Le colture in vitro di organi parziali o interi vengono spesso utilizzate per modellare con precisione la funzione dei tessuti e degli organi in varie condizioni di prova. La coltura di organi interi può comportare la decellularizzazione di un organo asportato o la rimozione di cellule al fine di utilizzare la struttura dell'organo nativo. Questo è seguito dalla ricellularizzazione con nuove cellule. L'uso di bioreattori specializzati è spesso incorporato nel processo di ricellularizzazione per imitare la crescita dei tessuti nel corpo. Questo video introdurrà i principi fondamentali alla base della coltura di tessuti di organi interi e dimostrerà la procedura in laboratorio.
Questo processo inizia con il prelievo di un organo donatore. In questo esempio, mostriamo un polmone donatore da una scimmia. Attraverso un processo chiamato perfusione detergente, l'organo isolato viene sistematicamente ripulito dalla sua popolazione cellulare nativa da una serie di lavaggi, risultando in una matrice di organi acellulari sterili. Successivamente, la matrice tissutale viene ricellularizzata utilizzando tipi di cellule specifiche, come una linea di cellule staminali stabilita. Le cellule possono anche essere donate dalla persona che sta ricevendo il tessuto ingegnerizzato, chiamato trapianto di cellule autologhe. Questo mitiga il rigetto e migliora la biocompatibilità dell'organo. In alternativa, le cellule possono essere utilizzate da un donatore diverso, chiamato trapianto allogenico. Questo potrebbe dover essere perseguito se un numero sufficiente di cellule non può essere raccolto dal potenziale destinatario. Una volta che le cellule sono seminate sull'organo, i bioreattori tissutali vengono utilizzati per stimolare la proliferazione cellulare e dirigere la crescita dei tessuti. Questi reattori mirano a coltura dinamica dell'organo e imitare l'ambiente nativo trovato in vivo. Ad esempio, l'organo può essere collegato a una pompa peristaltica per simulare il flusso sanguigno. Ora che hai imparato a conoscere i principi della cultura degli organi, diamo un'occhiata a una procedura di esempio che coinvolge l'intera coltura di organi dei polmoni dei donatori.
Per iniziare, i polmoni del donatore vengono posti in un vassoio di dissezione e l'arteria polmonare puònuolarsi introducendo un connettore luer femminile nella cavità aperta. Un secondo connettore luer femmina viene quindi inserito nell'apertura tracheale. Fosfato tamponato soluzione salina o PBS contenente 30 unità per millilitri di eparina e cinque microgrammi per millilitro di nitroprussiato di sodio viene quindi instillato per facilitare l'allargamento dei vasi sanguigni e la rimozione dell'aria intrappolata dai polmoni. La soluzione viene espulsa dal rinculo naturale e ripetuta altre due volte prima di tappare la cannula, per trattenere la soluzione nei polmoni per sciogliere il sangue residuo. Quindi, entrambi gli atri vengono lacerati e il cappuccio tracheale della cannula luer viene rimosso per facilitare il drenaggio dei liquidi. La perfusione viene continuata con PBS, eparina e soluzione di nitroprussiato di sodio fino a quando la maggior quantità possibile di sangue viene rimossa dalla vascolarizzazione polmonare. Per iniziare la decellurizzazione, i polmoni vengono gonfiati e permeati di acqua deionizzata. Dopo cinque lavaggi arteriosi e vascolari, i polmoni vengono rimossi dall'acqua e immersi in un detergente chiamato Triton per rimuovere le cellule mentre colpiscono minimamente la matrice dell'organo. I polmoni vengono gonfiati altre due volte con la soluzione di Triton prima di incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, i polmoni vengono lavati altre cinque volte con acqua deionizzata fresca. Successivamente, i polmoni vengono immersi in una soluzione di desossicolato di sodio al 2% e quindi lavati più volte con acqua e soluzione tampone per facilitare la decellularizzazione e la rimozione dei detriti cellulari. Quando completamente pulito, l'organo viene conservato in soluzione sterile di PBS a quattro gradi Celsius fino all'uso.
Per imitare il comportamento naturale dei polmoni può essere utilizzato un bioreattore specializzato, come quello mostrato qui. In primo luogo, la camera principale del reattore è riempita con un terreno di coltura che è stato bilanciato con l'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Quindi viene installato l'organo. Una volta collegato, il coperchio viene fissato e tutta l'aria viene rimossa dal tubo utilizzando una siringa. Il bioreattore viene quindi spostato in un incubatore di colture tissutali per equilibrare. Successivamente, i polmoni vengono ventilati con circa un respiro completo ogni due minuti e il mezzo viene fatto circolare attraverso la vascolarizzazione, tramite la pompa peristaltica, a circa 10 millilitri al minuto per un totale di 30 minuti.
Per la semina delle vie aeree, i polmoni vengono gonfiati con una sospensione cellulare contenente cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo. Per ricellularizzare gli alveoli, che sono responsabili dello scambio di ossigeno e anidride carbonica che avviene nei polmoni. I polmoni vengono quindi incubati durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi alla matrice decellularizzata. Dopo l'incubazione notturna, la ventilazione viene riavviata e le cellule possono crescere nella matrice dell'organo per diversi giorni. Successivamente, la semina vascolare è completata dalla graduale introduzione di cellule endoteliali utilizzando la pompa peristaltica per avviare la ricellularizzazione di piccoli vasi e quindi coltivata staticamente per diverse ore per facilitare lo sviluppo di un organo cellulare accurato. Il terreno di coltura viene nuovamente fatto circolare e le cellule vengono coltivate per una settimana per promuovere la crescita e l'attaccamento in condizioni dinamiche. Una volta completata la crescita tissutale, viene eseguita l'istologia per confermare l'attaccamento e la crescita sia delle cellule staminali mesenchimali che delle cellule endoteliali sulla vascolarizzazione e sulle vie aeree dell'organo. L'istologia mostra l'attaccamento delle cellule staminali mesenchimali e delle cellule endoteliali agli alveoli all'interno dell'impalcatura della matrice e dei piccoli vasi vascolari, creando l'aspetto del tessuto polmonare nativo.
Ora che hai imparato a conoscere la cultura dell'intero organo, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni pratiche di questa tecnologia al di fuori dell'obiettivo primario della medicina rigenerativa e della sostituzione degli organi. La coltura di organi interi può anche essere utilizzata come un modo per testare agenti farmaceutici o dispositivi di somministrazione di farmaci. Ad esempio, in questo studio, le tiroide embrionali di topo sono state espiantate, coltivate e utilizzate come modello di organo per osservare come gli agenti farmaceutici sperimentali vengono trasportati attraverso l'organo e il tessuto. Questa simulazione può alla fine portare a una rappresentazione più realistica di come un farmaco viene trasferito all'interno di un organo in vivo. Infine, la coltura di tessuti interi organi può essere utilizzata per studiare il comportamento dei tessuti in varie condizioni. Ad esempio, i dischi intervertebrali sono stati raccolti dalle code bovine per studiare i possibili meccanismi di degenerazione del disco. Sono stati impiegati bioreattori appositamente progettati per indurre il carico meccanico sul disco al fine di comprendere meglio come questi carichi influiscono sulla degenerazione.
Hai appena visto il video di Jove su Whole Organ Tissue Culture. Ora dovresti capire come interi organi possono essere coltivati in vitro e come questa tecnica viene applicata nel campo della bioingegneria. Grazie per l'attenzione.
