Name: semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med priser fra den vitenskapsmann Office (TCS/16/37) og en MRC PhD stipend.

1. seeding menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i 96 godt plater For Hepatocyte differensiering
Merk: Reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1. Medier brukt til dette eksperimentet må være sterile og ved romtemperatur for cellekultur. Alt reagens/løsning volumer beskrives i denne delen av protokollen er basert på en enkelt brønn av en 96-brønns plate med mindre annet er angitt.
<ol><li>
Forberede laminin belagt 96 bra plater.
	<ol>
<li>Tine ampuller av rekombinant laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) for 2t overnight på 4 ° C.</li>
		<li>Forbered en 5 µg/mL løsning ved å fortynne LN-521 i iskalde 1 x Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) (med Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>Bruk en automatisk væske håndtering dispenser med en standard rør dispensing kassett til 50 µL av LN-521 løsningen per brønn av en 96 godt plate. Merk: Alle volum dispenses utføres med en flytende håndteringen automatisk dispenser med en standard rør dispensing kassett med mindre annet er angitt. Førsteklasses løsningen til den når dispensering slutten av kassetten, så fortsette å dispensere. Flere 96 bra plater kan tilberedes i samme eksperimentet ved å gjenta prosedyren så mange ganger som nødvendig.</li>
		<li>Inkuber LN521-belagt plater på 37 °C/5% CO2 for 2 til 4 h. Merk: LN521-belagte plater kan lagres til to uker 4 ° C. Holde platene forseglet på flatt underlag å unngå fordampning og forurensning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Varm opp antall pre belagt plater på 37 ° C i 30 minutter til 1 time.</li>
	<li>Sug opp den gjenværende LN-521 løsningen av belagt overflaten med en 8-kanals aspirasjon adapter. Merk: Det er viktig å unngå kontakt med belagt overflaten å unngå belegg degradering.</li>
	<li>Straks legge til 50 µL per brønn av mTeSR1 medium med 10 µM Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer Y27632 og holde platen i inkubator til celle seeding 37 °C/5% CO2. Merk: Ikke la laminin-belagt brønnene tørke.</li>
	<li>
Forberede en celle suspensjon av 3 x 105 celler/mL i mTeSR1 medium med 10 µM ROCK hemmer Y27632. Merk: Seeding tettheten for hver celle linje krever optimalisering.<ol>
<li>Sug opp mediet fra en Petriskål med en udifferensierte kultur av hPSCs på ca 75 til 85% confluency kultivert på LN-521 som tidligere beskrevet12. Merk: hPSCs er kultivert på LN-521 i mTSER1 med mediet endret hver 24 h, og passaged regelmessig når cellene når 80% av confluency som tidligere beskrevet12.</li>
		<li>Vask cellene med 5 mL av romtemperatur 1 x DPBS (uten Ca2 +/Mg2 +) og leveringstanken bufferen.</li>
		<li>Legg til 5 mL 1 x mild celle dissosiasjon reagens til cellene og ruge på 37 ° C i 6 til 8 minutter for cellen dissosiasjon. Merk: For å stoppe reaksjonen, undersøke brøkdel av cellene fra matrisen under mikroskopet. Cellene skal delvis løsrevet fra platen. Hvis ikke, utvide inkubasjonstiden for en ekstra 1-2 minutter.</li>
		<li>Avslutte reaksjonen av aspirating milde celle dissosiasjon reagensen og legge 5 mL av fersk mTeSR1 medium med 10 µM ROCK hemmer Y27632 til cellene. Bruk cellen skraper for å løfte cellene fra matrise og pipette opp og ned bruker et P1000 tips flere ganger å blande.</li>
		<li>Telle levedyktig celler ved hjelp av et hemocytometer basert på Trypan blå flekker utelukkelse metoden og forberede celle suspensjon med nødvendige konsentrasjoner.</li>
		<li>Pipetter ønsket antall celler i et sterilt 15 mL eller 50 mL sentrifuge rør og Nedspinning cellene av sentrifugering dem på 115 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Merk: For en 96 godt plate, 5 mL av mTeSR1 medium som inneholder 3 x 105 celler/mL er nødvendig for H9 cellen linje.</li>
		<li>Sug opp nedbryting og forsiktig resuspend celle pellets til en homogen løsning oppnås ved 37 ° C i mTeSR1 medium med 10 µM ROCK hemmer Y27632. Merk: Bruk av ROCK hemmer anbefales som det forbedrer celle overlevelse innlegg re plating.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legge til 50 µL av cellen suspensjon på 96 godt platen inneholder 50 µL av mTeSR1 med 10 µM ROCK hemmer Y27632.</li>
	<li>Etter seeding, tilbake platene til celle inkubator på 37 °C/5% CO2 24 h til at cellene å feste.</li>
	<li>Undersøk cellene neste dag og trekke ROCK hemmer når celle til celle kontakten er opprettet. På 40% confluency, kan du bytte til differensiering medium (figur 1B). Merk: Hvis cellen confluency er høyere enn 40%, platene er ikke egnet for HLC differensiering med H9 cellen linje.</li>
</ol>2. skille hPSCs til Hepatocyte som celler i rekombinant Laminins i 96 godt plater
<ol><li>
Forberede differensiering medium og vekst faktorer.
	<ol>
<li>Klargjør menneskelige Activin A lagerløsning (100 µg/mL) ved oppløsning menneskelige Activin A pulver i sterilt 0,2% bovin serum albumin (BSA) i PBS. Aliquot lager og butikk på 20 ° C. Bruk på 1:1, 000.</li>
		<li>Klargjør musen Wnt3a lagerløsning (10 µg/mL) ved oppløsning mus Wnt3a pulver i sterilt 0,2% BSA. Aliquot lager og butikk på 20 ° C. Bruk på 1:200.</li>
		<li>Klargjør menneskelige hepatocyte vekst faktor (HGF) lagerløsning (10 µg/mL) ved oppløsning menneskelige HGF pulver i sterilt 0,2% BSA. Aliquot lager og butikk på 20 ° C. Bruk på 1:1000.</li>
		<li>Forberede Oncostatin M (OSM) lagerløsning (20 µg/mL) ved å løse opp pulveret i sterilt 0,2% BSA. Aliquot lager og butikk på 20 ° C. Bruk på 1:1, 000.</li>
		<li>Definitive endoderm: forberede endoderm differensiering medium, bestående av 2% B27 supplement (50 x, uten insulin), 1% penicillin/streptomycin (siste konsentrasjoner: 100 IU/mL og 100 µg/mL, henholdsvis) lagt til Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) basale medium. Lagre på 4 ° C og bruk innen to uker. Ved hvert medium, supplere et bestemt volum med Activin A og Wnt3a på siste konsentrasjon av 100 ng/mL og 50 ng/mL, henholdsvis.</li>
		<li>Hepatoblast differensiering: forberede hepatoblast differensiering medium, bestående av 20% knockout serum erstatning (KSR), 0,5% et alternativ supplement til L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, 1% DMSO og 1% penicillin/streptomycin (siste konsentrasjoner på 100 IU/mL og 100 µg/mL, henholdsvis) lagt til knockout DMEM (KO-DMEM). Filtrere under vakuum og lagre på 4 ° C. Bruk innen to uker.</li>
		<li>Hepatocyte differensiering: forberede hepatocyte differensiering medium, bestående av 1% et alternativ supplement til L-glutamin, 10 µM hydrocortisone 21-hemisuccinate natrium salt (HCC), 1% penicillin/streptomycin (siste konsentrasjoner på 100 IU/mL og 100 µg/mL, henholdsvis) lagt til HepatoZYME medium. Lagre aksjen på 4 ° C og bruk innen to uker. For hver middels, supplere et bestemt volum med HGF og OSM (siste konsentrasjoner på 10 ng/mL og 20 ng/mL, henholdsvis).</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 h innlegget seeding, nøye fjerne mediet bruker et automatisk håndholdt elektronisk kanal pipette system og legge 100 µL av fersk endoderm disposisjon medium supplert med 100 ng/mL Activin A og 50 ng/mL Wnt3a. Merk: Differensiering prosessen starter når den definitive endoderm mediet er lagt. Når cellen seeding optimalisert, startes normalt den cellulære differensieringen innen 24 timer. Alle medium endringer utføres ved å fjerne mediet med automatisk håndholdt elektronisk kanal pipette system og dispensing 100 µL av fersk medium med en flytende håndteringen automatisk dispenser med en standard rør dispensering kassett med mindre annet angitt. En automatisk håndholdt elektronisk kanal pipette system ble brukt med en 96 godt hode, bruke 300 µL tips. I korthet, 90 µL var pustende fra den vel unngå kontakt med celler, og det er viktig å ikke tørr cellene under medium endring til redusere celle stress.</li>
	<li>For menneskelige embryonale stamceller (hESCs), endre endoderm differensiering mediet daglig i tre dager. Hvis differensiering utføres for menneskelig indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), kan du utvide definitive endoderm scenen for 2 ekstra dager med Activin A bare.</li>
	<li>Etter endelig endoderm induksjon, bytte til KSR/DMSO medium for hepatoblast-spesifikasjonen, og endre mediet hver 2 dager i 5 dager. Merk: Hvis det er en rekke ikke-tilknyttede celler i brønnen, bruke ikke-supplert KO-DMEM for å vaske cellene en gang før neste medium endring. På grunn av varigheten av den andre fasen av protokollen (5 dager), vil det være 3 middels endringene med den siste på den siste dagen av hepatoblast-spesifikasjonen.</li>
	<li>Etter hepatoblast differensiering, skru av å HepatoZYME mediet for hepatocyte modning. Vask cellene gang med HepatoZYME uten supplement etter fjerner KSR/DMSO middels og legge 100 µL HepatoZYME modning middels supplert med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>Endre mediet hver 48t for 7-10 dager. På dag 18 av differensiering, karakterisere HLCs ved å analysere genuttrykk og CYP P450 metabolsk aktivitet.</li>
</ol>3. karakterisering av Hepatocyte-lignende celler differensiert på rekombinant Laminins
<ol><li>Oppdage uttrykk for hepatocyte-spesifikke indikatorer og polarisering markører bruker immunostaining.</li>
	<li>Test hepatocyte metabolsk funksjon med CYP P450 analyser som beskrevet før12.</li>
	<li>Bestemme plate variasjon, teller antall celler per brønn per plate.</li>
</ol>4. høy gjennomstrømning Immunocytochemistry og bilde
<ol><li>På dag 18 av differensiering, vaske brønnene tre ganger med 1 x DPBS, fikse HLCs ved dispensering 50 µL av 4% paraformaldehyde (PFA) og ruge ved romtemperatur i 15-30 min. Fiksering, vaskes tre ganger med PBST (0,1% mellom) (uten Ca2 +/Mg2 +) bruker en automatisk plate skive. Merk: Alle vasker i denne delen utføres ved hjelp av en automatisk plate skive med mindre annet er angitt. Alle vasker gjøres etter samme protokoll.</li>
	<li>Permeabilize membran av dispensering 100 µL av PBST (uten Ca2 +/Mg2 +) og ruge for 20 min ved romtemperatur. Deretter utføre protein blokkering av dispensering 100 µL av 10% BSA i PBST og ruge 1t i mild risting bruker en plate shaker. Etter protein blokkering, legge til 50 µL av 1% BSA i PBST som inneholder primære antistoffer, ruge på 4 ° C over natten med mild skjelvende bruker en plate shaker. Merk: Ikke vask mellom protein blokk og antistoff tillegg.</li>
	<li>Etter 24 timer, vask tre ganger med 1 x DPBS (uten Ca2 +/Mg2 +) og legge det sekundære antistoffet ved dispensering 50 µL av 1% BSA i PBST. Inkuber 1t ved romtemperatur i mørket.</li>
	<li>Sekundær antistoff-inkubasjon vaskes 3 ganger med 1 x DPBS. Legge til 50 µL av DPBS med DAPI (10 µg/mL) og Inkuber for 5-10 minutter ved romtemperatur i mørket.</li>
	<li>Til slutt, vask 3 ganger med DPBS og la 100 µL av 1 x DPBS i brønnen. Platene er klart til avbilding. Merk: Plater bør lagres på 4 ° C i mørket til bildebehandling.</li>
	<li>Bildet platen ved hjelp av et høyt innhold tenkelig system, og få flere felt over godt å få en god representasjon av brønnen. Kvantifisere uttrykk for de forskjellige merkene i HLCs ved hjelp av Columbus programvare (høyt innhold Imaging analyse systemprogramvare). Merk: Columbus er en høy innhold analyseprogramvare, som gir cellen segmentering analyse for celle phenotyping. Lignende resultater kan oppnås ved hjelp av CellProfiler, en åpen kildekode-programvare for kvantitativ analyse av biologiske bilder22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Choudhury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+model+pazopanib-mediated+hepatotoxicity.">Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity.</a> Sci Rep. 7, 41238 (2017).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+interindividual+differences+in+hepatic+functions+and+drug+sensitivity+by+using+human+iPS-derived+hepatocytes.">Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+of+hESC/hiPSC-derived+hepatocyte-like+cells+for+drug+toxicity+testing.">3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing.</a> Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Iii, R. L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+by+3D-Culture.">Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture.</a> PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).</li><li>Chen, Y. -. F., Tseng, C. -. Y., Wang, H. -. W., Kuo, H. -. C., Yang, V. W., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+mature+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+an+efficient+three-step+protocol.">Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol.</a> Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Self-Renewal+of+Human+ES/iPS-Derived+Hepatoblast-like+Cells+on+Human+Laminin+111-Coated+Dishes.">Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes.</a> Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. , 86-100 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assay+Multiplexing+for+Toxicity+Screening+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+and+Hepatocytes.">High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes.</a> Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+images+and+morphological+profiles+of+30,000+small-molecule+treatments+using+the+Cell+Painting+assay.">A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay.</a> GigaScience. , (2017).</li><li>Pradip, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Content+Analysis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+Reveals+Drug+Induced+Steatosis+and+Phospholipidosis.">High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis.</a> Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).</li><li>Donato, M. T., G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Tolosa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high-content+screening+technology+for+studying+drug-induced+hepatotoxicity+in+preclinical+studies.">Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

Professor David C. Hay er en medgrunnlegger av Stemnovate Limited.
Professor David C. Hay er leder for HigherSteaks begrenset.

Våre halvautomatisk prosedyren er effektiv, pålitelig og økonomisk, slik at produksjonen av HLCs på skalaen (figur 1). Det var ikke noen signifikant forskjell i antall celler mellom brønnene på plate, gjør denne plattformen en passende tilnærming til cellen-basert screening (figur 2). I tillegg gjør semi automatisering arbeidsflyten det mulig å produsere store antall plater samtidig, som ikke var mulig før du bruker manuelle prosesser5,12.
Viktigere, automatiseringen prosessen bydde ikke innvirkningen på differensiering avkastning, med fleste celler uttrykke HNF4α (89,2% ± 2) og ALB (92.8% ±6) (Figur 3). HLCs også uttrykt CYP P450 enzymer CYP2D6 og CYP3A4 og vises CYP1A2 og CYP3A metabolsk aktivitet sammenlignes med tidligere rapporterte eksperimenter (Figur 3)5. Til tross for standardisering av protokollen er celle confluency før differensieringen avgjørende for ren HLC differensiering. Derfor en god celle distribusjon over brønnen er en viktig faktor (figur 1). Dette har vist seg for å være cellen linje avhengig, derfor celle såing og tetthet optimalisering kreves for hver celle linje før å skalere opp.
I sin nåværende form, denne plattformen passer ikke å produsere store mengder HLCs for klinisk bruk, og dette vil sannsynligvis oppnås gjennom bruk av cellen fabrikker og bioreactors. Imidlertid tillater metodikk utviklet rask generering av menneskelig leverceller for sykdom modellering, narkotikarelaterte screening og/eller narkotika gjenbruk studier. Videre er analysen mottakelig for multiplexing, tillater generering av multiparametric datasett for mekanistisk analyse. Fremover, tror vi også at denne teknologien kan brukes til mer komplekse i vitro systemer som 3D differensiering eller som en plattform for å forbedre HLC fenotypen i vitro.
Avslutningsvis tror vi at vårt enkle og semi-automatisert system vil øke eksperimentelle gjennomstrømning, og redusere eksperimentelle variasjon, og dermed forbedre kvaliteten på biologiske datasett og deres ekstrapolering mot menneskelige fysiologi.

Primære menneskelige hepatocytter (PHHs) representerer den gjeldende standarden for leveren biomedisinsk forskning. Til tross for sine fordeler er PHHs en begrenset kilde modne hepatocytes med ustabil fenotypen1. Menneskelige embryonale stamceller (ESCs) og menneskelige indusert pluripotent stamceller (iPSC) har blitt foreslått som en sterk ressurs for biomedisinsk forskning, lovende en fornybar menneskelig vev, inkludert leveren2,3,4 . Gjeldende hepatocyte differensiering prosedyrer generere celler som uttrykker hepatocyte markører og gener funksjoner som ligner på PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Flere nylig, bruk av definerte materialer og matriser som rekombinant laminins, har forbedret celle fenotypen og eksperimentelle reproduserbarhet5,12,13,14.
Tradisjonelle celle kultur teknikker stole tungt på manuell pipettering, som er både tidkrevende og feil. Dette begrenser gjennomstrømningen av analysen og plate formatet ettall kanne operere med. Hittil er de fleste studier som beskriver generering av HLCs arbeidsintensiv i naturen og derfor liten skala i størrelse15,16,17.
Gjeldende fremskritt innen flytende håndtering og pipettering systemer, i kombinasjon med automatisert mikroskopi og laboratoriet Analysatorer, har gjort det mulig å utvikle prosedyrer som minimerer behovet for menneskelig inngripen. Vi har tatt nytte av disse teknologiene og utviklet et semi-automatisert differensiering å generere store mengder av menneskelig leveren vev Basic og brukt biomedisinsk forskning. Denne tilnærmingen kan utføres med både menneskelige ESC og iPSC linjer med mindre justeringer nødvendig, avhengig av den cellen linjen. Kombinerer dette systemet med høy innhold analyse, viser vi at HLC phenotyping kan være mindre tidkrevende og utført på skala18,19,20,21.
I sammendraget, har automatisering av celle kultur teknikker beskrevet her ført til forbedringer i pålitelighet, eksperimentelle tidsstyring og analysen gjennomstrømming.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>405 LS Washer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GripTips for VIAFLO 96</td>
			<td>Integra</td>
			<td>6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160; 17705021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High-Content Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH12000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tube dispensing cassette</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td>
			<td>Integra</td>
			<td>6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496&#160;EMD MILLIPORE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-fetoprotein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3980</td>
			<td>1:500 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP2D6</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF-4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td>1:400 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76055</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11015</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

Menneskelige pluripotent stamceller representerer en fornybar menneskelig vev. Vår forskning er fokusert på å generere menneskelige leveren vev fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og indusert pluripotent stamceller (iPSCs). Gjeldende differensiering prosedyrer generere menneskelige hepatocyte-lignende celler (HLCs) viser en blanding av fetal og voksen egenskaper. For å forbedre celle fenotype, har vi fullt definert vår differensiering prosedyre og celle nisje, som resulterer i generasjonen av celle populasjoner som viser forbedret genuttrykk og funksjon. Mens disse studiene merke fremgang, har muligheten til å generere store mengder multi bra plater for screening vært begrenset av arbeidskraft intensiv prosedyrer og parti til parti variasjon. For å takle dette problemet, har vi utviklet en halvautomatisk plattform for å skille pluripotent stamceller i HLCs. stilk cellen såing og differensiering ble utført med flytende håndtering og automatiske pipettering systemer i 96-brønnen plate format. Etter differensiering, celle fenotypen ble analysert ved hjelp av automatiserte mikroskopi og en multi godt luminometer.

Celledifferensiering det ble utført en embryonale stamcelleforskningen linje (H9). Halvautomatisk plattformen ble brukt til å skille og karakterisere cellene (figur 1A). En automatisk flytende håndtering dispenser ble brukt til pels matrix, og seedet enkeltceller. Differensiering ble igangsatt når cellene nådd 40% confluency (dag 0). Media endringene som ble utført med en automatisk håndholdt elektronisk kanal pipette system fjerne medium og flytende håndtering dispenser for middels tillegg (figur 1A). Cellen fiksering og flekker som ble utført med håndteringen automatisk flytende dispenser i kombinasjon med automatisk plate skive. Bildebehandling og kvantifisering ble utført ved hjelp av et høyt innhold tenkelig system og Columbus programvare. Cytochrome P450 aktivitet ble målt ved hjelp av en etablert analysen. Etter substrat inkubasjon celle supernatants ble høstet, og bioluminesens registrert bruker en multimode microplate reader (figur 1A). I tillegg ble konvensjonelle fase kontrast mikroskopi brukt til å måle endringer i celle morfologi under hepatocyte differensiering (figur 1B).
På dag 18, ble variasjon i celle tall mellom brønner undersøkt etter DAPI flekker (figur 2A). Syv synsfelt ble tatt per godt og antall kjerner kvantifisert (figur 2A). Vi fant ingen statistisk forskjeller mellom brønner med et gjennomsnitt på 41,662 ±3, 366 celler per brønn (figur 2B).
På dag 18, var HLCs fast og farget for typiske hepatocyte markører (Figur 3AG) og testet for CYP P450 aktivitet. HLCs uttrykt hepatocyte markører som HNF4α (89,2% ± 2 positiv celler), ALB (92.8% ±6 positive celler), AFP (61,8% ± 2 positiv celler). HLCs også uttrykt CYP P450 proteiner, CYP2D6 og CYP3A4 og vises forskjellig mangekantet utseende som vist av E-Cadherin protein uttrykk. HLCs CYP P450 aktivitet ble målt på dag 18. HLCs viste CYP1A2 aktivitet på 295,906 ±45, 828 RLU/mL/mg av protein og CYP3A på 1,066,112 ±177, 416 RLU/mL/mg protein (Figur 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Figur 1: Hepatocyte differensiering fra PSCer i 96 også formatere. (A). Diagram av utstyret som brukes til semi automatisere differensiering, fiksering, flekker, imaging og funksjonelle aktiviteten. (B). representant endringer i mobilnettet morfologi under HLC differensiering. Kort, PSCer er primet mot definitive endoderm, etterfulgt av hepatoblast spesifikasjonen preget av celler vise brosteinsbelagte-lignende morfologi og før hepatocyte modning med celler anskaffe mangekantet figur. Skala bar = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Figur 2: vurdering av HLCs godt-å-godt variasjon. (A) representasjon av en 96 plate også visning av HLCs med DAPI. Skala bar = 1 mm. (B) kvantifisering av celle nummer per brønn. Gjennomsnittet av celle nummer per brønner i spalter (øverst) og rader (nederst), fra sju felt av visninger per godt og kvantifisert Columbus programmvre. Gjennomsnittlig celle nummer over platen er 41,662 ± 3,366 SEM celler per brønn. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert mellom brønner. En enveis VARIANSANALYSE med Tukey's post-hoc statistiske tester var ansatt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Figur 3: Hepatocyte markør uttrykk og CYP P450 Aktivitetemåling i HLCs på dag 18. (A) andelen hepatocyte kjernefysiske faktor 4 alpha (HNF4α) uttrykk ± SEM er basert på tretti brønner med ti synsfelt per brønn. (B) andelen albumin (ALB) uttrykk +/-SEM, er basert på 3 separate brønner med ti synsfelt per brønn. (C) prosentandelen av Alfa fetoprotein (AFP) +/-SEM er basert på 3 separate brønner med ti synsfelt per brønn. (D) E-cadherin flekker. (E) CYP2D6 flekker. (F) CYP3A4 flekker. (G). immunglobulin G (IgG) flekker kontroll. Skala bar = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 og 3A metabolsk aktivitet i HLCs på dag 18. Dataene representerer seks biologiske replikerer +/-SEM. aktivitet er sitert som relative lette enheter (RLUs) /mL per 1 mg protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Denne protokollen beskriver en semi-automatisert tilnærming for å produsere hepatocyte-lignende celler fra menneskelige pluripotent stamceller i 96 godt plate format. Denne prosessen er rask og kostnadseffektiv, slik at produksjonen av kvalitet forsikret grupper av hepatocyte-lignende celler for grunnleggende anvendt menneskelige forskning.

Semi-automatisert produksjon av Hepatocyte som celler fra Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generering av indusert-pluripotente stamceller ved hjelp av fibroblast synoviocytter Isolert fra ledd av pasienter med revmatoid artritt

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Bruker Human indusert Pluripotent Stamcelle-avledet Hepatocyte-lignende celler for medisiner

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generasjon første hjertet felt-lignende Cardiac Progenitors og ventrikkel som Cardiomyocytes fra menneskelige Pluripotent stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av menneskelige Primordial bakterie celle-lignende celler på overflaten av Embryoid organer fra primet pluripotency indusert Pluripotent stamceller

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...