Name: characterization of human monocyte subsets by whole blood flow cytometry analysis
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Akış Sitometresi akış sitometresi çekirdek tıbbi araştırma, Westmead Araştırma Merkezi, Kanser Enstitüsü New South Wales ve Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi Westmead Enstitüsü tarafından desteklenen tesiste gerçekleştirildi. Bu çalışmada klinik kimya araştırma ve eğitim fonu tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada WSLHD insan Araştırma Etik Komitesi (HREC) (onay AU kırmızı HREC/15/WMEAD/289) tarafından onaylanmıştır.
1. numune hazırlama için tam kan akış sitometresi
Not: insan kanı potansiyel bulaşıcı olduğu için örnek kurulum biohazard mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
<ol><li>Kan örnekleri katılımcılardan 3 mL etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) tüpler içine toplamak.</li>
	<li>Hematoloji Analyzer'ı veya hemasitometre kullanan beyaz kan hücresi (WBC) sayısı belirler.</li>
	<li>Sulu fosfat tamponlu tuz (PBS) ~ 5 x 10 için toplama ayarlamak için (pH ~ 7,4) ile6 WBC/mL.</li>
	<li>16 x 50 µL kan hacimleri, 0,75 µL CD14 V450 anti, CD16 APC anti 0.5 µL ve 0.625 µL birleştirerek (Örneğin, 14 tüpler için hazırlamak 16 x ana mix) tüpler sayısı yeterli ana karışımı hazırlanmak anti HLA-DR-PerCP. Girdap ve pipet 51.9 µL karıştırın içine her tüp (Tablo 1). Not: Kullanılan floresan antikor için en uygun boyama konsantrasyonu belirlemek için antikor titre.</li>
	<li>Yüzey işaretleyici (M1 ve M2 veya izotip kontrol, phycoerythrin (PE) etiketli) eklemek antikorlar (örnek Tablo 2başına) ve PE etiketli işaretleri T hücreleri (CD3), B hücreleri (CD19), nötrofil (CD66b) ve doğal öldürücü (NK) hücreleri (CD56) (Tablo 3). Girdap ve 30 dk, karanlıkta 4 ° C için kuluçkaya. Not: Lenfositler, nötrofiller ve NK hücreleri için işaretleri yalnızca perdeleme yöntemini doğrulamak için dahil edilir.</li>
	<li>Kombine kırmızı kan hücre lizis/WBC sabitleme çözüm, girdap yavaşça hemen 250 µL ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
	<li>PBS ve spin hücre 250 µL 260 x g oda sıcaklığında 10 dakika için ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak için 300 µL % 1 formaldehit hücrelerde yeniden askıya alma. Not: Formaldehit zehirlidir. Nitril eldiven ve duman mahallede kullanır.</li>
	<li>Analiz gerçekleştirilene kadar ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın. Not: Akışı analizi numune hazırlama 48 saat içinde yapılması önerilir.</li>
</ol>2. akış sitometresi
<ol><li>Kontrol akış sitometresi günlük tesis personel sağlamak için kalite kontrol denetimleri gerçekleştirdik. Not: denetim boncuk kullanarak hedef floresans yoğunluklarda tutarlı analizleri, enstrüman kalite kontrol ve bakımını arasında tutarlılığı sağlamak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Akış Sitometresi deneme oluşturmak için tıklayın "yeni bir deneme sonra"yeni numune"ve"yeni tüp"tüpler eklemek için. Bivariate araziler simgesine tıklatarak seçin ve eksen parametreleri seçmek için aşağı açılan menüleri seçin. CD16/CD14 arsa ve satın izlemek için bir dedektör zaman yanında görünen bir arsa dahil olun.</li>
	<li>Tüp takın ve "Al" düğmesini tıklatın. Dedektör sinyalleri ölçek sağlayarak enstrüman voltaj ayarlarını denetleyin.</li>
	<li>CD14/CD16 Arsa monosit kapısı düşen hücreleri gözlemlemek. Klasik monosit gate için 5000 olaylar için kayıt eşik ayarlayın ve "Kaydet"'i tıklatın.</li>
	<li>Veri kalan tüpler için devam edin. Sonra kaydedilen tüm tüpler için veri akışı veri analiz için .fcs dosyaları olarak dışa aktarın. Not: tek renk tazminat denetimleri doğruluğunu sağlamak için kaydedilmiş olmalıdır. Bir tazminat matrisi hesaplanır ve veri analizi için spektral sızıntısı15,16hesap önce uygulanır.</li>
</ol>3. monosit geçişi
<ol><li>Açık dosyaları analiz yazılımı. Çift tıkırtı tüp adı ve bir ileri dağılım alanına FSC (A) hücreleri görselleştirmek / dağılım yükseklik FSC(H) çizim iletmek için aşağı açılan menüleri seçin parametreleri. Çokgen gate aracı simgesini tıklatıp (Şekil 1A) olduğu gibi hücreleri kapsayan bir gelir dışlama kapı oluşturun.</li>
	<li>(Geçişli bölgenin yanında çift tıkırtı) geçişli hücreleri seçin ve yeni görüntü kutusunu ayarlamak hücreleri bir FSC (A) görüntülemek için aşağı açılan menü parametre / yan dağılım SSC(A) arsa. Dikdörtgen kapı simgesine tıklayın ve cömertçe monosit nüfus lenfositler, NK hücreleri ve granülosit (Şekil 1B) çoğunluğu dışlamak için ön ve yan dağılım özelliklerine göre seçin.</li>
	<li>Geçişli iade yapısı hücreleri seçin ve açılan menüleri kullanarak parametreleri seçmek bir CD14/CD16 arsa üzerinde yeniden görüntülemek. Çokgen kapısı onların karakteristik "┐" şekil (Şekil 1 c) dayalı monosit seçmek için tıklatın.</li>
	<li>Geçişli iade yapısı hücreleri seçin ve monosit CD16/HLA-DR arsa üzerinde parametreleri seçmek için aşağı açılan menüleri kullanarak görüntüler. HLA-DR pozitif hücreleri seçin ve herhangi bir geri kalan NK hücreleri ve nötrofil17 (Şekil 1 d) dışlamak için Çokgen geçit üzerinde'yi tıklatın.</li>
	<li>Geçişli iade yapısı hücreleri seçin ve HLA-DR pozitif hücreler parametreleri seçmek için açılan menüleri kullanarak bir CD14/HLA-DR arsa üzerinde görüntüler. Çokgen geçit üzerinde tıklatın ve (B hücreleri ifade HLA-DR ama değil CD14 yüksek düzeyde) HLA-DR yüksek/CD14 düşük hücreleri dışlamak için bir kapı çizin (Şekil 1E). Not: B hücre kontaminasyon oluşabilir ve bu nedenle araştırılmalıdır. Şekil 1 c klasik olmayan nüfus için sol hücrelerden farklı değilse, kirlenme olasıdır. B hücreleri ile klasik olmayan monosit üst üste gelen değil eğer adım 3.5-ebilmek var olmak kaptan.</li>
	<li>Geçişli iade yapısı hücreleri seçin ve bunları CD16/CD14 arsa üzerinde görüntülemek için aşağı açılan menüleri kullanın. Çizim Seçenekleri "alt oranlarını (Şekil 1F) belirlemek için çizilecek monosit alt gates sağlayacak Zebra komplo" seçin. Not: zebra Arsa analiz yazılımı, sözde renk (düz) kullanılamıyor veya kontur Arsa uygun olabilir.</li>
	<li>Dikdörtgen kapı simgesine tıklayın ve CD14 yüksek/CD16 düşük, klasik monosit nüfus çevresinde yaklaşık bir dikdörtgen kapısı çizerek klasik monosit seçin. "Görüntüle'nin altında" "medians göster" seçeneğini klasik monosit medyan floresan yoğunluğu görüntülemek için. Öyle ki eşit bir dağıtıma karşı medyan sola ve sağa sola tüm hücreleri kapsayan üzerinde nüfusa sahip geçit ayarlayın.</li>
	<li>Ara nüfus klasik kapısının sağındaki hücreleri kapsayan dikdörtgen bir kapı çizerek seçin. Tamamen ara alt CD14 ifade karşılaştırılabilir olmasını sağlar klasik monosit geçidi uzaklıktadır çemberler alt geçitte hizalayarak klasik olmayan hücreleri dışlamak için kapı alt ayarlamak Ana klasik nüfus geçerli adlandırma ile tutarlı.</li>
	<li>Klasik olmayan alt çizerek bir dikdörtgen kutu nüfus (Şekil 1F) altına tüm hücreleri seçerek orta alt alt kenarından kapı.</li>
	<li>"Gate frekansları Show" "Görüntüle'nin altında" seçin her monosit alt yüzdesini belirlemek için.</li>
</ol>4. doğrulama yöntemi perdeleme
<ol><li>Potansiyel bulaşıcı hücre tipleri etkili kapı out olup olmadığını belirlemek için farklı hücre popülasyonlarının T hücreleri (CD3), B hücreleri (CD19), nötrofil (CD66b) ve NK hücreleri (CD56) karşı antikor ile tanımlar (Şekil 2). Not: Burada T hücreleri ve nötrofil monosit "┐" şeklinde yakın oturmak yok ve Şekil 1 ciçinde dışarı kapı.</li>
	<li>NK hücreleri adım 3,4 (Şekil 1 d) kaldırılır ve B hücreleri adım 3.5 (1E rakam) Şekil 3' te gösterilen kaldırılır onaylayın. NK hücreleri veya B hücrelere geçişli-out değilseniz, kapıları yeniden ayarlayın.</li>
</ol>5. fenotipik monosit Marker ifade
<ol><li>Hücreleri her monosit alt seçin. Her işareti ve onun eşleşen izotip (Şekil 4) gösteren bir çubuk grafik her monosit alt (Şekil 1F) için oluşturmak için açılan parametreleri değiştirin.</li>
	<li>İlgili izotip denetimine göre her işaretçisi (median veya geometrik ortalama) ifade derecesini hesaplamak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood.">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li><li>Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD14(bright)+CD16++monocyte+subset+is+expanded+in+rheumatoid+arthritis+and+promotes+expansion+of+the+Th17+cell+population.">The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).</li><li>Wildgruber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;Intermediate&amp;#34;+CD14++CD16++monocyte+subset+increases+in+severe+peripheral+artery+disease+in+humans.">The &amp;#34;Intermediate&amp;#34; CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans.</a> Scientific Reports. 6, 39483 (2016).</li><li>Heine, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+subpopulations+and+cardiovascular+risk+in+chronic+kidney+disease.">Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease.</a> Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+independently+predict+cardiovascular+events:+a+cohort+study+of+951+patients+referred+for+elective+coronary+angiography.">CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li><li>Bories, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+alternative+macrophage+differentiation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+obese+subjects.">Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).</li><li>Fadini, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbalanced+monocyte+polarisation+in+peripheral+blood+and+bone+marrow+of+patients+with+type+2+diabetes+has+an+impact+on+microangiopathy.">An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy.</a> Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).</li><li>Satoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+M1/M2+phenotype+of+peripheral+blood+monocytes+in+obese+diabetic+patients:+effect+of+pioglitazone.">Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone.</a> Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).</li><li>Chen, X., Devaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+from+metabolic+syndrome+subjects+exhibit+a+proinflammatory+M1+phenotype.">Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).</li><li>Williams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+classical+monocytes+display+unbalanced+M1/M2+phenotype+with+increased+atherosclerotic+risk+and+presence+of+disease.">Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease.</a> International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).</li><li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical,+intermediate,+and+nonclassical+human+monocyte+subsets.">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li><li>Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+human+intermediate+monocytes.">Phenotypic characterization of human intermediate monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+different+strategies+for+human+monocyte+subsets+gating+within+the+large-scale+prospective+CARE+FOR+HOMe+Study.">Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study.</a> Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).</li><li>Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+inflammatory+profile+is+specific+for+individuals+and+associated+with+altered+blood+lipid+levels.">Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels.</a> Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).</li><li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry.">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).</li><li>Szaloki, G., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+in+multicolor+flow+cytometry.">Compensation in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).</li><li>Abeles, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14,+CD16+and+HLA-DR+reliably+identifies+human+monocytes+and+their+subsets+in+the+context+of+pathologically+reduced+HLA-DR+expression+by+CD14(hi)+/CD16(neg)+monocytes:+Expansion+of+CD14(hi)+/CD16(pos)+and+contraction+of+CD14(lo)+/CD16(pos)+monocytes+in+acute+liver+failure.">CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).</li><li>Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Classical+monocytes+display+inflammatory+features:+Validation+in+Sepsis+and+Systemic+Lupus+Erythematous.">Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous.</a> Scientific Reports. 5, 13886 (2015).</li><li>Lundahl, J., Halld&#233;n, G., Hallgren, M., Sk&#246;ld, C. M., Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+CD11b/CD18+and+CD62L+on+human+monocytes+after+cell+preparation+procedures.">Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).</li><li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets.">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).</li><li>Dagur, P. K., McCoy, J. P., Robinson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+Storage,+and+Preparation+of+Human+Blood+Cells.">Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells.</a> Current protocols in cytometry. 73, (2015).</li><li>Einwallner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+matters:+Red+cell+lysis+with+FACS+Lyse+affects+the+flow+cytometric+enumeration+of+circulating+leukemic+blasts.">Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).</li><li>Tsujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Heterogeneity+of+Human+Peripheral+Blood+Monocyte+Subsets+on+Myocardial+Salvage+in+Patients+With+Primary+Acute+Myocardial+Infarction.">Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).</li><li>Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+lymphocyte,+monocyte+and+dendritic+cell+subsets+in+normal+rhesus+macaques+by+12-color+flow+cytometry:+Clarification+on+DC+heterogeneity.">Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity.</a> Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).</li><li>Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+protocol+for+enumeration+of+endothelial+progenitor+cells+and+monocyte+subsets+in+human+blood.">A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood.</a> Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+human+cardiovascular+disease.">Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease.</a> Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).</li><li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SuperSAGE+evidence+for+CD14++CD16++monocytes+as+a+third+monocyte+subset.">SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset.</a> Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).</li><li>Heimbeck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+single-platform+assay+for+human+monocyte+subpopulations:+Lower+CD14+CD16+++monocytes+in+females.">Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females.</a> Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Refined+Definition+of+Monocyte+Subsets.">Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets.</a> Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).</li><li>Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+analysis+of+monocyte+subsets+in+cardiovascular+disease.+Joint+consensus+document+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC)+Working+Groups+"Atherosclerosis+&amp;+Vascular+Biology"+and+"Thrombosis".">Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis &amp; Vascular Biology" and "Thrombosis".</a> Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).</li><li>Shantsila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+characterization+of+human+monocyte+subsets:+possible+implications+for+cardiovascular+disease+pathophysiology.">Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).</li><li>Hofer, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=slan-defined+subsets+of+CD16-positive+monocytes:+impact+of+granulomatous+inflammation+and+M-CSF+receptor+mutation.">slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation.</a> Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).</li><li>Thomas, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Blood+Monocyte+Subsets:+A+New+Gating+Strategy+Defined+Using+Cell+Surface+Markers+Identified+by+Mass+Cytometry.">Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Tam kan akış sitometresi monosit hücreleri enfeksiyon ve inflamatuar koşullar onların rol içine bir bakış açısı sağlayan kendi fizyolojik microenvironment yakın koşullarda incelenir olarak eğitim için ideal bir yaklaşımdır. Ayrıca, taze (işlenmemişyani ) kullanımı kan örnekleri en aza indirir değişiklikler veya depolama veya18,19, bu dondurma çözdürülen monosit ile gerçekleşmesi için bilinen gibi işleme nedeniyle oluşabilir hücre dönüşümleri 20. komut istemi numune hazırlama örnekleri19işleme önce oda sıcaklığında tutulur Eğer upregulated bazı işaretler olduğu gibi tavsiye edilir. M1 ve M2 işaretleri en uygun konsantrasyonlarda titrasyon tarafından tespit edildi ve bu belirsiz bağlama shift derecesi nedeniyle antijen ifadesidir ve antikor eksikliği tarafından sınırlı değildir sağlanması iken sınırlamak herhangi bir yeni antikor için yapılmalıdır. Kırmızı kan hücrelerinin varlığı ile akış sitometresi21,22engelleyebilir gibi kırmızı kan hücreleri kaldırılması ve beyaz kan hücreleri ile lizis çözüm fiksasyonu bu protokol içinde önemli bir adımdır. Bazı lizis çözümler no-yıkama boyama ile uyumlu olsa da, bir yıkama adım kullanıldığında daha net nüfus bizim ellerimizde belirgin olduğunu unutmayın.
Akış Sitometresi doğru kurulumu da ifade monosit işaretlerinin karşılaştırırken önemlidir. Araştırmacılar tutarlı hedef floresans yoğunluklarda denetim boncuk korumak ve farklı günlerde farklı örnekleri arasında tutarlı sonuçlar çalıştırmak sağlamak için kullanılacak cihazda kalite kontrol gerçekleştirmeniz önerilir. Buna ek olarak, izotip denetimleri non-spesifik antikor bağlama tarafından oluşturulan herhangi bir spesifik olmayan arka plan sinyal yorumlanmasında yardımcı olmak için kullanılır. Monosit Fc reseptörü11 yüksek düzeyine sahip ve bu nedenle non-spesifik bağlamaya yatkındır. Dikkat, non-spesifik bağlama düzeyini farklı alt kümeleri için farklıdır, ve böylece bir izotip denetiminin kullanımını marker ifade alt kümeleri arasında derecesi karşılaştırıldığında önemli hale gelir.
Dikkate alınması gereken bir başka önemli istihdam gating adımları kriterdir. Bazı çalışmalarda monosit çevresinde sıkı bir kapı çizmek için FSC(A)/SSC(A) nüfus Arsa Monositik sigara CD16 pozitif hücrelerinin23,24,25çoğunu kurtulmak, ama bu bazı kaybına yol açabilir çok önemli olduğunu göstermektedir monosit gibi sigara monosit hücreleri monosit FSC/SSC Tarih ile çakışabilir26çizer. Daha ziyade, monosit kontamine diğer kan hücreleri dışlamak için bir üçüncü monosit marker CD14 ve CD16, ek olarak dahil olduğunu temel26,27. Bu nedenle, HLA-DR kez kullanılır ve NK hücreleri veya nötrofil17,tarafından28ifade değil olarak idealdir. Lenfositler (B hücreleri ve T hücreleri) HLA-DR ifade olabilir rağmen onlar monosit CD14 ifade açısından farklıdır. HLA-DR ideal bir üçüncü işaret olsa da, CD86 da5,27,29 tavsiye etti ama burada kullanılmıyor gibi aynı zamanda bir M1 marker ve böylece onun derecesini ifade monosit alt kümeleri üzerinde değerlendirildi.
Doğrulama kullanılan gating stratejisinin önemli önemlidir. NK hücreleri onlar28geçişli değil eğer sigara classicals ile üst üste bilinmektedir iken, B hücreleri de sigara-classicals ile (Şekil 2B); çakışabilir fark Bu durumda diğer çalışmalarda da olup fluorochrome seçim, araç yapılandırma, dedektör hassasiyeti veya bile muayene ediliyor hastalık durumu üzerinde bağlı olabilir. Burada, HLA-DR gösterdi yüksek ifadesi örtüşen B hücreleri ve dışarı rakam 1 dHLA-DR pozitif hücrelerinin seçime göre kapı değil. Daha doğrusu, B hücreleri kaldırmak için biz CD14 ek bir arsa kullanılan / HLA-DR, nerede B hücreleri sigara classicals nedeniyle onların daha yüksek HLA-DR dan ayırmayı ve CD14 ifade düşük.
Kapıları monosit kendileri için literatürde çizilmiştir birçok farklı yolları da vardır; Bu kadranın (alt kümeleri tarafından çeyrek işaretleri ayrılır) ve ayrıca farklı bir alt kümesi bittiği yerde ve başka bir başlar operasyona onların yerleşim dikdörtgen veya trapez kutusu13 (ile ayrı kutuları her alt için çizilmiş) içerir. Bu farklılıkların büyük olasılıkla monosit hücreleri, klasik-klasik olmayan için ayırt bir süreklilik yerine açıkça farklı nüfus olarak mevcut gerçeği yansıtır. Çünkü alt kümeleri kendilerini tanımlamak için teknikleri değişimler farklılıklar hesaplanan monosit alt oranlarda yol açabilir, ancak, bu gibi gating yöntemi oldukça objektif yerine öznel, önemli hale gelir Yöntem daha sağlam ve tekrarlanabilir olun. Bazı çalışmalarda bir izotip kontrol CD16 için klasik ve orta düzey alt kümeleri30arasındaki sınır belirlemek için kullanın. Öte yandan, ara ürün ile sigara classicals arasındaki mesafeyi tanımlamak için bu kesme hat dikey veya eğik, müfettişler, tekrarlanabilir olmalıdır olmak şart ama dikdörtgen bir kapı seçim olabilir teklif edildi çalışmalar13,30,31arasında karşılaştırma yapmayı kolaylaştırmak için tavsiye edilmiştir. Burada, Zebra araziler üzerinde geleneksel bir dağılım komplo renkli gradyan eşit olasılık her depo gözü için karıştırarak bir ek görselleştirme işaret sağladığından artan tarafsızlığı bir zebra arsa üzerinde veri çizme ve objektif görsel kuralları uygulayarak elde edildi. Öyle ki nüfus nüfus medyan eşit olarak dağıtılan klasik alt sağ kenarlığını çizilmiştir. Ara ürün ve sigara classicals arasında bölünme de çemberler klasik nüfus içinde alt ile hizalamak ara ürün temel alarak standart (Yani, ara nüfus açıkça ««ifade eder) CD14, yüksek düzeyde standart adlandırma1göre.
Bazı çalışmalarda kullanımı C-C kemokin reseptör tip 2 gibi ek işaretleri (CCR2) veya 6-sulfo LacNAc (SLAN) başarılı numaralandırma monosit ve onların klinik önemi32,33 ortaya çıkarmak için almak için düşündürmektedir iken , bizim ellerimizde ifade işaretlerinin birçok monosit işlevsel düzeyini yaygın bireyler14arasında değişir. Böyle değişim onların ifade üzerinde temel alan alt kümeleri tanımlamak için bu işaretleri kullanışlılığını kısıtlayabilir. Otomatik hesaplama yaklaşımlar da görselleştirmek ve monosit alt kümeleri katıştırma visual etkileşimli Stokastik komşu (viSNE), gömme t dağıtılmış Stokastik komşu (tSNE) veya genişleme ağacı ilerleme dahil olmak üzere küme için kullanılmıştır Hücreleri birden çok işaretleri kullanılan kümesini temel alarak görsel temsilini sağlayan yoğunluk normalleştirilmiş Olaylar (kürek)34,35, analizi. Ise bu monosit alt sınıflandırma gating stratejisinde doğruluğunu artırmak için gösterilmiştir, bir dezavantajı antikorlar (ve karşılık gelen fluorophore kanalları) gerekli olduğunu kabul edilmektedir. Onun usefulness soruluyor soru bağlıdır; ekstra karmaşıklığı, örneğin, numaralandırma çalışmalarda garanti kapsamında değil.
Bizim tekniği ile geçişli monosit literatür doğrultusunda oranlarını göstermek ve üç alt kümeleri tarafından yüzey işaretlerinin ifade kolayca belirlenebilir. Genel olarak, teknik ve burada açıklandığı metodolojisi, monosit alt oranlarını numaralandırma ve de, böylece diğer işaretleri eklemek için genişletilmiş yüzey marker ifade değerlendirirken standart ve basit bir yöntem sağlar fonksiyonel rolleri çeşitli koşullarda doğrulanıyor.

Monosit teşvik ve inflamasyon çözmede önemli bir rol oynamaktadır beyaz kan hücreleri bir türüdür. Monosit tanınan, klasik (~ %85), Orta (~ %5) ve küme farklılaşma (CD) 14 ve CD16 ifade1onların seviyesine göre karakterize klasik olmayan (~ %10) monosit üç ana alt kümeleri vardır. Monosit alt kümeleri oranlarını ara ara ürün düzeyini nerede kalp-damar hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli inflamatuar Birleşik2,3 artan bir oranda gibi hastalık varlığı ile farklı olabilir klinik olaylar4,5ile ilişkili. Ayrıca, hastalık koşullarında, monosit de pek çok değişiklik tarafından yüzey marker ifade6,7bir fark tespit ile işlev değişiklikleri uygulayabilir. Böyle bir örnek monosit M1-eğriltme, kardiyovasküler hastalıklar, diyabet, obezite ve metabolik sendrom7,8,9 gözlenen M1 makrofajlar ile ilişkili işaretçileri artış olduğunu , 10.
Monosit alt oran ve işlev değerlendirmek için akış sitometresi popülerlik rağmen numune hazırlama ve alt bulgular bu tür çalışmalar arasında karşılaştırmak zorlaştırır çalışmalar arasında geçişi hatırı sayılır bir değişkenlik vardır. Önemlisi, monosit alt kümeleri sınır hiçbir fikir birliği yoktur henüz standart bir yaklaşım çeşitli hastalıklarda alt oranlarda değişiklikler klinik önemi göz önüne alındığında esastır. Monosit Klasik orta aracılığıyla klasik olmayan alt11 ' e ayırt ve bu nedenle, monosit ayrı nüfus12 yerine sürekli spektrum olarak var aslında çoğunluğuna zorluk parçası kaynaklanmaktadır . İlginçtir, Zawada vd ya bir dikdörtgen veya trapez orta alt kümesini geçişi kullanarak, her ikisi de bir kardiyovasküler bitiş noktası13tahmin daha yüksek bir ara alt kümede sonuçlandı gösterdi. Bu en az boyut oranını hesaplamak için önemli konu farklı örnekleri (ve çalışmaları), arasında tutarlı bir perdeleme stratejisi kesin olarak alt kümeleri arasında ayırımcılık girişiminde yerine uyguluyor, vurgular. Kesin çoğunluğuna işlevi değerlendirirken daha önemli olsa da, değişiklik işaretleyici ifade alt kümeleri arasında artımlı12,14, ve böylece tekrar, perdeleme tutarlılık belki anahtar. Bu nedenle, nesnel tekrarlanarak monosit alt kümeleri farklı örnekleri arasında apportions yöntemi çoğunluğuna gereklidir. Burada sunulan yöntemin amacı monosit alt kümeleri net bir açıklama ile kapı etmektir ve gating tekniği için gerekçe istihdam ve yüzey marker ifade, böylece araştırmacılar izin veren bir yöntem sağlamak için alt kümeleri değerlendirmek farklı örnekler değerlendirirken bu tekniğin kullanımı duyulan güven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>7128959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style)</td>
			<td>Invitro technologies</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [M&#966;P9]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8]</td>
			<td>Abcam Australia</td>
			<td>ab140477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1 &#954; Isotype Control [MOPC-21]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Lot # 4283901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556018</td>
			<td>Lot # 2335626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558592</td>
			<td>Lot # 36768</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555658</td>
			<td>Lot # 3109766</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561001</td>
			<td>Lot # 3228959</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2A Isotype control [20102]</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC003P</td>
			<td>Lot # 1212031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235]</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB226P</td>
			<td>Lot # 612051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control [MOPC-21]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Lot # B220359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>336107</td>
			<td>Lot # B143544</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347347</td>
			<td>Lot # 3010929</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561741</td>
			<td>Lot # 2307721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159]</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561903</td>
			<td>Lot # 3011796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5]</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305105</td>
			<td>Lot # B154037</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiLyse C</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A11895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic haematology analyser, XT-1800i</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge GS-6R</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software v10.0.7</td>
			<td>Tree Star Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of human monocyte subsets by whole blood flow cytometry analysis

Monosit çeşitli inflamatuar hastalıklarda önemli katkıda bulunan ve onların alt oranlarını ve işlevler, dahil olmak üzere bu hücreler için değişiklik patolojik önemi olabilir. Örnekleri bu yöntem tarafından en az işlenmesi manipülasyonun Hücre aktivasyonu sınırları olarak monosit değişiklikleri incelemek için bir ideal tam kan akış sitometresi yöntemidir. Ancak, birçok farklı yaklaşımlar alt kümeleri tutarsız tanımlaması için çalışmalar arasında lider monosit alt kümeleri kapı için alınır. Burada biz tanımlamak ve insan monosit alt kümeleri (klasik, ara ve klasik olmayan) karakterize için tam kan akış sitometresi kullanarak bir yöntem göstermek. Akış Sitometresi için kan örnekleri hazırlamak, (sağlamak bulaşıcı hücreleri kaldırılmıştır) alt kümeleri kapı ve monosit alt ifade yüzey işaretlerinin belirlemek için izlenecek verilmiştir — Bu örnek M1 ve M2 işaretleri. Bu iletişim kuralı monosit alt oranlarını ve diğer işlev işaretçileri monosit alt ifade değerlendirmek için standart bir perdeleme yöntemini gerektirir diğer çalışmalar için genişletilebilir.

Monosit gating strateji ve burada kullanılan Akış Sitometresi Analizi (Şekil 1) başarıyla monosit alt kümeleri geçişli ve onların göreli oranlarını ortaya koydu. Oranlar (için bu örnek) %88.1 classicals, %4,33 ara ürün ve %7,49 non-classicals hesaplanmıştır. Bu alt küme küme küme kapılardan B hücreleri, T hücreleri, nötrofiller veya işaretçileri olan CD19, CD3, CD56 ve CD66b, sırasıyla doğrulandı NK hücreleri ile kontamine değil. Diğer nüfus göreli konumunu değerlendirme tarafından bu T hücreleri ve nötrofil de monosit "┐" şeklin dışını CD16/CD14 Arsa (Şekil 2A ve 2B) düşmek açıktır. Ancak, NK hücreleri ve B hücre popülasyonlarının klasik olmayan monosit nüfus (Şekil 2B ve 2 C) ile üst üste. Perdeleme strateji (Şekil 1 d ve 1E) adımlardan NK hücreleri (Şekil 3A) ve B hücreleri (Şekil 3B) dışlamak için teyit edildi. B hücre nüfus klasik olmayan monosit içerdiği halde tutar ihmal edilebilir.
Alt kümeleri için onlar farklı yüzey işaretleyicileri, M1 ifade derecesi geçişli (CD64, CD86 ve CD120b) ve M2 (CD163, CD11b ve CD93) değerlendirildi. Veri işaretleyicilerini olumlu ifade karşılık gelen izotip kontrollere göre çubuk grafikler (Şekil 4) shift tarafından görüldüğü gibi gösterdi. Veri işaretleyicilerini sayılarının izotip denetimleri daha büyük.
Bu perdeleme stratejinin uygulamaya dört tüpler içine bölünmüş oldu, bir kan örneği lekeli ve ayrı ayrı, verimleri tüpler (Tablo 4) arasında karşılaştırılabilir sonuçları analiz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg"> Şekil 1: temsilcisi monosit bütün insan kan stratejisinde geçişi. (A) FSC(A) vs FSC(H) Arsa: bir eşit alan ve yükseklik içeren hücreleri geçişi, böylece kümeleri kaldırma (FSC(H)) ve enkaz (çok düşük FSC) göre daha büyük FSC(A) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) Arsa: monosit geniş seçim SSC/FSC özelliklerine dayalı. (C) CD16 vs CD14 Arsa: monosit seçmek için çoğunluğuna dayanarak onların karakteristik "┐" şekil. (D) CD16 vs HLA-DR Arsa: Gating HLA-DR pozitif hücreleri seçin ve NK hücreleri kaldırmak için. (E) CD14 vs HLA-DR: Gating B hücreleri (HLA-DR yüksek/CD14 düşük) monosit dışlamak için. (F) seçili monosit monosit alt kümeleri kapı için CD16 vs CD14 arsa üzerinde gibi görünürler. A-F için renk mavi ve yeşil düşük yoğunluklu, kırmızı ve turuncu yüksek yoğunluklu gösteren ve orta sınıf yoğunluğu gösteren turuncu gösteren hücre yoğunluk temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg"> Şekil 2: doğrulama stratejisi potansiyel kirletici hücreleri tarafından teşhis kodu perdeleme. Potansiyel bulaşıcı hücreleri işaretleri tarafından tanımlanır (A) T hücreleri (CD3), (B) B hücreleri (CD19), (C) NK hücreleri (CD56) ve (D) nötrofil (CD66b). Sol yan paneller Şekil 1A ve 1B, başı olarak hücre yoğunluğu yüksek temsil eden renk geçişi sonra her nüfus tanımlaması (kırmızı) (mavi) düşük göstermek. Sağ yan paneller her hücre popülasyon (mavi) yakınlık monosit (kırmızı) için bu örneğin alınma olasılığını ortaya çıkarmak için son monosit CD16/CD14 arsa üzerinde üst üste göster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg"> Şekil 3: gating adımları bulaşıcı hücre kaldırma onayı. Isı derecesi düşük yüksek (kırmızı) gelen ifadenin (mavi)(a)CD56 ve (B) CD19 gösterilen eşleştirir. Perdeleme adımları başarıyla yüksek CD56 hücrelerle hariç (NK hücreleri) ve yüksek CD19 (B hücreleri). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg"> Şekil 4: M1 monosit ifade (CD120b) ve M2 (CD93) işaretleri. Histogramlar monosit M1 ve M2 marker ifade (izotip açısından net değişimi(a)classicals, (B) ara ürün ve (C) Sigara-classicals (kırmızı) gösteren mavi) düzeltti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antikor</td>
			<td>Birim (50 µL kan)</td>
			<td>Birim (16 x) 800 µL kan</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14 - V450</td>
			<td>0,75 ΜL</td>
			<td>12 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16 - APC</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR-PerCP</td>
			<td>0.625 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Antikor tam kan akışı ve ana karışımı için.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tüp</td>
			<td>PE antikorlar</td>
			<td>Kodu</td>
			<td>İzotip maç</td>
			<td>Hisse senedi toplama</td>
			<td>Çalışma birimi</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Igg1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>0.625 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>BD Igg1</td>
			<td>0,125 µg/20 µL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>BD Igg1</td>
			<td>0,06 µg/20µL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Igg1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>BD Igg1</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>BD Igg1</td>
			<td>1.0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Igg2a</td>
			<td>Ar- Ge (IC003P)</td>
			<td>NA</td>
			<td>25 µg/mL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>Ar- Ge (FAB226P)</td>
			<td>R & D Igg2a</td>
			<td>25 µg/mL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Igg1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>BL Igg1</td>
			<td>50 µg/mL</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: M1/M2-PE Fluorochrome monoklonal antikorlar tam kan akışı için etiketli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tüp</td>
			<td>Antikor</td>
			<td>Çalışma birimi</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>CD3</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>CD19</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>CD66b</td>
			<td>1,25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>CD56</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: PE Fluorochrome (T hücreleri, B hücreleri) lenfositler, nötrofiller ve NK hücreleri monoklonal antikor etiketli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tüp</td>
			<td>% Klasik</td>
			<td>% Orta</td>
			<td>% Klasik olmayan</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.11</td>
			<td>10.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>84.2</td>
			<td>5,05</td>
			<td>10,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5,03</td>
			<td>10,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>81.6</td>
			<td>5,03</td>
			<td>12,1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: Monosit alt oranlarda lekeli ve ayrı ayrı analiz bir kan örneği.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Bu teknik immünoloji alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Örneğin, hastalık durumlarında monosit alt kümesi oranlarının veya farklı belirteçlerin nasıl ifade edildiğinin belirlenmesi gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin kendi yerel durumuna yakın olması ve açık talimatlar ve gerekçeler, standart bir gating yöntemi sağlamak için kullanılır.Birçok makale hücrelerin gating nasıl yapıldığı konusunda net talimatlar vermez, çünkü genellikle, bu yönteme yeni bireyler, mücadele edebilir. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, kan örneklerinin toplanması ve beyaz kan hücresi sayısının belirlenmesi ile bu protokole başlayın. Mililitre başına yaklaşık 5 milyon beyaz kan hücresi konsantrasyonu ayarlamak için fosfat-tamponlu tuzlu ile kan seyreltmek.Kan, anti CD14-V450, anti CD16-APC ve anti HLA-DR-PerCP birleştirerek tüplerin sayısı için yeterli ana karışımı hazırlayın. Girdap ve pipet 51.9 mikrolitre karışımı her tüp içine. Pe etiketli M1 ve M2 marker antikorların yanı sıra T hücreleri, B hücreleri, nötrofiller ve doğal öldürücü hücreler için belirteçleri de ilgili tüplere ekleyin.Girdap ve inkübasyon 30 dakika boyunca karanlıkta 4 santigrat derece. Şimdi, 250 mikrolitre kombine kırmızı kan hücresi lisisve beyaz kan hücresi sabitleme çözeltisi ekleyin ve hemen karışımı yavaşça girdaplayın. Girdaplı karışımı karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yatırın, 4 derece.10 dakika sonra, PBS 250 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, 260g hücreleri aşağı spin. Supernatant çıkarın ve% 1 formaldehit 300 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Analiz yapılana kadar ışıktan korunan hücreleri dört derecede saklayın.Akış sitometrisi numune hazırlığından sonraki 48 saat içinde yapılmalıdır. Başlamak için, tesis personelinin kalite kontrol kontrolleri yaptığından emin olmak için akış sitometre günlüğünü kontrol edin. Akış sitometri deneyi kurmak için, tüpler eklemek için yeni deney, ardından yeni örnek ve yeni tüp tıklayın.Simgeye tıklayarak bivariate çizimleri seçin ve erişim parametrelerini seçmek için açılır menüleri kullanın. Bir CD16/CD14 çizimi ve satın almayı izlemek için zaman yanında dedektör gösteren bir çizimin eklenmesini sağlayın. Tüpü ekleyin ve tıklayın, edinin.Dedektör sinyallerinin ölçek dışında olmamasını sağlayarak gösterge gerilim ayarlarını kontrol edin. CD14/CD16 çiziminin monosit kapısına düşen hücreleri gözlemleyin. Klasik monosit kapısı için kayıt eşiğini 5.000 olay olarak ayarlayın ve kayda tıklayın.Kalan tüpler için veri kaydetmeye devam edin. Tüm tüplere ait veriler kaydedildikten sonra, akış verilerini analiz için fcs dosyaları olarak dışa aktarın. Monosit gating gerçekleştirmek için, analiz yazılımında dosyaları açın, tüp adını çift tıklatın ve ileri dağılım alanı ve ileri dağılım yüksekliği çizim hücreleri görselleştirmek için açılır menülerden parametreleri seçin.Çokgen kapı araç simgesini tıklatarak ve hücreleri çevreleyerek bir çift dışlama kapısı oluşturun. Geçitli bölgeye çift tıklayarak kapılı hücreleri seçin. Yeni ekran kutusunda, hücreleri ileri dağılım alanında n için yan dağılım alanı çiziminde görüntülemek için açılır menü parametrelerini ayarlayın.Dikdörtgen kapı simgesine tıklayın ve cömertçe lenfositler, doğal öldürücü hücreler ve granülositlerin çoğunluğu dışlamak için, ileri ve yan dağılım özelliklerine dayalı monosit popülasyon seçin. Kapılı hücreleri seçin ve açılan menüleri kullanarak parametreleri seçerek CD14/CD16 çiziminde yeniden görüntüleyin. Karakteristik, ters l şekline göre monositleri seçmek için çokgen kapısına tıklayın.Klasik olmayan popülasyon solundaki hücrelerden farklı değilse, kontaminasyon muhtemeldir ve araştırılmalıdır. Geçitli hücreleri seçin ve parametreleri seçmek için açılır menüleri kullanarak monositleri CD/16 HLA-DR çiziminde görüntüleyin. HLA-DR pozitif hücreleri seçmek ve kalan doğal öldürücü hücreleri ve nötrofilleri dışlamak için çokgen kapısına tıklayın.Geçitli hücreleri seçin ve parametreleri seçmek için açılır menüleri kullanarak HLA-DR pozitif hücrelerini CD14/HLA-DR çiziminde görüntüleyin. Çokgen kapısına tıklayın ve HLA-DR yüksek/CD14 düşük B hücrelerini dışlamak için bir kapı çizin. Kapılı hücreleri seçin ve cd16/CD14 çiziminde görüntülemek için açılır menüleri kullanın.Çizim seçeneklerinden, alt küme oranlarını belirlemek için monosit alt küme kapılarının çizilmesini sağlayacak zebra çizimini seçin. Şimdi, dikdörtgen kapı simgesine tıklayın ve CD14 yüksek/CD16 düşük klasik monosit popülasyonu etrafında yaklaşık dikdörtgen bir kapı çizerek klasik monositleri seçin. Ekranda, klasik monositler için ortanca floresan yoğunluğunu görüntülemek için ortancaları seçin, gösterin.Geçidi, popülasyonun soldaki ve sağdaki ortancadan eşit dağılıma sahip olması ve soldaki tüm hücreleri kapsayacak şekilde ayarlayın. Klasik kapının sağına hücreleri kapsayan dikdörtgen bir geçit çizerek ara popülasyonu seçin. Tamamen klasik monosit kapısı içinde olan eşmerkezli dairelerin alt kısmıyla kapıyı hizalayarak, klasik olmayan hücreleri dışlamak için kapının alt kısmını ayarlayın.Klasik olmayan alt kümeyi, ara alt kümenin alt kenarından dikdörtgen bir kutu çizerek ve tüm hücreleri popülasyonun altına seçerek kaplayın. Ekranın altında, her monosit alt kümesinin yüzdesini belirlemek için kapı sıklıklarını seçin, gösterin. Son olarak, her monosit alt kümesinden hücreleri seçin.Her monosit alt kümesi için her işaretçiyi görüntüleyen bir histogram oluşturmak için açılır parametreyi değiştirin. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi ortanca veya geometrik ortalamayı kullanarak ifade derecesini hesaplayın. Başarıyla kapılı monosit popülasyonları burada gösterilmiştir.Ve oranlar literatürdekilerle aynı doğrultuda. Bu örneklem için oranlar% 88.1 klasik, % 4.33 ara ve% 7.49 klasik olmayan olarak hesaplanmıştır. Diğer popülasyonların göreceli konumunu değerlendirerek, burada mavi renkte gösterilen T hücreleri ve nötrofillerin cd16/CD14 çiziminde monosit, ters l şeklinin dışında iyi takip ettiği açıktır.Ancak, hem doğal öldürücü hücreler hem de Burada mavi renkte gösterilen B hücre popülasyonları klasik olmayan monosit popülasyonuyla örtüştü. Kontamine hücre tiplerinin kaldırıldığını doğrulayan ısı haritaları burada gösterilmiştir. Doğal öldürücü hücreler HLA-DR CD16 adımı ile dışarı kapılı olmuştur, oysa, B hücreleri HLA-DR CD/14 adım tarafından dışarı kapılı edilmiştir.Kırmızı renkteki izotip kontrollerine göre mavi renkteki M1 ve M2 işaretçilerin ifadesi burada gösterilmiştir. CD120b bir M1 işaretçisi, tüm monosit alt kümeleri için, onun iyotip kontrolü üzerinde net bir kayma gösterir. Bu aynı zamanda CD93 bir M2 işaretleyici için de geçerlidir, ifade klasik, orta orta ve klasik olmayan düşük yüksek tir.Bu yordamı denerken, kontamine olan hücrelerin dışarı yalıtılmış olduğundan emin olmak önemlidir, çünkü aksi takdirde sayısal ifadeye katkıda bulunabilirler. Bu yordamı takiben, diğer belirteçleri incelenebilir. Gibi ek sorulara cevap vermek için, nasıl monosit marker ekspresyon değişiklikleri hastalık.İnsan kanı ve formaldehit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, ve bu nedenle kişisel koruyucu ekipman ve biyolojik tehlike başlığı kullanma gibi önlemler, bu işlemi yaparken her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...