Name: semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet med priser fra Chefforskers Office (TCS/16/37) og en MRC ph.d.-stipendium.

1. såning humane pluripotente stamceller (hPSCs) i 96 godt plader For hepatocyt differentiering
Bemærk: Reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol er blevet anført i tabel 1. Medier anvendt til dette eksperiment skal være sterilt og ved stuetemperatur til cellekultur. Alle reagens/løsning diskenheder beskrevet i denne del af protokollen er baseret på et enkelt godt af en 96-brønd plade, medmindre andet er angivet.
<ol><li>
Forberede laminin belagt 96 godt plader.
	<ol>
<li>Optø et hætteglas af rekombinant laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) for 2 h til natten over ved 4 ° C.</li>
		<li>Forbered en 5 µg/mL løsning ved at fortynde LN-521 i iskold 1 x Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) (med Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>Bruge en automatisk væske håndtering dispenser med en standard tube udlevering kassette for at tilføje 50 µL af opløsningen LN-521 pr. brønd af et 96 godt plade. Bemærk: Alle volumen dispenserer er udført med en automatisk flydende håndtering dispenser med en standard tube udlevering kassette, medmindre andet er angivet. Prime løsningen, indtil den når den udlevering slutningen af kassetten, derefter gå til at undvære. Flere 96 godt plader kan tilberedes på samme eksperimentet ved at gentage procedure så mange gange som nødvendigt.</li>
		<li>Inkubér LN521-belagte plader på 37 °C/5% CO2 for 2 til 4 h. Bemærk: LN521-belagte plader kan lagres til to uger ved 4 ° C. Holde pladerne forsegles på en flad overflade for at undgå fordampning og kontaminering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Varm op det krævede antal forhånd belagte plader ved 37 ° C i 30 min. til 1 time.</li>
	<li>Opsug den resterende LN-521 løsning af coated overflade ved hjælp af en 8-kanal aspiration adapter. Bemærk: Det er afgørende for at undgå enhver kontakt med den coatede overflade at undgå belægning nedbrydning.</li>
	<li>Straks tilføje 50 µL pr. brønd mTeSR1 medium suppleret med 10 µM Rho-associerede kinase (ROCK) hæmmer Y27632 og holde pladen i rugemaskinen indtil cellen såning på 37 °C/5% CO2. Bemærk: Lad ikke de laminin-coatede brønde til tørre.</li>
	<li>
Forberede en cellesuspension af 3 x 105 celler/mL i mTeSR1 medium suppleret med 10 µM ROCK hæmmer Y27632. Bemærk: Seeding massefylden for hver cellelinje vil kræve optimering.<ol>
<li>Opsug mediet fra en petriskål med en udifferentieret kultur af hPSCs på ca 75-85% confluency kulturperler på LN-521 som tidligere beskrevet12. Bemærk: hPSCs er kulturperler på LN-521 i mTSER1 med medium ændret hver 24 timer, og passaged regelmæssigt når cellerne nå 80% af confluency som tidligere beskrevet12.</li>
		<li>Cellerne vaskes med 5 mL af stuetemperatur 1 x DPBS (uden Ca2 +/Mg2 +) og aspirat bufferen.</li>
		<li>Der tilsættes 5 mL af 1 x blid celle Dissociation reagens til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 6-8 min. til celle dissociation. Bemærk: For at stoppe reaktionen, undersøge udstationering af celler fra matrix under mikroskop. Cellerne skal være delvist løsrevet fra pladen. Hvis ikke, udvide inkubation i en ekstra 1-2 min.</li>
		<li>Ophæve reaktionen ved sugning blid celle Dissociation reagens og tilsættes 5 mL frisk mTeSR1 medium suppleret med 10 µM ROCK hæmmer Y27632 til cellerne. Brug en celle skraber til at løfte celler fra matrix og pipetteres op og ned ved hjælp af en P1000 tip flere gange at blande.</li>
		<li>Tælle de levedygtige celler ved hjælp af en hemocytometer baseret på Trypan blå farvning udstødelse metode og forberede cellesuspension med kræves koncentrationer.</li>
		<li>Der afpipetteres det ønskede antal celler i et sterilt 15 mL eller 50 mL-centrifugerør og spin cellerne ned ved centrifugering dem på 115 x g i 5 min ved stuetemperatur. Bemærk: For en 96 godt plade, 5 mL af mTeSR1 medium indeholdende 3 x 105 celler/mL er nødvendig for H9 cellelinie.</li>
		<li>Opsug supernatanten og forsigtigt resuspenderes celle indtil en ensartet løsning opnås ved 37 ° C i mTeSR1 medium suppleret med 10 µM ROCK hæmmer Y27632. Bemærk: Brugen af ROCK hæmmer anbefales, da det forbedrer celle overlevelse indlæg re plating.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilsæt 50 µL af cellesuspension på 96 godt pladen som indeholder 50 µL af mTeSR1 med 10 µM ROCK hæmmer Y27632.</li>
	<li>Efter såning, returnere plader til celle inkubator på 37 °C/5% CO2 til 24 timer at tillader cellerne til at vedhæfte.</li>
	<li>Undersøge cellerne næste dag og trække ROCK inhibitor, når celle til celle-kontakt er blevet oprettet. På 40% confluency, skifte til differentiering mellem (figur 1B). Bemærk: Hvis cellen confluency er højere end 40%, pladerne er ikke egnet til HLC differentiering med H9 cellelinie.</li>
</ol>2. differentiere hPSCs for hepatocyt-lignende celler på rekombinante Laminins i 96 godt plader
<ol><li>
Forberede differentieringen medium og vækst faktorer.
	<ol>
<li>Forberede menneskelige Activin A stamopløsning (100 µg/mL) ved at opløse menneskelige Activin A pulver i sterile 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Alikvot bestanden og opbevares ved-20 ° C. Brug på 1:1, 000.</li>
		<li>Forberede mus Wnt3a stamopløsning (10 µg/mL) ved opløsning mus Wnt3a pulver i sterile 0,2% BSA. Alikvot bestanden og opbevares ved-20 ° C. Bruge på 1:200.</li>
		<li>Forberede menneskelige hepatocyt vækstfaktor (HGF) stamopløsning (10 µg/mL) ved at opløse menneskelige HGF pulver i sterile 0,2% BSA. Alikvot bestanden og opbevares ved-20 ° C. Bruge på 1:1000.</li>
		<li>Forberede Oncostatin M (OSM) stamopløsning (20 µg/mL) ved at opløse pulveret i sterile 0,2% BSA. Alikvot bestanden og opbevares ved-20 ° C. Brug på 1:1, 000.</li>
		<li>Endelige endoderm: forberede endoderm differentiering medium, bestående af 2% B27 supplement (50 x, uden insulin), 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer: 100 IE/mL og 100 µg/mL, henholdsvis) tilføjet til Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) basal medium. Opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for to uger. På hvert medium forandring, supplere den krævede diskenhed med Activin A og Wnt3a i endelig koncentration på 100 ng/mL og 50 ng/mL, henholdsvis.</li>
		<li>Hepatoblast differentiering: forberede hepatoblast differentiering medium, bestående af 20% knockout serum udskiftning (KSR), 0,5% alternativ supplement til L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, 1% DMSO og 1% penicillin/streptomycin (endelig koncentration på 100 IU/mL og 100 µg/mL, henholdsvis) tilføjet til knockout DMEM (KO-DMEM). Filtrer under vakuum og opbevares ved 4 ° C. Brug inden for to uger.</li>
		<li>Hepatocyt differentiering: forberede hepatocyt differentiering medium, bestående af 1% alternativ supplement til L-glutamin, 10 µM hydrocortison 21-hemisuccinate natriumsalt (HCC), 1% penicillin/streptomycin (endelig koncentration på 100 IU/mL og 100 µg/mL, henholdsvis) tilføjet til HepatoZYME medium. Opbevares lager ved 4 ° C og anvendes inden for to uger. For hvert medium forandring, supplere den krævede diskenhed med HGF og OSM (endelig koncentration på 10 ng/mL og 20 ng/mL, henholdsvis).</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 h post såning, forsigtigt fjerne medium ved hjælp af en automatisk håndholdte elektroniske kanal pipette system og tilsæt 100 µL af frisk endoderm-priming medium suppleret med 100 ng/mL Activin A og 50 ng/mL Wnt3a. Bemærk: Differentiering proces påbegyndes når den endelige endoderm medium er blevet tilføjet. Når cellen såning er optimeret, indledte den Celledifferentiering normalt inden for 24 timer. Alle medium ændringer er udført ved at fjerne medium med en automatisk håndholdte elektroniske kanal pipette system og udlevering 100 µL af frisk medium ved hjælp af en automatisk flydende håndtering dispenser med en standard tube udlevering kassette, medmindre andet angivet. En automatisk håndholdte elektroniske kanal pipette system blev brugt med et godt hoved, ved hjælp af 300 µL tips 96. Kort sagt, 90 µL var indsugning fra de godt at undgå enhver kontakt med cellerne, og det er vigtigt ikke tørre celler under medium forandring at reducere celle stress.</li>
	<li>For humane embryonale stamceller (hESCs), skal du ændre endoderm differentiering mellem dagligt i tre dage. Hvis differentieringen er udført for menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), forlænge den endelige endoderm fase 2 ekstra dage hjælp Activin A kun.</li>
	<li>Efter endelig endoderm induktion, skifte til KSR/DMSO medium for hepatoblast specifikation og ændre medium hver 2 dage til 5 dage. Bemærk: Hvis der er et antal løsgængere celler i brønden, bruge ikke-suppleret KO-DMEM for at vaske cellerne en gang før den næste ændring af medium. På grund af varigheden af den anden fase af protokollen (5 dage), vil der være 3 mellemstore ændringer med den sidste, den sidste dag hepatoblast specifikation.</li>
	<li>Efter hepatoblast differentiering, skifte til HepatoZYME medium for hepatocyt modning. Cellerne vaskes en gang med HepatoZYME uden tillæg efter fjernelse KSR/DMSO medium og tilsæt 100 µL af HepatoZYME modning medium suppleret med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>Ændre medium hver 48 h i 7 til 10 dage. På dag 18 af differentiering, karakterisere HLCs ved at analysere genekspression og CYP P450 metaboliske aktivitet.</li>
</ol>3. karakterisering af hepatocyt-lignende celler differentieret på rekombinante Laminins
<ol><li>Opdage udtryk for hepatocyt-specifikke markører og polarisering markører ved hjælp af immunfarvning.</li>
	<li>Test hepatocyt metabolisk funktion ved hjælp af CYP P450 assays som beskrevet før12.</li>
	<li>Bestemme den variation, plade, tælle antallet af celler pr. brønd pr. plade.</li>
</ol>4. high Throughput immuncytokemi og Image erhvervelse
<ol><li>På dag 18 af differentiering, brøndene vaskes tre gange med 1 x DPBS, løse HLCs ved udlevering 50 µL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og inkuberes ved stuetemperatur i 15-30 min. Efter fiksering, vaskes tre gange med PBST (0,1% tween) (uden Ca2 +/Mg2 +) ved hjælp af en automatisk plade skive. Bemærk: Alle vasker i denne afdeling udføres ved hjælp af en automatisk plade vasker, medmindre andet er angivet. Alle vasker er udført efter samme protokol.</li>
	<li>Permeabilize membranen af dosisdispensering 100 µL af PBST (uden Ca2 +/Mg2 +), og der inkuberes i 20 min. ved stuetemperatur. Næste, udføre protein blokering af dosisdispensering 100 µL af 10% BSA i PBST og Inkuber i 1 time i blide ryster ved hjælp af en plade shaker. Efter protein blokering, tilsættes 50 µL af 1% BSA i PBST indeholdende de primære antistoffer, inkuberes ved 4 ° C natten over med blid ryster ved hjælp af en plade shaker. Bemærk: Ikke vaskes mellem protein blok og antistof tilsætning.</li>
	<li>Efter 24 timer vaskes tre gange med 1 x DPBS (uden Ca2 +/Mg2 +) og føje den sekundære antistof ved udlevering 50 µL af 1% BSA i PBST. Inkubér 1 time ved stuetemperatur i mørke.</li>
	<li>Efter inkubationen sekundær antistof vask 3 gange med 1 x DPBS. Tilsæt 50 µL af DPBS med DAPI (10 µg/mL) og Inkuber i 5-10 min. ved stuetemperatur i mørke.</li>
	<li>Endelig, vask 3 gange med DPBS og forlade 100 µL af 1 x DPBS i brønden. Pladerne er klar til billedbehandling. Bemærk: Pladerne skal opbevares ved 4 ° C i mørke indtil billeddannelse.</li>
	<li>Billede pladen ved hjælp af en high-indhold billedbehandlingssystem, og erhverve flere felter på tværs af godt at få en god repræsentation af brønden. Kvantificere udtryk for de forskellige markører i HLCs ved hjælp af Columbus software (High-indhold Imaging analyse systemsoftware). Bemærk: Columbus er en høj indholdsanalyse software, som tilbyder celle Segmenteringsanalyse for celle fænotyper. Lignende resultater kan opnås ved hjælp af CellProfiler, en open source-software til kvantitativ analyse af biologiske billeder22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Choudhury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+model+pazopanib-mediated+hepatotoxicity.">Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity.</a> Sci Rep. 7, 41238 (2017).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+interindividual+differences+in+hepatic+functions+and+drug+sensitivity+by+using+human+iPS-derived+hepatocytes.">Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+of+hESC/hiPSC-derived+hepatocyte-like+cells+for+drug+toxicity+testing.">3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing.</a> Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Iii, R. L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+by+3D-Culture.">Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture.</a> PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).</li><li>Chen, Y. -. F., Tseng, C. -. Y., Wang, H. -. W., Kuo, H. -. C., Yang, V. W., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+mature+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+an+efficient+three-step+protocol.">Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol.</a> Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Self-Renewal+of+Human+ES/iPS-Derived+Hepatoblast-like+Cells+on+Human+Laminin+111-Coated+Dishes.">Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes.</a> Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. , 86-100 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assay+Multiplexing+for+Toxicity+Screening+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+and+Hepatocytes.">High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes.</a> Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+images+and+morphological+profiles+of+30,000+small-molecule+treatments+using+the+Cell+Painting+assay.">A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay.</a> GigaScience. , (2017).</li><li>Pradip, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Content+Analysis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+Reveals+Drug+Induced+Steatosis+and+Phospholipidosis.">High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis.</a> Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).</li><li>Donato, M. T., G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Tolosa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high-content+screening+technology+for+studying+drug-induced+hepatotoxicity+in+preclinical+studies.">Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

Prof. David C. Hay er en co-grundlægger og direktør for Stemnovate Limited.
Prof. David C. Hay er direktør for HigherSteaks Limited.

Vores semi-automatiseret procedure er effektiv, pålidelig og økonomisk, så produktionen af HLCs på skalaen (figur 1). Der var ikke nogen signifikant forskel i antallet af celler mellem brønde i pladen, at foretage denne platform en egnet fremgangsmåde for celle-baseret screening (figur 2). Derudover semi-automation arbejdsprocessen sætter brugeren i stand til at producere store mængder af plader på én gang, hvilket ikke var muligt før ved hjælp af manuelle processer5,12.
Vigtigere, automatisering proces ikke påvirkede differentiering udbytter, med fleste af celler, der udtrykker HNF4α (89.2% ±2) og ALB (92,8% ±6) (figur 3). HLCs også udtrykt CYP P450 enzymer CYP2D6 og CYP3A4 og vises CYP1A2 og CYP3A metaboliske aktivitet sammenlignes med tidligere rapporteret eksperimenter (figur 3)5. Trods standardiseringen af protokollen er celle confluency forud for differentieringen kritisk for ren HLC differentiering. Derfor, at sikre en god celle distribution på tværs af brønden er en vigtig overvejelse (figur 1). Dette har vist sig for at være cellelinie afhængige, derfor celle såning og tæthed optimering er påkrævet for hver celle linje før skala-up.
I sin nuværende form, denne platform er ikke egnet til at producere store mængder af HLCs til kliniske applikationer, og dette vil sandsynligvis ske ved hjælp af cellefabrikker og bioreaktorer. Men den metode udviklet giver mulighed for den hurtige generation af menneskets leverceller for sygdom modellering, stof screening og narkotika nyorientering undersøgelser. Analysen er desuden imødekommenhed over for multiplexing, tillader generation af multiparametric datasæt for mekanistisk analyse. Fremadrettet, mener vi også, at denne teknologi kan anvendes til mere komplekse in vitro- systemer såsom 3D differentiering eller som en platform til at forbedre HLC fænotype i vitro.
Afslutningsvis mener vi at vores enkle og semi-automatiske system vil øge gennemløbet af eksperimentelle og reducere eksperimentel variation, dermed forbedre kvaliteten af biologiske datasæt og deres ekstrapolering mod menneskets fysiologi.

Primære humane hepatocytter (PHHs) repræsenterer den aktuelle standard for leveren biomedicinsk forskning. Trods deres fordele udgør PHHs en begrænset kilde til modne hepatocytter med ustabil fænotype1. Menneskelige embryonale stamceller (råd) og menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSC) er blevet foreslået som en kraftfuld ressource for biomedicinsk forskning, lovende en vedvarende kilde af menneskelige væv, herunder lever2,3,4 . Nuværende hepatocyt differentiering procedurer generere celler, der udtrykker hepatocyt markører, gener og funktioner, der svarer til PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Mere nylig, brugen af definerede materialer og matricer som rekombinante laminins, har forbedret celle fænotype og eksperimenterende reproducerbarhed5,12,13,14.
Traditionelle celle kultur teknikker er stærkt afhængige af manuel pipettering, som er både tidskrævende og fejl liggende. Dette begrænser overførselshastighed på analysen og formatet plade man kan arbejde med. Til dato, er de fleste undersøgelser beskriver generation af HLCs arbejdskraftintensive karakter og derfor små i størrelsen15,16,17.
Aktuelle fremskridt i flydende håndtering og pipettering systemer, kombineret med automatiserede mikroskopi og laboratorium analysatorer, har gjort det muligt at udvikle procedurer, der minimerer behovet for menneskelig indblanding. Vi har draget fordel af disse teknologier og udviklet en semi-automatiske differentiering system til at generere store mængder af menneskelige levervæv for grundlæggende og anvendt biomedicinsk forskning. Denne fremgangsmåde kan udføres med både menneskelige ESC og iPSC linjer med mindre justeringer nødvendigt, afhængigt af cellelinie. Ved at kombinere dette system med høj indholdsanalyse, viser vi at HLC fænotyper kan være mindre tidskrævende og udført på skala18,19,20,21.
I Resumé, har automatisering af celle kultur teknikker beskrevet heri ført til forbedringer i pålidelighed, eksperimentelle time management og analyse overførselshastighed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>405 LS Washer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GripTips for VIAFLO 96</td>
			<td>Integra</td>
			<td>6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160; 17705021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High-Content Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH12000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tube dispensing cassette</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td>
			<td>Integra</td>
			<td>6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496&#160;EMD MILLIPORE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-fetoprotein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3980</td>
			<td>1:500 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP2D6</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF-4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td>1:400 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76055</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11015</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

Humane pluripotente stamceller udgør en vedvarende kilde til humant væv. Vores forskning er fokuseret på at skabe menneskelige levervæv fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (iPSCs). Nuværende differentiering procedurer generere menneskelige hepatocyt-lignende celler (HLCs) viser en blanding af føtale og voksne træk. For at forbedre celle fænotype, har vi fuldt ud defineret vores procedure for differentiering og celle niche, resulterer i generation af cellepopulationer, der viser forbedrede Gen-ekspression og funktion. Mens disse undersøgelser mærke fremskridt, har evnen til at generere store mængder af multi godt plader til screening været begrænset af arbejdskraft intensive procedurer og batch til batch variationer. For at tackle dette problem, har vi udviklet en semi-automatiske platform for at differentiere pluripotente stamceller i HLCs. Stem cell såning og differentiering blev udført ved hjælp af flydende håndtering og automatiske pipettering systemer i 96-brønd plade format. Efter differentieringen, celle fænotype blev analyseret ved hjælp af automatiserede mikroskopi og en multi godt luminometrisk.

Celledifferentiering blev udført ved hjælp af en embryonale stamcelle linje (H9). Den semi-automatiske platform blev brugt til at skelne og karakterisere cellerne (figur 1A). En automatisk flydende håndtering dispenser blev brugt til at coat matrix og frø enkelt celler. Celledifferentiering blev indledt når cellerne nået 40% confluency (dag 0). Media ændringer blev udført ved hjælp af en automatisk håndholdte elektroniske kanal pipette system til at fjerne medium og flydende håndtering dispenser til mellemstor supplement (figur 1A). Celle fiksering og farvning blev udført ved hjælp af den automatiske flydende håndtering dispenser i kombination med den automatiske plade skive. Billedbehandling og kvantificering blev udført ved hjælp af en high-indhold billedbehandlingssystem og Columbus software. Cytokrom P450 aktivitet blev målt ved hjælp af en etableret assay. Efter substrat inkubation, celle analysere blev høstet og bioluminescens registreres ved hjælp af en multimode mikrotiterplade læser (figur 1A). Derudover blev konventionelle fase kontrast mikroskopi brugt til at måle ændringer i celle morfologi under hepatocyt differentiering (figur 1B).
På dag 18, blev variation i celle nummer mellem wells undersøgt efter DAPI farvning (figur 2A). Syv områder i lyset blev fanget pr. brønd og antallet af kerner kvantificeret (figur 2A). Vi fandt ingen statistiske forskelle mellem brønde med et gennemsnit på 41,662 ±3, 366 celler pr. brønd (figur 2B).
På dag 18, blev HLCs fast og farvet for typiske hepatocyt markører (fig. 3A-G) og testet for CYP P450 aktivitet. HLCs udtrykt hepatocyt markører som HNF4α (89.2% ±2 positive celler), ALB (92,8% ±6 positive celler), AFP (61,8% ±2 positive celler). HLCs også udtrykt CYP P450 proteiner, CYP2D6 og CYP3A4 og vises en særskilt polygonalt udseende, som det fremgår af E-Cadherin protein udtryk. HLCs CYP P450 aktivitet blev målt på dag 18. HLCs udstillet CYP1A2 aktivitet på 295,906 ±45, 828 RLU/mL/mg protein og CYP3A på 1,066,112 ±177, 416 RLU/mL/mg protein (figur 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Figur 1: hepatocyt differentiering fra PSC'er i 96 nå format. (A). Diagram over det udstyr, der anvendes til semi-automatisere Celledifferentiering, fiksering, farvning, imaging og funktionel aktivitet. (B). repræsentant ændringer i cellulære morfologi under HLC differentiering. Kort, kvikskrankerne er primet mod endelige endoderm, efterfulgt af hepatoblast specifikation karakteriseret af celler viser brostensbelagte-lignende morfologi og før hepatocyt modning med celler erhverve polygonal form. Skalalinjen = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Figur 2: vurdering af HLCs godt at nå variabilitet. (A) repræsentation af en 96 godt plade visning af HLCs plettet med DAPI. Skalalinjen = 1 mm. (B) kvantificering af celle nummer pr. brønd. Gennemsnit af celle nummer pr. brønde i kolonner (øverst) og rækker (nederst), fra syv områder af visninger pr. godt og kvantificeret ved hjælp af Columbus software. Gennemsnitlig celle nummer på tværs af pladen er 41,662 ± 3,366 SEM celler pr. brønd. Ingen statistisk signifikante forskelle blev observeret mellem brønde. En One-way ANAVA med Tukey's post-hoc statistiske test var ansat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Figur 3: hepatocyt markør udtryk og CYP P450 aktivitet måling i HLCs på dag 18. (A) procentdelen af hepatocyt nukleare faktor 4 alfa (HNF4α) udtryk ± SEM er baseret på tredive brønde med 10 felter til visning pr. brønd. (B) procentdelen af albumin (ALB) udtryk +/-SEM, er baseret på 3 separate brønde med 10 felter til visning pr. brønd. (C) procentdelen af alfa fetoprotein (AFP) +/-SEM er baseret på 3 separate brønde med 10 felter til visning pr. brønd. (D) E-cadherin farvning. (E) CYP2D6 farvning. (F) CYP3A4 farvning. (G). Immunoglobulin G (IgG) farvning kontrol. Skalalinjen = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 og 3A metaboliske aktivitet i HLCs på dag 18. Data repræsenterer seks biologiske replikater +/-SEM. aktivitet er citeret for relativ lys enheder (RLUs) /mL pr. 1 mg protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Denne protokol beskriver en semi-automatiserede tilgang til at producere hepatocyt-lignende celler fra humane pluripotente stamceller i en 96 godt plade format. Denne proces er hurtig og omkostningseffektiv, tillader produktion af forsikrede partier af hepatocyt-lignende celler for grundlæggende og anvendt menneskelige forskning.

Semi-automatiseret produktion af hepatocyt som celler fra pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generation af induceret-pluripotente stamceller Brug fibroblastlignende synoviocytter Isoleret fra leddene på leddegigt patienter

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Ved hjælp af menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt hepatocyt-lignende celler for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation af første hjertet felt-lignende hjerte ophav og ventrikel-lignende Cardiomyocytes fra humane pluripotente stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af menneskelige primordiale kønsceller-lignende celler på overfladen af Embryoid organer fra primet pluripotency induceret pluripotente stamceller

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...