassiske, ikke som tydelig atskilt populasjoner. Men fordi variasjoner i teknikker for å identifisere delsettene seg kan føre til forskjeller i beregnede monocytt delsett proporsjonene, blir det viktig at metoden gating er rimelig objektiv, i stedet for subjektive, da dette vil gjør metoden mer robust og reproduserbar. Noen studier bruker en isotype kontroll for CD16 for å finne grensen mellom klassisk og mellomliggende delsett30. På den annen side, hvis du vil angi avstanden mellom intermediates og ikke-classicals, har det blitt foreslått at cut-off linjen kan være vertikal eller skrå, med valg etterforskerne, forbehold om som det skal være reproduserbare, men en rektangulær gate har vært anbefalt å lette sammenligninger mellom studier13,30,31. Her, ble økt objektivitet oppnådd ved å plotte dataene på zebra tomten og bruke objektive visuelle regler, fordi sebra tomter gir en ekstra visualisering stikkordet ved å blande fargen gradient til hver lik sannsynlighet hylle over en tradisjonell kontur tomt. Høyre kant av klassisk delsettet ble trukket slik at befolkningen var jevnt fordelt rundt befolkningen medianen. Mellomprodukter og ikke-classicals ble også standardisert ved foten av intermediates justere med bunnen av de konsentriske sirklene i klassisk befolkningen (dvs. den mellomliggende befolkningen klart uttrykker høye nivåer av CD14, som standard nomenklatur1).
Mens noen studier har antydet bruk av ekstra markører, som C-C chemokine reseptor type 2 (CCR2) eller 6-sulfo LacNAc (SLAN) for å oppnå vellykket opplisting av monocytter og å avsløre deres klinisk betydning32,33 , i våre hender uttrykk for mange monocytt funksjonelle varierer mye mellom individer14. Slike variasjoner kan begrense nytten av disse markørene til å definere delsett basert på deres uttrykk. Automatisert computational tilnærminger har også blitt brukt til å visualisere og klynge monocytt delsett inkludert visuelle interaktive Stokastisk nabo innebygging (viSNE), t-distribuert Stokastisk nabo innebygging (tSNE) eller Spanning tree progresjon Analyse av tetthet-normalisert hendelser (SPADE)34,35, som kan gi visuell representasjon av cellene basert på settet til flere merker som brukes. Mens dette har vist seg å øke nøyaktigheten av gating strategien i monocytt delsett klassifisering, er det anerkjent som en ulempe er antall antistoffer (og tilsvarende fluorophore kanaler) kreves. Dens nytte avhenger på spørsmålene blir stilt; ekstra kompleksitet kan ikke være berettiget, for eksempel i opplisting studier.
Monocytter gated med våre teknikken viser proporsjoner i tråd med litteratur og uttrykk for overflate markører av tre delsettene kan bestemmes lett. Total, teknikk og metode forklart her gir en standardisert og grei metode for opplisting monocytt delsett proporsjoner og vurdere overflaten markør uttrykk som kan utvides med andre markører også, og dermed validere sin funksjonelle rolle i ulike andre forhold.

Monocytter er en type av hvite blodceller som spiller en viktig rolle i å fremme og løse betennelse. Det er tre viktigste delsett av monocytter anerkjente, klassisk (~ 85%), middels (~ 5%) og ikke-klassiske (~ 10%) monocytter, som kjennetegnes av graden av cluster for differensiering (CD) 14 og CD16 uttrykk1. Andelen monocytt delsett kan variere med tilstedeværelse som en økt andel av mellomprodukter i ulike inflammatoriske tilstander2,3 inkludert kardiovaskulær sykdom, hvor mellomprodukter er forbundet med klinisk hendelser4,5. Videre i sykdomstilstander, kan monocytter også gjennomgå funksjonelle endringer, med mange endringer detectable av en forskjell i overflaten markør uttrykk6,7. Et slikt eksempel er monocytt M1-forvrenger, en økning i markører knyttet M1 makrofager, som har blitt observert i hjerte-og karsykdommer, diabetes, fedme og Metabolsk syndrom7,8,9 , 10.
Til tross for populariteten til flowcytometri å vurdere monocytt delsett andel og funksjon, er det en betydelig variasjon i prøven forberedelse og delsett gating mellom studier som gjør det vanskelig å sammenligne resultatene mellom slike studier. Viktigst, det er ingen enighet i avgrensning av monocyte undergrupper, men en standardisert tilnærming er viktig gitt klinisk signifikans i endringer i delsett proporsjoner i flere sykdommer. Del på problemer gating oppstår fra det faktum at monocytter skille fra det klassiske gjennom mellomliggende til ikke-klassiske delsett11 og slik monocytter finnes som et kontinuerlig spekter i stedet for distinkte bestander12 . Interessant, viste Zawada et al. at ved hjelp av enten en rektangulære eller trapes gating av mellomliggende undergruppe, både resulterte i et høyere mellomliggende delsett som spådd en hjerte endepunktet13. Dette understreker at minst beregner proporsjoner, hovedsaken er søker en konsekvent gating strategi mellom ulike eksempler (og studier), heller enn å prøve å definitivt forskjellsbehandle delsett. Mens definitive gating kan være viktigere når vurdere funksjon, endringen i markør uttrykk mellom delsett er trinnvis12,14, og dermed igjen konsekvent gating er kanskje nøkkelen. Som sådan, er en målsetting gating metode som reproduserbar apportions monocytt delsettene mellom ulike eksempler nødvendig. Formålet med metoden som presenteres her er å gate monocytt delsett med en klar forklaring og begrunnelse for gating teknikken ansatt og vurdere delsettene for overflate markør uttrykk, noe som gir en metode som tillater forskere å ha tillit i bruk av denne teknikken når vurdere forskjellige prøver.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>7128959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style)</td>
			<td>Invitro technologies</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [M&#966;P9]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8]</td>
			<td>Abcam Australia</td>
			<td>ab140477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1 &#954; Isotype Control [MOPC-21]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Lot # 4283901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556018</td>
			<td>Lot # 2335626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558592</td>
			<td>Lot # 36768</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555658</td>
			<td>Lot # 3109766</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561001</td>
			<td>Lot # 3228959</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2A Isotype control [20102]</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC003P</td>
			<td>Lot # 1212031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235]</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB226P</td>
			<td>Lot # 612051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control [MOPC-21]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Lot # B220359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>336107</td>
			<td>Lot # B143544</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347347</td>
			<td>Lot # 3010929</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561741</td>
			<td>Lot # 2307721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561903</td>
			<td>Lot # 3011796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305105</td>
			<td>Lot # B154037</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiLyse C</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A11895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic haematology analyser, XT-1800i</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge GS-6R</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software v10.0.7</td>
			<td>Tree Star Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of human monocyte subsets by whole blood flow cytometry analysis

Monocytter er viktige bidragsytere i ulike inflammatoriske lidelser og endringer i disse cellene, inkludert delsett proporsjoner og funksjoner kan ha patologisk betydning. En ideell måte å undersøke endringer monocytter er fullblod flowcytometri minimal håndtering av prøver av denne metoden begrenser artifactual celle aktivering. Imidlertid tatt mange ulike tilnærminger til gate monocytt delsettene fører til strid identifikasjon av delsettene mellom studier. Her viser vi en metode som bruker fullblod flowcytometri å identifisere og karakterisere menneskelige monocytt delsett (klassisk, middels og ikke-klassiske). Vi skissere hvordan å forberede blodprøvene flowcytometri gate delsettene (sikre forurensende celler er fjernet) og bestemme monocytt delsett uttrykk for overflate markører, i denne eksempel M1 og M2 markører. Denne protokollen kan utvides til andre studier som krever en gating standardmetode for å vurdere monocytt delsett proporsjoner og monocytt delsett uttrykk for andre funksjonelle markører.

Monocytt gating strategi og flyt cytometri analyse her (figur 1) er gated monocytt delsettene og avslørte deres relative proporsjonene. Proporsjonene (for dette eksemplet) ble beregnet som 88.1% classicals, 4.33% mellomprodukter og 7.49% ikke-classicals. Disse delsett gates var ikke forurenset med B-celler, T-celler, nøytrofile eller NK celler, som ble bekreftet med indikatorer CD19, CD3, CD56 og CD66b, henholdsvis. Ved å vurdere den relative plasseringen av andre befolkninger, er det klart at T celler og nøytrofile falle godt utenfor figuren monocytt "┐" på CD16/CD14 tomten (figur 2A og 2D). Men både NK celler og B celle populasjoner overlappet befolkningen ikke-klassiske monocytt (figur 2B og 2 C). Trinnene av gating strategien (figur 1 d og 1E) ble bekreftet for å utelate NK celler (figur 3A) og B-celler (figur 3B). Selv om B-celle befolkningen inkludert en liten del av ikke-klassiske monocytter, var mengden ubetydelig.
Har gated delsettene, graden som de uttrykte forskjellige overflate markører, M1 (CD64, CD86 og CD120b) og M2 (CD163, CD11b og CD93) ble vurdert. Indikatorene viste positive uttrykk i forhold til sine tilsvarende isotype kontroller, sett av skifte av histogrammer (Figur 4). Medianen til markørene var større enn isotype kontrollene.
Anvendelsen av denne gating strategien til en blodprøve, som var delt inn i fire rør, beiset og analysert separat, gir sammenlignbare resultater mellom rør (Tabell 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg"> Figur 1: representant monocytt gating strategi i hele menneskeblod. (A) FSC(A) vs FSC(H) plot: Gating cellene har lik området og høyde, dermed fjerne klumper (større FSC(A) FSC(H)) og rusk (svært lav FSC) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) plot: bredt utvalg av monocytter basert på SSC/FSC egenskapene. (C) CD16 vs CD14 plot: Gating Velg monocytter basert på sin karakteristiske "┐"-form. (D) CD16 vs HLA-DR plot: Gating σ velge HLA-DR positiv Celler NK celler. (E) CD14 vs HLA-DR: Gating hindre monocytter B-celler (HLA-DR høy/CD14 lav). (F) valgt monocytter vises på nytt på CD16 vs CD14 tomten til gate monocytt delsettene. For A-F representerer farge cellen tetthet med blått og grønt som angir lav tetthet, røde og oransje indikerer høy tetthet og oransje indikerer middels tetthet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg"> Figur 2: validering av gating strategi ved identifisering av potensielt forurensende celler. Potensielt skadelige celler identifiseres ved (A) T celler (CD3), (B) B celler (CD19), (C) NK celler (CD56) og (D) nøytrofile (CD66b). Venstre panelene viser identifikasjonen av hver befolkningen etter gating per figur 1A og 1B, med farge som representerer cellen tetthet fra høy (rød) til lav (blå). Høyre sidepanelene viser hver celle befolkningen (blå) oppå siste monocytt CD16/CD14 plottet å avsløre nærhet i disse populasjonene å monocytter (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg"> Figur 3: bekreftelse på at skritt gating fjerne forurensende celler. Heat kart viser graden av uttrykk fra høy (rød) til lav (blå) (A) CD56 og (B) CD19. Skritt gating vellykket utelater celler med høy CD56 (NK celler) og høye CD19 (B celler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg"> Figur 4: Monocyte uttrykk for M1 (CD120b) og M2 (CD93) markører. Glattet histogrammer monocytt M1 og M2 markør uttrykk (blå) viser klar dreining fra isotype (rød) for (A) classicals, (B) mellomprodukter og (C) ikke-classicals. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antistoff</td>
			<td>Volum (50 µL blod)</td>
			<td>Volum (16 x) 800 µL blod</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14 - V450</td>
			<td>0,75 ΜL</td>
			<td>12 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16 - APC</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR-PerCP</td>
			<td>0.625 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Antistoffer for hele blodstrøm og master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Rør</td>
			<td>PE antistoffer</td>
			<td>Kode</td>
			<td>Isotype Match</td>
			<td>Lager konsentrasjon</td>
			<td>Arbeider volum</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>0.625 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.125 µg/20 µL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0,06 µg/20µL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>R & D (IC003P)</td>
			<td>NA</td>
			<td>25 µg/mL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>R & D (FAB226P)</td>
			<td>R & D IgG2a</td>
			<td>25 µg/mL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
			<td>2,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>BL IgG1</td>
			<td>50 µg/mL</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: M1/M2-PE Fluorochrome merket monoklonale antistoffer for hele blodstrømmen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Rør</td>
			<td>Antistoff</td>
			<td>Arbeider volum</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>CD3</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>CD19</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>CD66b</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>CD56</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: PE Fluorochrome merket monoklonale antistoffer for lymfocytter (T-celler, B celler), nøytrofile og NK celler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Rør</td>
			<td>% Klassisk</td>
			<td>% Middels</td>
			<td>% Ikke-klassisk</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.11</td>
			<td>10.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>84.2</td>
			<td>5.05</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.03</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>81.6</td>
			<td>5.03</td>
			<td>12.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4: Monocyte delsett proporsjoner fra en blodprøve farget og analysert separat.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakteristikk av menneskelig Monocyte delsett av hele blod flyte cytometri analyse

Her presenterer vi en protokoll for å karakterisere monocytt delsett av fullblod flowcytometri. Dette inkluderer beskriver hvordan gate delsettene og vurdere deres uttrykk for overflate markører og gi et eksempel av evalueringen av uttrykket av M1 (inflammatoriske) og M2 markører (anti-inflammatorisk).

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Denne teknikken kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen immunologifeltet. For eksempel å bestemme hvordan monocytt undergruppeproporsjoner, eller uttrykk for forskjellige markører, endres i sykdomsstater. Den største fordelen med denne teknikken, er at cellene er nær sin opprinnelige tilstand, og at klare instruksjoner og begrunnelse brukes, for å gi en standardisert gating metode.Vanligvis kan personer som er nye på denne metoden slite, fordi mange papirer ikke gir klare instruksjoner om hvordan gating av cellene ble utført. Begynn denne protokollen med innsamling av blodprøver og bestemmelse av antall hvite blodlegemer, som beskrevet i tekstprotokollen. Fortynn blodet med fosfatbufret saltvann, for å justere konsentrasjonen til ca 5 millioner hvite blodlegemer per milliliter.Forbered tilstrekkelig master mix for antall rør ved å kombinere blod, anti CD14-V450, anti CD16-APC og anti HLA-DR-PerCP. Vortex og pipette 51,9 mikroliter med blanding i hvert rør. Legg PE merket M1 og M2 markør antistoffer, samt markører for T-celler, B-celler, nøytrofiler, og naturlige killer celler til sine tilsvarende rør.Vortex og inkuber i 30 minutter ved fire grader celsius i mørket. Tilsett nå 250 mikroliter med kombinert røde blodlegemer lysis og hvite blodlegemer fikse løsning, og umiddelbart virvle blandingen, forsiktig. Inkuber den vortexed blandingen i 10 minutter i mørket, ved fire grader celsius.Etter 10 minutter legger du til 250 mikroliter PBS og spinner ned cellene ved 260g, i 10 minutter ved romtemperatur. Fjern det overnaturante, og gjenbruk cellene i 300 mikroliter på 1% formaldehyd. Oppbevar cellene ved fire grader celsius, beskyttet mot lys til analysen utføres.Flow cytometri bør gjøres innen 48 timer etter prøveforberedelse. For å begynne, sjekk strømningscytometerloggen for å sikre at fasilitetens ansatte har utført kvalitetskontrollkontroller. For å sette opp flytcytometrieksperimentet, klikk på nytt eksperiment, etterfulgt av nytt prøve og nytt rør, for å legge til rør.Velg bivariate plott, ved å klikke på ikonet, og bruk rullegardinmenyene, for å velge tilgangsparametere. Sikre inkludering av en CD16/CD14 tomt og en tomt som viser en detektor sammen med tiden, for å overvåke oppkjøpet. Sett inn røret og klikk, hent.Kontroller instrumentspenningsinnstillingene, og sørg for at detektorsignalene ikke er av skala. Observer celler som faller i monocyttporten til CD14/CD16-plottet. Sett opptaksterskelen til 5000 hendelser for den klassiske monocyttporten, og klikk på posten.Fortsett å registrere data for de gjenværende rørene. Etter at data for alle rør er registrert, eksporterer du flytdataene som FCS-filer for analyse. Hvis du vil utføre monocyttseting, åpner du filer i analyseprogramvaren, dobbeltklikker rørnavnet og velger parametere fra rullegardinmenyene for å visualisere cellene på et fremoverspittområde kontra fremover scatterhøydeplott.Opprett en dobbel ekskluderingsport ved å klikke på ikonet for polygonportverktøy og omslutte cellene. Velg de inngjerdede cellene ved å dobbeltklikke på det inngjerdede området. Juster rullegardinmenyparametere i den nye visningsboksen for å vise cellene på et område forover punktområde kontra sidespittområdeplott.Klikk på rektangulær gate ikonet, og sjenerøst velge monocytt befolkningen, basert på fremover og side scatter egenskaper, for å utelukke flertallet av lymfocytter, naturlige killer celler og granulocytter. Velg de inngjerdede cellene og redisplay på en CD14/CD16-tomt, og velg parameterne ved hjelp av rullegardinmenyene. Klikk på polygonporten, for å velge monocytter basert på deres karakteristiske, inverterte l-form.Hvis den ikke-klassiske befolkningen ikke er forskjellig fra cellene til venstre, er forurensning sannsynlig og bør undersøkes. Merk de inngjerdede cellene, og vis monocyttene på et CD/16 HLA-DR-plott ved hjelp av rullegardinmenyene til å velge parametere. Klikk på polygonporten for å velge HLA-DR positive celler, og utelukke eventuelle gjenværende naturlige morderceller og nøytrofiler.Velg de inngjerdede cellene og vis HLA-DR-positive celler på et CD14/HLA-DR-plott ved hjelp av rullegardinmenyer for å velge parametere. Klikk på polygonporten, og tegn en port for å utelukke HLA-DR høy / CD14 lav B-celler. Velg de inngjerdede cellene og bruk rullegardinmenyene til å vise dem på et CD16/CD14-plott.Velg sebraplott, som gjør det mulig å tegne monocytt delsettporter fra plottalternativer for å bestemme delsettproporsjoner. Nå klikker du på det rektangulære gateikonet, og velger de klassiske monocytter ved å tegne en omtrentlig rektangulær port rundt CD14 høy / CD16 lav klassisk monocyttpopulasjon. Under skjerm velger du, viser medianer, for å vise median fluorescensintensitet for klassiske monocytter.Juster porten slik at befolkningen har lik fordeling fra medianen til venstre og til høyre, og omfatter alle cellene til venstre. Velg den mellomliggende populasjonen ved å tegne en rektangulær port som omfatter cellene til høyre for den klassiske porten. Juster bunnen av porten for å utelukke de ikke-klassiske cellene, ved å justere porten med bunnen av konsentriske sirkler, som er helt innenfor den klassiske monocyttporten.Gate den ikke-klassiske delsettet, ved å tegne en rektangulær boks ned fra den nedre kanten av det mellomliggende delsettet, velge alle cellene til bunnen av populasjonen. Velg, vis gatefrekvenser under visning for å bestemme prosentandelen av hvert monocytt delsett. Til slutt velger du celler fra hvert monocyttundersett.Endre rullegardinlisten for å opprette et histogram for hvert monocytt delsett, og vis hver markør. Deretter beregner du graden av uttrykk, ved hjelp av median eller geometrisk gjennomsnitt, som beskrevet i tekstprotokollen. Vellykket inngjerdet monocytt populasjoner er vist her.Og proporsjonene er i tråd med de i litteraturen. Proporsjonene for dette utvalget ble beregnet som 88,1 %klassiske, 4,33 % mellomprodukter og 7,49 %ikke-klassisk. Ved å vurdere den relative posisjonen til andre populasjoner, er det klart at T-cellene og nøytrofile vist her i blått, følger godt utenfor monocytten, invertert l-formen, på en CD16/CD14-tomt.Men både de naturlige mordercellene og B-cellepopulasjonene, vist her i blått, overlappet med den ikke-klassiske monocyttpopulasjonen. Varmekart som bekrefter at forurensende celletyper er fjernet, vises her. De naturlige mordercellene har blitt inngjerdet av HLA-DR CD16-trinnet, mens B-cellene har blitt inngjerdet av HLA-DR CD/ 14-trinnet.Uttrykket for M1- og M2-markører i blått, i forhold til isotypekontrollene i rødt, vises her. CD120b en M1-markør, viser et klart skifte over isotypekontrollen, for alle monocyttundersett. Dette er også tilfelle for CD93 en M2 markør, med uttrykk er høyere i klassisk, moderat på mellomprodukter og lav på ikke-klassisk.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å sikre at forurensende celler er inngjerdet ut, da de ellers kan bidra til kvantifisert uttrykk. Etter denne prosedyren kan andre markører undersøkes. For å svare på flere spørsmål, for eksempel hvordan monocyttmarkøruttrykk endres i sykdom.Ikke glem at arbeid med menneskelig blod og formaldehyd kan være farlig, og så forholdsregler som personlig verneutstyr, og ved hjelp av en biologisk farlig hette, bør alltid tas når du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag-kolonistimulerende faktor Differensiert Humant Monocyte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler ved Imaging flowcytometrisystemer: En sammenligning mellom to Monocyte Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk Karakterisering av makrofager fra Rat Nyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler fra Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse av mikroglia og monocyt-avledede makrofager fra sentralnervesystemet ved hjelp av flytcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Én celle analyse av Immunophenotype og cytokin produksjon i eksterne fullblod via masse cytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Diskriminering av syv immun celle undergrupper av to-fluorochrome Flow cytometri

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...