Name: characterization of human monocyte subsets by whole blood flow cytometry analysis
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Проточной цитометрии была исполнена в поток цитометрии основного объекта, который поддерживается путем Уэстмид института исследований, Westmead институт медицинских исследований концентратор, рака Нового Южного Уэльса и национального здравоохранения и медицинских исследований Совета. Это исследование было поддержано клинических исследований химии и Фонд образования.

Это исследование был одобрен Комитетом WSLHD человеческой этики научных исследований (HREC) (утверждение АС Красного HREC/15/WMEAD/289).
1. Пробоподготовка для цельной крови: проточная цитометрия
Примечание: Как кровь человека потенциально инфекционные, пример настройки должны выполняться в биологической Худ.
<ol><li>Сбор проб крови от участников в 3 мл этилена диамин тетра уксусной кислоты (ЭДТА) трубы.</li>
	<li>Определите количество белых кровяных телец (Лейкоцитов), с помощью гематологический анализатор или Горяева.</li>
	<li>Разбавляют-фосфатный буфер (PBS) (рН ~ 7,4) для регулировки концентрации до ~ 5 x 106 WBC/мл.</li>
	<li>Подготовить достаточно мастер смесь для количество трубок (например, для 14 труб, подготовить 16 x Мастер микс) путем объединения 16 x объем 50 мкл крови, 0,75 мкл анти CD14-V450, 0.5 мкл анти CD16-APC и 0,625 мкл анти-HLA-DR-PerCP. Вортекс и пипетки 51,9 мкл смеси в каждую пробирку (Таблица 1). Примечание: Антитела должны быть титруют определить оптимальные концентрации окрашивания для флуоресцентные антитела, которые используются.</li>
	<li>Добавить маркер поверхности (M1 и M2 или изотипа управления, фикоэритрин (PE) помечены) антител (например, согласно таблице 2) и PE помечены маркерами для Т-клетки (CD3), лимфоцитов (CD19), нейтрофилов (CD66b), и природные убийца (НК) клетки (CD56) (Таблица 3). Вортекс и Инкубируйте 30 мин., 4 ° C в темноте. Примечание: Маркеры для лимфоциты, нейтрофилы и НК-клеток включены только для проверки метода стробирования.</li>
	<li>250 мкл раствора комбинированных красных кровяных клеток лизис/WBC крепления, вихревой мягко немедленно и проинкубируйте втечение 10 мин в темноте при 4 ° C.</li>
	<li>250 мкл PBS и спин клеток вниз, на 260 x g 10 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>Удалить супернатант, вновь приостановить клетки в 300 мкл 1% формальдегида. Примечание: Формальдегид токсичных. Используйте перчатки из нитрила и в зонта.</li>
	<li>Хранить при 4 ° C, защищенном от света, до тех пор, пока выполняется анализ. Примечание: Анализ потока рекомендуется быть сделано в течение 48 ч пробоподготовки.</li>
</ol>2. проточной цитометрии
<ol><li>Проверка потока цитометр журнал для обеспечения сотрудников Фонда выполнили проверок контроля качества. Примечание: Обеспечить согласованность между анализа, инструмент контроля качества и поддержание постоянной интенсивностью флюоресценции цели с помощью управления бусы рекомендуется.</li>
	<li>Чтобы настроить поток цитометрии эксперимента, нажмите на «новый эксперимент, то «новый образец» и «новые трубки» для добавления трубы. Выберите двумерных участков, нажав на иконку и используйте выпадающее меню для выбора Параметры оси. Обеспечить включение CD16/CD14 участок и участок отображения детектор наряду с время для наблюдения за приобретение.</li>
	<li>Вставить трубку и нажмите кнопку «Получить». Проверьте настройки напряжения инструмент обеспечения того, чтобы сигналы детектора не зашкаливать.</li>
	<li>Соблюдайте клеток, входящих в ворота моноцитов CD14/CD16 участка. Порога запись 5000 событий для классической Моноцит ворот и нажмите на «Рекорд».</li>
	<li>Продолжить запись данных для остальных трубок. После того, как был записан данных для всех труб, экспорт потока данных в виде файлов .fcs для анализа. Примечание: Для обеспечения точности, один цвет компенсации элементы управления должны быть записаны. Матрицу компенсации можно рассчитать и применяется к данным до анализа для учета спектральных разлива над15,16.</li>
</ol>3. Моноцит стробирования
<ol><li>Открытые файлы в программное обеспечение для анализа. Дважды щелкните имя трубки и выберите параметры из выпадающих меню чтобы визуализировать клетки на площади вперед разброс FSC (A) / вперед высоты точечная FSC(H). Создание исключения ворота Дуплет, нажав на пиктограмму инструмента ворота полигона и ограждающих клетки как (рис. 1A).</li>
	<li>Выделите ячейки, закрытый (двойным щелчком на жилой район) и на новом дисплее поле скорректировать выпадающем меню параметров для отображения ячеек на FSC (A) / стороне разброс SSC(A) участок. Нажмите на иконку прямоугольные ворота и щедро выберите Моноцит населения на основе вперед и боковых разброс свойств исключить большинство лимфоцитов, НК-клеток и гранулоцитов (рис. 1B).</li>
	<li>Выделите ячейки, закрытом и отобразить на участке CD14/CD16, выбрав параметры с помощью выпадающих меню. Нажмите на полигон ворота для выбора моноцитов, основанные на их характеристика «┐» форму (рис. 1 c).</li>
	<li>Выделите ячейки, закрытом и отображать моноциты на участке CD16/HLA-DR, используя выпадающее меню для выбора параметров. Нажмите на полигон ворота для выбора HLA-DR позитивных клеток и исключить любые оставшиеся NK клеток и нейтрофилы17 (рис. 1 d).</li>
	<li>Выделите ячейки, закрытом и отображать HLA-DR позитивные клетки на участке CD14/HLA-DR, используя выпадающее меню для выбора параметров. Нажмите на полигон ворота и нарисуйте ворота для исключения HLA-DR высокой/CD14 низкой клетки (клетки B Экспресс высокий уровень HLA-DR, но не CD14) (Рисунок 1E). Примечание: клетки B заражение может произойти и поэтому должны быть расследованы. Если неклассических населения в Рисунок 1 c не отличается от клетки слева, загрязнение, вероятно. Шаг 3.5 можно пропустить, если клетки B не перекрываются с неклассической моноцитов.</li>
	<li>Выделите ячейки, закрытом и использовать выпадающее меню для отображения их на участке CD16/CD14. Параметры печати выберите «Зебра сюжет», которая позволит Моноцит подмножество ворота привлекается для определения подмножества пропорции (Рисунок 1F). Примечание: если зебра печати недоступна на анализ программного обеспечения, псевдо цвет (гладкие) или контурное изображение может быть подходящим.</li>
	<li>Нажмите на иконку прямоугольные ворота и выберите Классический моноцитов, нарисовав приблизительно прямоугольная ворота вокруг населения высокий/CD16 низкий, классическая Моноцит CD14. В разделе «Отображение» выберите «Показать Медиан» для отображения средний флуоресценции интенсивности для классической моноцитов. Отрегулируйте ворота, таким образом, что население имеет равное распределение от медианы на левый и правый, охватывающих все ячейки слева.</li>
	<li>Выберите промежуточный населения путем рисования прямоугольных ворота, которая охватывает ячейки справа от ворот классической. Настроить в нижней части ворот исключить неклассических клетки выравнивая ворота с нижней части концентрических кругов, которые полностью находятся в классической Моноцит ворота, который гарантирует, что промежуточные подмножество имеет выражение CD14, сопоставимые с основные классические населения в соответствии с текущей номенклатуры.</li>
	<li>Ворота и неклассические подмножество, нарисовав прямоугольник от нижнего края и промежуточных подмножество, выбор всех ячеек в нижней части населения (Рисунок 1F).</li>
	<li>В разделе «Отображение» выберите «Показать ворота частоты» для определения доли каждой Моноцит подмножества.</li>
</ol>4. Проверка стробирования метод
<ol><li>Чтобы определить, являются ли потенциально загрязняющие типы клеток эффективно закрытого out, сначала определить различных клеточных популяций с антителами против Т-клетки (CD3), лимфоцитов (CD19), нейтрофилов (CD66b) и НК-клеток (CD56) (Рисунок 2). Примечание: Здесь T клетки и нейтрофилов не сидят близко к «┐» форма моноцитов и являются воротами, в Рисунок 1 c.</li>
	<li>Убедитесь, что в шаге 3.4 (рис. 1 d) удаляются клетки и клетки B удаляются в шаге 3.5 (Рисунок 1E), как показано на рисунке 3. Если клетки или клетки B, не закрытый из подрегулировать ворота.</li>
</ol>5. Фенотипические Моноцит маркер выражения
<ol><li>Выделите ячейки от каждого Моноцит подмножества. Измените параметры раскрывающегося списка для создания гистограммы для каждого подмножества Моноцит (Рисунок 1F) отображение каждого маркера и его соответствия изотипа (рис. 4).</li>
	<li>Вычислите степень выражения каждого маркера (медиана или среднее геометрическое) по сравнению с контролем соответствующих изотипа.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood.">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li><li>Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD14(bright)+CD16++monocyte+subset+is+expanded+in+rheumatoid+arthritis+and+promotes+expansion+of+the+Th17+cell+population.">The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).</li><li>Wildgruber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;Intermediate&amp;#34;+CD14++CD16++monocyte+subset+increases+in+severe+peripheral+artery+disease+in+humans.">The &amp;#34;Intermediate&amp;#34; CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans.</a> Scientific Reports. 6, 39483 (2016).</li><li>Heine, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+subpopulations+and+cardiovascular+risk+in+chronic+kidney+disease.">Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease.</a> Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+independently+predict+cardiovascular+events:+a+cohort+study+of+951+patients+referred+for+elective+coronary+angiography.">CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li><li>Bories, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+alternative+macrophage+differentiation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+obese+subjects.">Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).</li><li>Fadini, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbalanced+monocyte+polarisation+in+peripheral+blood+and+bone+marrow+of+patients+with+type+2+diabetes+has+an+impact+on+microangiopathy.">An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy.</a> Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).</li><li>Satoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+M1/M2+phenotype+of+peripheral+blood+monocytes+in+obese+diabetic+patients:+effect+of+pioglitazone.">Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone.</a> Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).</li><li>Chen, X., Devaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+from+metabolic+syndrome+subjects+exhibit+a+proinflammatory+M1+phenotype.">Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).</li><li>Williams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+classical+monocytes+display+unbalanced+M1/M2+phenotype+with+increased+atherosclerotic+risk+and+presence+of+disease.">Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease.</a> International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).</li><li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical,+intermediate,+and+nonclassical+human+monocyte+subsets.">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li><li>Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+human+intermediate+monocytes.">Phenotypic characterization of human intermediate monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+different+strategies+for+human+monocyte+subsets+gating+within+the+large-scale+prospective+CARE+FOR+HOMe+Study.">Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study.</a> Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).</li><li>Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+inflammatory+profile+is+specific+for+individuals+and+associated+with+altered+blood+lipid+levels.">Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels.</a> Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).</li><li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry.">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).</li><li>Szaloki, G., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+in+multicolor+flow+cytometry.">Compensation in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).</li><li>Abeles, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14,+CD16+and+HLA-DR+reliably+identifies+human+monocytes+and+their+subsets+in+the+context+of+pathologically+reduced+HLA-DR+expression+by+CD14(hi)+/CD16(neg)+monocytes:+Expansion+of+CD14(hi)+/CD16(pos)+and+contraction+of+CD14(lo)+/CD16(pos)+monocytes+in+acute+liver+failure.">CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).</li><li>Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Classical+monocytes+display+inflammatory+features:+Validation+in+Sepsis+and+Systemic+Lupus+Erythematous.">Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous.</a> Scientific Reports. 5, 13886 (2015).</li><li>Lundahl, J., Halld&#233;n, G., Hallgren, M., Sk&#246;ld, C. M., Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+CD11b/CD18+and+CD62L+on+human+monocytes+after+cell+preparation+procedures.">Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).</li><li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets.">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).</li><li>Dagur, P. K., McCoy, J. P., Robinson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+Storage,+and+Preparation+of+Human+Blood+Cells.">Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells.</a> Current protocols in cytometry. 73, (2015).</li><li>Einwallner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+matters:+Red+cell+lysis+with+FACS+Lyse+affects+the+flow+cytometric+enumeration+of+circulating+leukemic+blasts.">Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).</li><li>Tsujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Heterogeneity+of+Human+Peripheral+Blood+Monocyte+Subsets+on+Myocardial+Salvage+in+Patients+With+Primary+Acute+Myocardial+Infarction.">Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).</li><li>Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+lymphocyte,+monocyte+and+dendritic+cell+subsets+in+normal+rhesus+macaques+by+12-color+flow+cytometry:+Clarification+on+DC+heterogeneity.">Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity.</a> Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).</li><li>Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+protocol+for+enumeration+of+endothelial+progenitor+cells+and+monocyte+subsets+in+human+blood.">A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood.</a> Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+human+cardiovascular+disease.">Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease.</a> Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SuperSAGE+evidence+for+CD14++CD16++monocytes+as+a+third+monocyte+subset.">SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset.</a> Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).</li><li>Heimbeck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+single-platform+assay+for+human+monocyte+subpopulations:+Lower+CD14+CD16+++monocytes+in+females.">Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females.</a> Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Refined+Definition+of+Monocyte+Subsets.">Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets.</a> Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).</li><li>Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+analysis+of+monocyte+subsets+in+cardiovascular+disease.+Joint+consensus+document+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC)+Working+Groups+"Atherosclerosis+&amp;+Vascular+Biology"+and+"Thrombosis".">Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis &amp; Vascular Biology" and "Thrombosis".</a> Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).</li><li>Shantsila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+characterization+of+human+monocyte+subsets:+possible+implications+for+cardiovascular+disease+pathophysiology.">Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).</li><li>Hofer, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=slan-defined+subsets+of+CD16-positive+monocytes:+impact+of+granulomatous+inflammation+and+M-CSF+receptor+mutation.">slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation.</a> Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).</li><li>Thomas, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Blood+Monocyte+Subsets:+A+New+Gating+Strategy+Defined+Using+Cell+Surface+Markers+Identified+by+Mass+Cytometry.">Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Цельной крови проточной цитометрии является идеальный подход для изучения моноцитов, как клетки рассматриваются в условиях, приближенных к их физиологической микроокружения, обеспечивая понимание их роли в инфекции и воспалительных процессов. Кроме того использование свежих (т.е., необработанные) образцы крови сводит к минимуму изменения или преобразования клеток, которые могут произойти из-за хранения или обработки18,19, таких, как известно, происходят с замораживания размораживания моноцитов 20. подготовка оперативного образца рекомендуется как некоторые маркеры upregulated если образцы хранятся при комнатной температуре до переработке19. Титрование были определены оптимальные концентрации М1 и м2 маркеров, и это должно быть сделано для любых новых антитела ограничить неспецифической привязки, при одновременном обеспечении степени сдвиг объясняется выражение антигена и не ограничивается отсутствием антител. Удаление красных кровяных клеток и фиксации белых кровяных клеток с лизис решение является важным шагом в этом протоколе, как наличие красных кровяных клеток может мешать потока цитометрии21,22. Обратите внимание, что хотя некоторые лизис решения совместимы с без мыть окрашивание, яснее населения проявляется в наших руках, когда мыть шаг используется.
Правильную настройку проточный цитометр также имеет решающее значение при сравнении выражение Моноцит маркеров. Мы рекомендуем, что исследователи поддерживать интенсивностью флюоресценции последовательного целевого управления бисера и выполнять контроль качества на документа, который должен использоваться для обеспечения что последовательные результаты через различные образцы работать на разные дни. В дополнение к этому изотипа элементы управления используются для оказания помощи в толковании любой неспецифичный фонового сигнала, создаваемые неспецифическими антитела связывая. Моноциты имеют высокий уровень Fc рецепторов11 и поэтому подвержены неспецифической привязки. Следует отметить уровень неспецифической привязки отличается для разных подмножеств, и таким образом использование isotype управления становится важным при сравнении степень маркер выражения между подмножествами.
Другим важным критерием для рассмотрения является стробирования шаги работают. Некоторые исследования показывают, что важно привлечь туго ворота вокруг Моноцит населения в FSC(A)/SSC(A) участок избавиться от большинства не monocytic CD16 позитивные клетки23,24,25, но это может привести к потере некоторых Моноциты как non Моноцит клетки могут перекрываться с моноциты на FSC/SSC участки26. Скорее чтобы исключить любые другие клетки крови, которые могут загрязнить моноцитов, включение маркера третьего моноцитов CD14 и CD16, является важным26,27. По этой причине HLA-DR часто используется и является идеальным, поскольку он не выражен NK клеток или нейтрофилов17,28. Хотя лимфоциты (В-клетки и Т-клетки) могут выразить HLA-DR, они отличаются от моноцитов в отношении CD14 выражение. В то время как HLA-DR является идеальным третий маркер, CD86 также было рекомендовано5,27,29 , но здесь не используется как это также маркер M1 и таким образом была оценена степень его выражения на Моноцит подмножеств.
Проверка стробирования стратегия используется имеет решающее значение. В то время как клетки известны перекрываются с не classicals, если они не являются воротами из28, мы замечаем, что клетки B также могут перекрываться с не classicals (Рисунок 2B); является ли это случай в других исследованиях может зависеть от флюрохром выбор, инструмент конфигурации, чувствительности или даже болезнь условие рассматривается. Здесь, перекрывающиеся B клеток показали высокая экспрессия HLA-DR и были не закрытый, выбор HLA-DR клеток в Рисунок 1 d. Скорее, чтобы удалить клетки B мы использовали дополнительный участок CD14 / HLA-DR, где клетки B отделить от не classicals вследствие их выше HLA-DR и низким CD14 выражение.
Есть также много различных способов, в которых ворота для моноцитов, сами нарисовали в литературе; к ним относятся квадратами (подмножества разделяются квадрант маркеры) и прямоугольной или трапеции коробки13 (с отдельным коробки для каждого подмножества), который Кроме того отличают в их размещения, разграничение где заканчивается одно подмножество и начинается другой. Эти различия могут отражать тот факт, что моноциты существует континуум клеток, дифференцировать от классического к неклассической, а четко населения. Однако потому что различия в методах для определения подмножества, сами может привести к различиям в пропорциях подмножество вычисляемых Моноцит, становится важным, что метод стробирования достаточно объективный, а не субъективным, как это будет Сделайте этот метод более надежных и воспроизводимых. Некоторые исследования использовать элемент изотипа для окрашенных CD16 + для определения границы между классической и промежуточных подмножеств30. С другой стороны чтобы определить разделение интермедиаты и не classicals, было предложено, что светотеневой границы может быть вертикальный или наклонный, с выбором до следователей, условии, что она должна быть воспроизводимой, но прямоугольные ворота было рекомендовано для облегчения сопоставлений между исследования13,30,31. Здесь повышение объективности был получен путем печати данных на участке Зебра и применяя объективный визуальные правила, потому что Зебра участков обеспечивают дополнительные визуализации кий, смешивая цвета градиента для каждой равной вероятностью бен над традиционными контурное. Правая граница классической подмножества было обращено таким образом, чтобы население было равномерно распределены вокруг средней населения. Разделение между интермедиатов и не classicals также были стандартизированы, имея базы интермедиатов выровнять с нижней части концентрических кругов в рамках классической населения (т.е., промежуточные населения четко выражает высокий уровень CD14, согласно стандартной номенклатуры1).
Хотя некоторые исследования показали использования дополнительных маркеров, такие как C-C хемокиновых рецепторов типа 2 (CCR2) или 6-сульфогруппу LacNAc (SLAN) для получения успешного перечисление моноцитов и выявить их клиническое значение32,33 , в наших руках уровень выражения многих Моноцит функциональных маркеров широко варьируется от лица14. Такая вариация может ограничить полезность этих маркеров для определения подмножества на основе их выражения. Автоматизированной вычислительной подходы также были использованы для визуализации и кластер Моноцит подмножеств, включая визуальные интерактивные стохастических встраивание сосед (viSNE), t распределенных стохастика сосед встраивания (tSNE) или прогрессирования Spanning дерево Анализ плотности нормированный события (лопата)34,35, который может обеспечить визуальное представление ячеек, основанных на наборе используется несколько маркеров. В то время, как это было показано для повышения точности стробирования стратегии Моноцит подмножество классификации, признано, что недостатком является количество антител (и соответствующих Флюорофор каналов). Его полезность будет зависеть на вопросы; Дополнительные сложности не могут быть оправданными, например, в исследованиях перечисления.
Моноциты, закрытый с нашей техникой Показать пропорции согласно литературе и можно легко определить выражение поверхностных маркеров на три подгруппы. В целом методика и методология, объяснил здесь обеспечивает стандартизированный и простой метод перечисления Моноцит подмножество пропорции и оценки выражения поверхности маркер, который может быть расширен для включения других маркеров, а, тем самым проверка их функциональной роли в различных условиях.

Моноциты являются тип белых кровяных клеток, которые играют важную роль в поощрении и урегулировании воспаления. Существует три основных подмножество моноциты признанных, классическая (~ 85%), средний (~ 5%) и неклассические моноцитов (~ 10%), которые характеризуются их уровень Кластер дифференцировки (CD) 14 и CD16 выражение1. Пропорции Моноцит подмножеств могут отличаться с наличием болезней, например увеличение доли интермедиатов в различных воспалительных заболеваниях2,3 , включая сердечно-сосудистые заболевания, где уровень промежуточных является связанные с клинических явлений4,5. Кроме того в условиях заболевания, моноциты можно также пройти функциональные изменения, со многими изменениями, обнаруживаемых разница в поверхности маркер выражения6,7. Одним из таких примеров является Моноцит M1-наклон, увеличение маркеров, связанных с M1 макрофагов, который наблюдается в сердечно-сосудистых заболеваний и диабета, ожирение, метаболический синдром7,8,9 , 10.
Несмотря на популярность проточной цитометрии для оценки доли подмножество Моноцит и функции существует значительная изменчивость в пробоподготовки и подмножество стробирования между исследованиями, которые делает его трудным для сравнения результатов между такими исследованиями. Главное не существует консенсуса в демаркации Моноцит подмножеств, но стандартизированный подход необходим ввиду клиническую значимость изменений в пропорциях подмножества в нескольких заболеваний. Часть трудностей в стробирования проистекает из того факта, что моноциты дифференцировать от классической через промежуточные для неклассических подмножество11 и как таковой, моноциты существует как непрерывный спектр, а не отдельных популяций12 . Интересно, что Завада et al. показал, что использование либо прямоугольной или трапециевидные стробирования промежуточных подмножества, оба в результате подмножество выше промежуточных, предсказал сердечно конечной13. Это подчеркивает, что, по крайней мере для расчета пропорции, ключевым вопросом применение последовательной стробирования стратегии между различными образцы (исследования), вместо того, чтобы окончательно различать подмножеств. Хотя окончательное стробирования может быть более важным при оценке функции, изменения в маркер выражения между подмножествами добавочный12,14, и таким образом снова, последовательность в стробирования возможно является ключевым. Таким образом необходим объективный стробирования метод, который можно воспроизвести раскладками Моноцит подмножеств между различными образцами. Цель метода, представленные здесь заключается в ворота Моноцит подмножества с четкое объяснение и обоснование метода стробирования занятых и оценить подмножества для поверхности маркер выражения, обеспечивая тем самым метод, который позволяет исследователям иметь уверенность в использовании этой техники при оценке различных образцов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>7128959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style)</td>
			<td>Invitro technologies</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [M&#966;P9]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8]</td>
			<td>Abcam Australia</td>
			<td>ab140477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1 &#954; Isotype Control [MOPC-21]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Lot # 4283901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556018</td>
			<td>Lot # 2335626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558592</td>
			<td>Lot # 36768</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555658</td>
			<td>Lot # 3109766</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561001</td>
			<td>Lot # 3228959</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2A Isotype control [20102]</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC003P</td>
			<td>Lot # 1212031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235]</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB226P</td>
			<td>Lot # 612051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control [MOPC-21]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Lot # B220359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>336107</td>
			<td>Lot # B143544</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347347</td>
			<td>Lot # 3010929</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561741</td>
			<td>Lot # 2307721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561903</td>
			<td>Lot # 3011796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305105</td>
			<td>Lot # B154037</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiLyse C</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A11895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic haematology analyser, XT-1800i</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge GS-6R</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software v10.0.7</td>
			<td>Tree Star Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of human monocyte subsets by whole blood flow cytometry analysis

Моноциты являются важнейшими действующими лицами в различных воспалительных заболеваниях и изменения этих ячеек, включая их подмножество пропорции и функции, может иметь патологическое значение. Идеальный способ для изучения изменения моноциты является цельной крови: проточная цитометрия, как минимальной обработки образцов этим методом ограничивает активации артефакты клеток. Однако многие применяются различные подходы для ворот Моноцит подмножеств, ведущих к несовместимым идентификации подмножеств между исследованиями. Здесь мы показываем методом проточной цитометрии цельной крови для выявления и характеризуют человека Моноцит подмножеств (классический, промежуточные и неклассические). Мы приводим как подготовить образцов крови для проточной цитометрии, ворота подмножеств (обеспечение загрязняющих клетки были удалены) и определить выражение подмножество Моноцит поверхностных маркеров — в этом примере M1 и M2 маркеров. Этот протокол может распространяться на другие исследования, которые требуют стробирования стандартный метод для оценки Моноцит подмножество пропорции и Моноцит подмножество выражение других функциональных маркеров.

Моноцит стробирования стратегии и анализа цитометрия потоков используется здесь (рис. 1) успешно условным Моноцит подмножеств и показал их относительные пропорции. Пропорции (для примера) рассчитывались как classicals 88,1%, 4.33% промежуточных и 7,49% не classicals. Эти подмножества ворота не были загрязнены с лимфоцитов, Т-клетки, нейтрофилы или НК-клеток, которые было подтверждено с маркерами CD19, CD3, CD56 и CD66b, соответственно. Оценивая относительное положение других групп населения, становится ясно, что Т-клетки и нейтрофилы подпадают также Моноцит «┐» формы на участке CD16/CD14 (рисунок 2A и 2D). Однако НК-клетки и клетки B населения пересекается с неклассической Моноцит населения (Рисунок 2B и 2 C). Шаги стробирования стратегии (рис. 1 d и 1E) были подтверждены исключить НК-клеток (рис. 3A) и B клеток (рис. 3B). Хотя популяции клеток B включена небольшая часть неклассических моноцитов, сумма была незначительной.
Закрытого подмножеств, степень, в которой они выразили различные поверхности маркеры, M1 (CD64, CD86 и CD120b) и м2 (CD163 CD11b и CD93), была проведена оценка. Маркеры показали положительное выражение, по сравнению с их соответствующих элементов управления изотипа, как видно на сдвиг гистограммы (рис. 4). Медиана маркеров был больше, чем изотипа элементов управления.
Применение этой стратегии стробирования образец крови, которая была разделена на четыре трубы, витражи и проанализированы отдельно, сопоставимые результаты урожайности между трубами (Таблица 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg"> Рисунок 1: представитель Моноцит стробирования стратегия в целом человеческой крови. (A) FSC(A) против FSC(H) участок: стробирования клетки, которые имеют равные площади и высоты, удалив таким образом сгустки (более FSC(A) по сравнению с FSC(H)) и мусора (очень низкая FSC) K = 1000. (B) FSC(A) против SSC(A) участок: широкий выбор моноцитов, основываясь на их свойствах SSC/FSC. (C) CD16 против CD14 участок: стробирования выбрать моноциты основанный на их характеристика «┐» форму. (D) CD16 против HLA-DR участок: шлюзовые для выбора HLA-DR позитивных клеток и удаления НК-клеток. (E) CD14 против HLA-DR: стробирования исключить клетки B (низкий высокий/CD14 HLA-DR) из моноцитов. (F) выбран моноцитов, раскрывающимся на CD16 против CD14 сюжет для ворот Моноцит подмножеств. Для A-F цвет представляет плотность клеток с синим и зеленым, указанием низкой плотности, красный и оранжевый, указывающее высокой плотности и оранжевый, указывающее средней плотности. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg"> Рисунок 2: Проверка стробирования стратегии путем выявления потенциально загрязнять клетки. Потенциально загрязняющие клетки обозначены маркерами (A) Т-клетки (CD3), (B) B клетки (CD19), (C) НК-клеток (CD56) и (D) нейтрофилов (CD66b). На левой боковой панели показывают идентификации каждого населения после стробирования согласно рис. 1A и 1B, с цветом, представляющая плотность клеток от высокой (красный), низким (синий). Правая сторона панели показывают каждой популяции клеток (синий) накладывается на участке CD16/CD14 окончательный Моноцит раскрыть близость этих групп населения к моноцитов (красный). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg"> Рисунок 3: подтверждение, что стробирования шаги удаления загрязняющих клеток. Тепловые карты, показывающие степень выражения от высокого (красный) до низкого (синий) CD56 (A) и (B) CD19. Шлюзовые шаги успешно исключить клетки с высоким CD56 (NK-клетки) и высокой CD19 (B-клетки). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg"> Рисунок 4: выражение Моноцит М1 (CD120b) и м2 маркеров (CD93). Сглаженные гистограммы Моноцит M1 и M2 маркер выражения (синий) показаны явный сдвиг от изотипа (красный) (A) classicals, промежуточных (B) и (C) не classicals. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Антитела</td>
			<td>Объем (50 мкл крови)</td>
			<td>Объем (16 x) 800 мкл крови</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14 - V450</td>
			<td>0,75 МКЛ</td>
			<td>12 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16 - APC</td>
			<td>0.5 МКЛ</td>
			<td>8 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR-PerCP</td>
			<td>0,625 МКЛ</td>
			<td>10 МКЛ</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Антитела для цельной крови поток и основной микс.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Трубка</td>
			<td>PE антитела</td>
			<td>Код</td>
			<td>Isotype матч</td>
			<td>Складе концентрация</td>
			<td>Рабочий объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1,0 мкг/20 мкл</td>
			<td>0,625 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0,125 мкг/20 мкл</td>
			<td>5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0,06 мкг/20µL</td>
			<td>10 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1,0 мкг/20 мкл</td>
			<td>1,25 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1,0 мкг/20 мкл</td>
			<td>1,25 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1,0 мкг/20 мкл</td>
			<td>1,25 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>R & D (IC003P)</td>
			<td>NA</td>
			<td>25 мкг/мл</td>
			<td>5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>R & D (FAB226P)</td>
			<td>R & D IgG2a</td>
			<td>25 мкг/мл</td>
			<td>5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2 мг/мл</td>
			<td>2.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>BL IgG1</td>
			<td>50 мкг/мл</td>
			<td>1,25 МКЛ</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: M1/M2-PE флюрохром помечены моноклональных антител для потока цельной крови.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Трубка</td>
			<td>Антитела</td>
			<td>Рабочий объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>CD3</td>
			<td>5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>CD19</td>
			<td>5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>CD66b</td>
			<td>1,25 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>CD56</td>
			<td>5 МКЛ</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3: PE флюрохром помечены моноклональных антител для лимфоциты (Т-клетки, клетки B), нейтрофилов и НК-клеток.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Трубка</td>
			<td>% Классика</td>
			<td>% Средний</td>
			<td>Неклассические %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.11</td>
			<td>10.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>84,2</td>
			<td>5.05</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.03</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>81,6</td>
			<td>5.03</td>
			<td>12.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: Моноцит подмножество пропорции от одной крови витражи и проанализированы отдельно.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Здесь мы представляем протокол для характеризующие Моноцит подмножеств подачей cytometry цельной крови. Это включает в себя описанием как ворота подмножества и оценить их выражение поверхностных маркеров и дает пример оценки выражения (воспалительных) М1 и м2 маркеры (противовоспалительное).

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии. Такие, как, определяя, как моноцитов подмножества пропорций, или выражение различных маркеров, изменяются в состояниях болезни. Основным преимуществом этой техники, является то, что клетки находятся рядом с их родным состоянием, и что четкие инструкции и оправдания используются, чтобы обеспечить стандартизированный метод закрытости.Как правило, лица, новые для этого метода могут бороться, потому что многие документы не дают четких инструкций о том, как gating клеток была выполнена. Начните этот протокол со сбора образцов крови и определения белого анализа клеток крови, как описано в текстовом протоколе. Разбавить кровь фосфатно-буферным солевым раствором, чтобы скорректировать концентрацию примерно до 5 миллионов белых кровяных телец на миллилитр.Подготовьте достаточную мастер-микст для количества трубок путем объединения крови, анти CD14-V450, анти CD16-APC и анти HLA-DR-PerCP. Вихрь и пипетка 51,9 микролитров смеси в каждой трубке. Добавить PE помечены M1 и M2 маркер антитела, а также маркеры для Т-клеток, В-клеток, нейтрофилов и естественных клеток-убийц в соответствующие трубки.Вихрь и инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию в темноте. Теперь добавьте 250 микролитров комбинированного лиза красных кровяных телец и раствора фиксации белых кровяных клеток, и сразу же вихрем смеси, осторожно. Инкубировать вихревую смесь в течение 10 минут в темноте, при четырех градусах по Цельсию.Через 10 минут добавьте 250 микролитров PBS и вращайте клетки при температуре 260г в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант, и повторного перерасхода клеток в 300 микролитров 1%формальдегида. Храните клетки при четырех градусах цельсия, защищенных от света до тех пор, пока не будет проведен анализ.Цитометрия потока должна быть выполнена в течение 48 часов после подготовки образца. Для начала проверьте журнал цитометра потока, чтобы убедиться, что персонал предприятия провел проверку качества. Чтобы настроить эксперимент по цитометрии потока, нажмите на новый эксперимент, за которым последуют новый образец и новая трубка, чтобы добавить трубки.Выберите двувариантные сюжеты, нажав на значок, и используйте меню высадки, чтобы выбрать параметры доступа. Обеспечим включение участка CD16/CD14 и участка, отображая детектор вместе со временем, чтобы контролировать приобретение. Вставьте трубку и нажмите кнопку, приобрести.Проверьте настройки напряжения прибора, гарантируя, что сигналы детектора не заходят в масштаб. Наблюдайте за клетками, падающими в моноцитные ворота участка CD14/CD16. Установите порог записи до 5000 событий для классических ворот моноцитов и нажмите на запись.Продолжайте записывать данные по оставшимся трубам. После записи данных по всем трубам экспортируют данные потока в качестве файлов fcs для анализа. Для выполнения моноцитов gating, открытые файлы в программном обеспечении анализа, дважды нажмите на имя трубки, и выбрать параметры из меню высадки, чтобы визуализировать клетки на области вперед рассеяния по сравнению с вперед рассеяния высоты участка.Создайте двойные ворота исключения, нажав на значок инструмента полигонных ворот и пригородив ячейки. Выберите закрытые ячейки, дважды нажав на закрытый регион. В новом поле дисплея отрегулируйте параметры меню высадки для отображения ячеек на области пересадок по сравнению с участком области бокового рассеяния.Нажмите на значок прямоугольных ворот и щедро выберите популяцию моноцитов, основываясь на свойствах рассеяния вперед и сбоку, чтобы исключить большинство лимфоцитов, естественных клеток-убийц и гранулоцитов. Выберите закрытые ячейки и переиграйте на сюжете CD14/CD16, выбрав параметры с помощью меню высадки. Нажмите на ворота полигона, чтобы выбрать моноциты на основе их характерной, перевернутой формы l.Если неклассической популяции не отличается от клеток слева от нее, то загрязнение, вероятно, и должны быть исследованы. Выберите закрытые ячейки и отобразить моноциты на участке CD/16 HLA-DR, используя меню высадки для выбора параметров. Нажмите на ворота полигона, чтобы выбрать HLA-DR положительные клетки, и исключить любые оставшиеся естественные клетки-убийцы и нейтрофилы.Выберите закрытые ячейки и отобразить положительные ячейки HLA-DR на графике CD14/HLA-DR, используя меню высадки для выбора параметров. Нажмите на полигон ворот, и сделать ворота, чтобы исключить HLA-DR высокой / CD14 низких клеток B. Выберите закрытые ячейки и используйте меню высадки, чтобы отобразить их на сюжете CD16/CD14.Из вариантов участка выберите участок зебры, который позволит сделать подсеть моноцитов воротами, чтобы определить пропорции подмножества. Теперь нажмите на прямоугольный значок ворот и выберите классические моноциты, нарисовав приблизительные прямоугольные ворота вокруг низкой популяции моноцитов CD14 high/CD16. Под дисплеем выберите, покажите медианы, чтобы отобразить среднюю интенсивность флуоресценции для классических моноцитов.Отрегулируйте ворота таким образом, чтобы население имеет равное распределение от медианы слева и справа, и охватывает все ячейки влево. Выберите промежуточную популяцию, нарисовав прямоугольные ворота, которые охватывают ячейки справа от классических ворот. Отрегулируйте дно ворот, чтобы исключить неклассические клетки, выравнивая ворота с нижней частью концентрических кругов, которые полностью находятся в пределах классических моноцитных ворот.Ворота неклассических подмножество, рисуя прямоугольную коробку вниз от нижнего края промежуточного подмножества, выбрав все клетки в нижней части населения. Под дисплеем выберите, покажите частоты ворот, чтобы определить процент каждого подмножества моноцитов. Наконец, выберите клетки из каждого подмножества моноцитов.Измените параметры падения, чтобы создать гистограмму для каждого подмножества моноцитов, отображая каждый маркер. Затем вычислите степень выражения, используя среднее или геометрическое среднее значение, описанное в текстовом протоколе. Успешно закрытые популяции моноцитов показаны здесь.И пропорции в соответствии с теми, в литературе. Пропорции для этой выборки были рассчитаны как, 88.1%классический, 4.33%промежуточные и 7.49%non-classical. Оценивая относительное положение других популяций, ясно, что Т-клетки и нейтрофилов, показанные здесь синим цветом, следуют далеко за пределами моноцита, перевернутой формы l, на участке CD16/CD14.Однако и естественные клетки-убийцы, и популяции В-клеток, показанные здесь синим цветом, пересекаются с неклассической популяцией моноцитов. Тепловые карты, подтверждающие, что загрязняющие типы клеток были удалены, показаны здесь. Естественные клетки-убийцы были закрыты шагом HLA-DR CD16, в то время как В-клетки были закрыты шагом HLA-DR CD/14.Здесь показано выражение маркеров M1 и M2 синим цветом по отношению к их управлению изотипом красным цветом. CD120b маркер M1, показывает четкий сдвиг выше его управления изотипом, для всех подмножеб моноцитов. Это также имеет место для CD93 M2 маркер, с выражением выше в классическом, умеренный на промежуточных и низкий на неклассических.При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы загрязняющие клетки закрыты, так как они могут в противном случае способствовать количественного выражения. После этой процедуры могут быть изучены другие маркеры. Для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, как моноцит маркер выражение изменения в болезни.Не забывайте, что работа с человеческой кровью и формальдегидом может быть опасной, и поэтому меры предосторожности, такие как, средства индивидуальной защиты, и с использованием биоопасного капюшона, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Характеристика человека моноцитов дендритные клетки путем обработки изображений проточной цитометрии: Сравнение между двумя моноцитов Isolation протоколов

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Анализ макрофагов Microglia и Monocyte из центральной нервной системы методом проточной цитометрии

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Анализ одной ячейки иммунофенотип и производство цитокинов в периферической крови в целом через массовые цитометрии

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Дискриминации в семи подмножеств иммунных клеток, два флюрохром проточная цитометрия

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...