Name: semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Detta arbete stöds med utmärkelser från the Chief Scientist's Office (TCS/16/37) och en MRC PhD stipendium.

1. sådd mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) till 96 väl plattor för Hepatocyte differentiering
Obs: Reagenser och utrustning som används i detta protokoll har förtecknats i tabell 1. Media som används för detta experiment måste vara steril och i rumstemperatur i cellkultur. Alla reagenslösningen/volymer beskrivs i denna del av protokollet är baserat på en enda brunn av en plattan med 96 brunnar såvida inte annat anges.
<ol><li>
Förbereda laminin belagda plattor med 96.
	<ol>
<li>Tina en injektionsflaska rekombinant laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) för 2 h till övernattning vid 4 ° C.</li>
		<li>Bered en 5 µg/mL genom att späda ut LN-521 iskall 1 x Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) (med Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>Använda en automatisk dispenser för vätskehantering med ett standardrör dispensering kassett för att tillsätt 50 µL LN-521 lösning per brunn 96 väl platta. Obs: Alla volym doserar utförs med en automatisk vätskehantering dispenser med ett standardrör dispensering kassett om inget annat anges. Prime lösningen tills den når tubens slutet av kassetten och sedan fortsätta att avstå från. Flera plattor med 96 kan tillagas i samma experiment genom att upprepa proceduren så många gånger som behövs.</li>
		<li>Inkubera LN521-belagda plattorna vid 37 °C/5% CO2 för 2 till 4 h. Obs: LN521-belagda plattor kan lagras till två veckor vid 4 ° C. Hålla plattorna förseglas på en plan yta för att undvika avdunstning och kontaminering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Värma upp det nödvändiga antalet pre plattorna vid 37 ° C i 30 min till 1 h.</li>
	<li>Aspirera återstående LN-521 lösningen av den belagda ytan använder en 8-kanals aspiration adapter. Obs: Det är viktigt att undvika kontakt med den belagda ytan att undvika beläggning nedbrytning.</li>
	<li>Omedelbart Tillsätt 50 µL per brunn mTeSR1 medium kompletteras med 10 µM Rho-associerade (ROCK) tyrosinkinashämmare Y27632 och hålla plattan i inkubatorn till cell sådd på 37 °C/5% CO2. Obs: Låt inte laminin-belagd brunnarna torka.</li>
	<li>
Förbered en cellsuspension på 3 x 105 celler/mL i mTeSR1 medium kompletteras med 10 µM ROCK hämmare Y27632. Obs: Sådd densiteten för varje cellinje kräver optimering.<ol>
<li>Aspirera mediet från en petriskål med en odifferentierad kultur av hPSCs på ca 75% till 85% konfluens odlade på LN-521 som tidigare beskrivits12. Obs: hPSCs är odlade på LN-521 i mTSER1 med mediet ändras varje 24 h och anpassade regelbundet när cellerna når 80% av konfluens som tidigare beskrivits12.</li>
		<li>Tvätta cellerna med 5 mL av rumstemperatur 1 x DPBS (utan Ca2 +/Mg2 +) och aspirera bufferten.</li>
		<li>Tillsätt 5 mL av 1 x skonsam Cell Dissociation reagens till cellerna och inkubera vid 37 ° C för 6 till 8 min för cell dissociation. Obs: För att stoppa reaktionen, undersöka avskildheten av cellerna från matrisen under mikroskopet. Cellerna bör delvis lossnat från plattan. Om så inte är fallet, förlänga inkubationstiden för en extra 1 till 2 min.</li>
		<li>Avsluta reaktionen genom att aspirera skonsam Cell Dissociation reagens och tillsätt 5 mL av färska mTeSR1 medium kompletteras med 10 µM ROCK-hämmare Y27632 till cellerna. Använd en cell skrapa för att lyfta cellerna från matrisen och pipett upp och ner med ett P1000 tips flera gånger att blanda.</li>
		<li>Räkna de viabla celler som använder en hemocytometer baserad på Trypan blå färgning utslagning metod och förbereda cellsuspension med nödvändiga koncentrationer.</li>
		<li>Pipettera önskat antal celler i ett sterilt 15 mL eller 50 mL centrifugrör och snurra cellerna ner genom centrifugering dem på 115 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Obs: För en 96 väl plåt, mTeSR1 medium innehållande 3 x 105 celler/mL 5 mL krävs för raden H9 cell.</li>
		<li>Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten försiktigt tills en homogen lösning erhålls vid 37 ° C i mTeSR1 medium kompletteras med 10 µM ROCK hämmare Y27632. Obs: Användningen av ROCK-hämmare rekommenderas eftersom det förbättrar cell överlevnad post åter plätering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tillsätt 50 µL cellsuspension på 96 väl plattan som innehåller 50 µL av mTeSR1 med 10 µM ROCK hämmare Y27632.</li>
	<li>Efter sådd, tillbaka plåtarna till cell inkubatorn på 37 °C/5% CO2 för 24 h så att cellerna att bifoga.</li>
	<li>Undersök cellerna nästa dag och dra tillbaka ROCK-hämmare när den cell till cell kontakten har upprättats. 40% konfluens, Byt till differentiering medium (figur 1B). Obs: Om cellen konfluens är högre än 40%, plattorna är inte lämpliga för HLC differentiering med H9 cell linje.</li>
</ol>2. att differentiera hPSCs Hepatocyte-liknande celler i rekombinant lamininer i 96 väl plattor
<ol><li>
Förbereda differentieringen medium och tillväxt faktorer.
	<ol>
<li>Förbereda mänskliga Activin A stamlösning (100 µg/mL) genom upplösning mänskliga Activin A pulvret i sterila 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Alikvot beståndet och förvaras vid-20 ° C. Använd 1:1, 000.</li>
		<li>Förbereda mus Wnt3a stamlösning (10 µg/mL) genom upplösning mus Wnt3a pulvret i sterila 0,2% BSA. Alikvot beståndet och förvaras vid-20 ° C. Använd på 1: 200.</li>
		<li>Förbereda mänskliga hepatocyte tillväxtfaktor (HGF) stamlösning (10 µg/mL) genom upplösning mänskliga HGF pulvret i sterila 0,2% BSA. Alikvot beståndet och förvaras vid-20 ° C. Använd 1: 1000.</li>
		<li>Förbered Oncostatin M (OSM) stamlösning (20 µg/mL) genom upplösning av pulvret i sterila 0,2% BSA. Alikvot beståndet och förvaras vid-20 ° C. Använd 1:1, 000.</li>
		<li>Slutgiltiga endoderm: förbereda endoderm differentiering medium, bestående av 2% B27 supplement (50 x, utan insulin), 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer: 100 IE/mL och 100 µg/mL, respektive) tillsätts () Roswell Park Memorial Institute 1640 RPMI 1640) basala medium. Förvaras vid 4 ° C och Använd inom två veckor. På varje medium förändring, komplettera volymen som krävs med Activin A och Wnt3a med slutlig koncentration på 100 ng/mL och 50 ng/mL, respektive.</li>
		<li>Hepatoblast differentiering: förbereda hepatoblast differentiering medium, bestående av 20% knockout serum ersätter (KSR), 0,5% ett alternativ tillägg till L-glutamin, 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 0,1 mM beta-merkaptoetanol, 1% DMSO och 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer på 100 IE/mL och 100 µg/mL, respektive) till knockout DMEM (KO-DMEM). Filtrera under vakuum och förvaras vid 4 ° C. Använd inom två veckor.</li>
		<li>Hepatocyte differentiering: förbereda hepatocyte differentiering medium, bestående av 1% ett alternativ tillägg till L-glutamin, 10 µM hydrokortison 21-hemisuccinate natriumsalt (HCC), 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer vid 100 IE/mL och 100 µg/mL, respektive) tillsätts HepatoZYME medium. Lagra beståndet vid 4 ° C och Använd inom två veckor. För varje medium förändring, komplettera volymen som krävs med HGF och OSM (slutliga koncentrationer på 10 ng/mL och 20 ng/mL, respektive).</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 h efter sådd, försiktigt bort mediet med hjälp av en automatisk handhållna elektroniska kanalsystem pipett och tillsätt 100 µL av färska endoderm-priming medium kompletteras med 100 ng/mL Activin A och 50 ng/mL Wnt3a. Obs: Differentiering processen inleds när det slutgiltiga endoderm mediet har lagts till. När cellen sådd är optimerad, initieras normalt cellulär differentiering inom 24 h. Alla medium ändringar utförs genom att ta bort medlet med en automatisk handhållna elektroniska kanalsystem pipett och fördela 100 µL av färskt medium med en automatisk vätskehantering dispenser med en standard tube tubens kassett om inte annat anges. En automatisk handhållen elektronisk kanal pipett system användes med en 96 väl huvudet, med hjälp av 300 µL tips. I korthet 90 µL var aspirerade från den väl undvika all kontakt med celler, och det är viktigt att inte torka cellerna under medellång förändring att minska cell stress.</li>
	<li>För mänskliga embryonala stamceller (hESCs), ändra endoderm differentiering medium dagligen i tre dagar. Om differentieringen utförs för mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), förlänga slutgiltiga endoderm scenen 2 extra dagar med Activin A bara.</li>
	<li>Växla till KSR/DMSO medium för hepatoblast specifikation efter slutgiltiga endoderm induktion, och ändra medium varannan dag i 5 dagar. Obs: Om det finns ett antal grupplösa celler i brunnen, använda icke-kompletteras KO-DMEM för att tvätta cellerna en gång innan nästa medium förändring. På grund av varaktigheten av den andra etappen av protokollet (5 dagar), kommer det att bli 3 medelstora förändringar med det sista på den sista dagen i specifikationen hepatoblast.</li>
	<li>Efter hepatoblast differentiering, växla till HepatoZYME medium för hepatocyte mognad. Tvätta cellerna en gång med HepatoZYME utan tillägget efter att avlägsna KSR/DMSO och tillsätt 100 µL av HepatoZYME mognad medium kompletteras med 10 ng/mL HGF och 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>Ändra på medellång varje 48 h för 7-10 dagar. Dag 18 av differentiering, karakterisera HLCs genom att analysera genuttryck och CYP P450 metabolisk aktivitet.</li>
</ol>3. karakterisering av Hepatocyte-liknande celler differentieras på rekombinant lamininer
<ol><li>Upptäcka uttrycket av hepatocyte-specifika markörer och polarisering markörer använder immunfärgning.</li>
	<li>Testa hepatocyte metabolisk funktion med CYP P450 analyser enligt beskrivningen innan12.</li>
	<li>Bestämma den platta variation, räknar det totala antalet celler per brunn per platta.</li>
</ol>4. hög genomströmning immuncytokemi och bild förvärv
<ol><li>Dag 18 differentiering, Tvätta brunnarna tre gånger med 1 x DPBS, fixa HLCs genom tubens 50 µL av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) och odla i rumstemperatur 15-30 min. Efter fixeringen, tvätta tre gånger med PBST (0,1% tween) (utan Ca2 +/Mg2 +) med en automatisk tallrik bricka. Obs: Alla tvättar i detta avsnitt utförs med en automatisk tallrik bricka om inte annat anges. Alla tvättar är klar efter samma protokoll.</li>
	<li>Permeabilize membranet av tubens 100 µL av PBST (utan Ca2 +/Mg2 +) och inkubera i 20 min i rumstemperatur. Nästa, utföra protein blockering av tubens 100 µL 10% BSA i PBST och inkubera i 1 h i milda skakningar skakapparat plattan. Efter protein blockering, tillsätt 50 µL av 1% BSA i PBST innehållande primära antikropparna, inkubera vid 4 ° C över natten med milda skakningar skakapparat plattan. Obs: Tvätta inte mellan protein block och antikropp tillägg.</li>
	<li>Efter 24 h, tvätta tre gånger med 1 x DPBS (utan Ca2 +/Mg2 +) och lägga till den sekundära antikroppen genom tubens 50 µL av 1% BSA i PBST. Inkubera i 1 h i rumstemperatur i mörkret.</li>
	<li>Efter den sekundära antikroppar inkubationen, tvätta 3 gånger med 1 x DPBS. Tillsätt 50 µL av DPBS med DAPI (10 µg/mL) och inkubera i 5 – 10 min i rumstemperatur i mörkret.</li>
	<li>Slutligen, tvätta 3 gånger med DPBS och lämna 100 µL av 1 x DPBS i brunnen. Plattorna är redo för avbildning. Obs: Plattor ska förvaras vid 4 ° C i mörker tills imaging.</li>
	<li>Bild på plattan med hjälp av en hög-innehåll imaging system, och förvärva flera fält över brunnen för att få en bra representation av brunnen. Kvantifiera uttrycket av olika markörer i HLCs med hjälp av Columbus programvara (hög-innehåll Imaging analys system software). Obs: Columbus är en hög innehållsanalys mjukvara, vilket ger cellen segmentering analys för cell fenotypning. Liknande resultat kan uppnås med hjälp av CellProfiler, en programvara med öppen källkod för kvantitativ analys av biologiska bilder22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Choudhury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+model+pazopanib-mediated+hepatotoxicity.">Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity.</a> Sci Rep. 7, 41238 (2017).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+interindividual+differences+in+hepatic+functions+and+drug+sensitivity+by+using+human+iPS-derived+hepatocytes.">Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+of+hESC/hiPSC-derived+hepatocyte-like+cells+for+drug+toxicity+testing.">3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing.</a> Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Iii, R. L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+by+3D-Culture.">Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture.</a> PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).</li><li>Chen, Y. -. F., Tseng, C. -. Y., Wang, H. -. W., Kuo, H. -. C., Yang, V. W., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+mature+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+an+efficient+three-step+protocol.">Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol.</a> Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Self-Renewal+of+Human+ES/iPS-Derived+Hepatoblast-like+Cells+on+Human+Laminin+111-Coated+Dishes.">Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes.</a> Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. , 86-100 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assay+Multiplexing+for+Toxicity+Screening+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+and+Hepatocytes.">High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes.</a> Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+images+and+morphological+profiles+of+30,000+small-molecule+treatments+using+the+Cell+Painting+assay.">A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay.</a> GigaScience. , (2017).</li><li>Pradip, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Content+Analysis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+Reveals+Drug+Induced+Steatosis+and+Phospholipidosis.">High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis.</a> Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).</li><li>Donato, M. T., G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Tolosa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high-content+screening+technology+for+studying+drug-induced+hepatotoxicity+in+preclinical+studies.">Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

Prof. David C. Hay är en av grundarna och direktör av Stemnovate Limited.
Prof. David C. Hay är en direktör av HigherSteaks Limited.

Våra halvautomatiska förfarandet är effektiva, pålitliga och ekonomiska, så att produktionen av HLCs på skalan (figur 1). Fanns det inte någon signifikant skillnad i termer av antalet celler mellan brunnar i plattan, vilket gör denna plattform en lämplig strategi för cellbaserade screening (figur 2). Dessutom användaren semi automation arbetsflödet kan producera ett stort antal plattor på en gång, vilket inte var möjligt innan du använder manuella processer5,12.
Ännu viktigare, den automatiserade processen inte inverkade på differentiering avkastning, med majoriteten av celler som uttrycker HNF4α (89,2% ±2) och ALB (92,8% ±6) (figur 3). HLCs också uttryckt CYP P450 enzymerna CYP2D6 och CYP3A4 och visas CYP1A2 och CYP3A metabolisk aktivitet jämföras med tidigare rapporterade experiment (figur 3)5. Trots standardiseringen av protokollet är cell konfluens före differentieringen kritiska för ren HLC differentiering. Säkerställa en bra cell fördelning över brunnen är därför en viktig faktor (figur 1). Detta har visat sig vara cellinje beroende, därför cell sådd och densitet optimering krävs för varje cell linje före skala upp.
Denna plattform är inte lämplig att producera stora mängder HLCs för kliniska tillämpningar i sin nuvarande form, och detta kommer sannolikt att uppnås med hjälp av cell fabriker och bioreaktorer. Dock tillåter den utvecklade metoden för snabb generering av mänskliga leverceller sjukdom modellering, drogkontroll och/eller narkotika återanvända studier. Analysen är dessutom mottagliga för multiplexering, tillåter generationen av multiparametric datamängder för mekanistiska analys. Framöver, tror vi också att denna teknik kan tillämpas till komplexare in vitro- system såsom 3D differentiering eller som en plattform för att förbättra HLC fenotyp i vitro.
Sammanfattningsvis anser vi att vårt enkla och halvautomatiskt system kommer att öka experimentella genomströmning och minska experimentell variation, därigenom förbättras kvaliteten biologiska datamängder och deras extrapolering mot människans fysiologi.

Primära humana hepatocyter (PHHs) representerar den nuvarande standarden för levern biomedicinsk forskning. Trots sina fördelar representerar PHHs en begränsad mogen hepatocyter med instabila fenotyp1. Mänskliga embryonala stamceller (EKSG) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) har föreslagits som en kraftfull resurs för biomedicinsk forskning, lovande en förnybar källa av mänsklig vävnad, inklusive levern2,3,4 . Nuvarande förfaranden för differentiering av hepatocyte generera celler som uttrycker hepatocyte markörer, gener och liknande PHHs3,4,5,6,7, funktioner 8,9,10,11. Mer nyligen, har användningen av definierade material och matriser såsom rekombinant lamininer, förbättrad cell fenotyp och experimentell reproducerbarhet5,12,13,14.
Traditionella cell kultur tekniker är starkt beroende av manuell pipettering, som är både tidskrävande och felbenägen. Detta begränsar genomströmning av analysen och platta format man kan arbeta med. Hittills har är de flesta studier som beskriver generationen av HLCs arbetskrävande som i naturen och därför liten skala i storlek15,16,17.
Aktuella framsteg inom vätskehantering och pipettering system, i kombination med automatiserad mikroskopi och laboratorium analysatorerna, har gjort det möjligt att utveckla förfaranden som minimerar behovet av mänsklig inblandning. Vi har dragit nytta av dessa tekniker och utvecklat ett halvautomatiskt differentiering system att generera stora mängder human levervävnad för grundläggande och tillämpad biomedicinsk forskning. Denna metod kan utföras med både mänskliga ESC och iPSC linjer med mindre justeringar behövs, beroende på cellinje. Kombinera detta system med hög innehållsanalys, visar vi att HLC fenotypning kan vara mindre tidskrävande och utförs på skala18,19,20,21.
Sammanfattningsvis, har automatisering av cell kultur tekniker beskrivs häri lett till förbättringar i tillförlitlighet, experimentell tid förvaltning och analys genomströmning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>405 LS Washer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GripTips for VIAFLO 96</td>
			<td>Integra</td>
			<td>6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160; 17705021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High-Content Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH12000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tube dispensing cassette</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td>
			<td>Integra</td>
			<td>6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496&#160;EMD MILLIPORE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-fetoprotein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3980</td>
			<td>1:500 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP2D6</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF-4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td>1:400 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76055</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11015</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

Mänskliga pluripotenta stamceller utgör en förnybar källa av mänsklig vävnad. Vår forskning är inriktad på att generera human levervävnad från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Nuvarande differentiering förfaranden generera mänskliga hepatocyte-liknande celler (HLCs) visar en blandning av fostrets och vuxna drag. För att förbättra cell fenotyp, har vi fullt definierat vår differentiering förfarandet och den cell-nischen, vilket resulterar i generationen av cellpopulationer som visar förbättrad genernas uttryck och funktion. Medan dessa studier Markera framsteg, har förmågan att generera stora mängder multi plattor för screening begränsats av arbetskraft intensiv förfaranden och tillverkningssatserna variation. För att tackla problemet, har vi utvecklat en halvautomatisk plattform för att skilja pluripotenta stamceller in i HLCs. Stem cell sådd och differentiering utfördes med vätskehantering och automatiska pipettering system i plattan med 96 brunnar format. Efter differentieringen, cell fenotyp analyserades med hjälp av automatiserad mikroskopi och en multi väl luminometern.

Celldifferentiering utfördes med hjälp av en embryonala stamceller linje (H9). Halvautomatisk plattformen användes för att skilja och karakterisera cellerna (figur 1A). En automatisk vätskehantering dispenser användes för att bestryka matris och utsäde enstaka celler. Celldifferentiering inleddes när cellerna nått 40% konfluens (dag 0). Media ändringar utfördes med en automatisk handhållen elektronisk kanal pipett system ta bort medium och vätskehantering dispensern för medelstora tillägg (figur 1A). Cell fixering och färgning utfördes med automatisk vätskehantering dispensern i kombination med automatisk plattan brickan. Avbildning och kvantifiering utfördes med hjälp av en hög-innehåll bildsystem och Columbus programvara. Cytokrom P450-aktivitet mättes med ett etablerat test. Efter substrat inkubation, cell supernatanterna skördades och Mareld inspelade med en multimode microplate reader (figur 1A). Dessutom användes konventionella fas kontrast mikroskopi för att mäta förändringar i cellmorfologi under hepatocyte differentiering (figur 1B).
På dag 18 undersöktes av variabiliteten i cell nummer mellan brunnar efter DAPI färgning (figur 2A). Sju synfält fångades per väl och antalet kärnor kvantifieras (figur 2A). Vi upptäckte inga statistiska skillnader mellan brunnar med ett genomsnitt på 41,662 ±3, 366 celler per brunn (figur 2B).
Dag 18, var HLCs fast och färgas för typiska hepatocyte markörer (figur 3A-G) och testas för CYP P450-aktivitet. HLCs uttryckt hepatocyte markörer såsom HNF4α (89,2% ±2 positiva celler), ALB (92,8% ±6 positiva celler), AFP (61,8% ±2 positiva celler). HLCs också uttryckt CYP P450 proteiner, CYP2D6 och CYP3A4 och visas ett distinkt polygonal utseende som framgår av E-Cadherin proteinuttryck. HLCs CYP P450-aktivitet mättes på dag 18. HLCs uppvisade CYP1A2 aktivitet vid 295,906 ±45, 828 RLU/mL/mg protein och CYP3A vid 1,066,112 ±177, 416 RLU/mL/mg protein (figur 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Figur 1: Hepatocyte differentiering från PSC i 96 väl formatera. (A). Diagram över den utrustning som används till semi automatisera celldifferentiering, fixering, färgning, imaging och funktionell aktivitet. (B). representant förändringar i cellulära morfologi under HLC differentiering. PSC är kort, grundmålas mot slutgiltiga endoderm, följt av hepatoblast specifikation kännetecknas av celler visar kullersten morfologi och före hepatocyte mognad med celler förvärva polygonal-form. Skalstapeln = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Figur 2: bedömning av HLCs väl-att-väl variabilitet. (A) Representation av en 96 väl platta syn på HLCs färgas med DAPI. Skalstapeln = 1 mm. (B) kvantifiering av cell nummer per brunn. Genomsnitt av antalet celler per brunnar i kolumner (överst) och rader (botten), från sju fält av visningar per väl och kvantifieras med hjälp av Columbus programvara. Genomsnittliga cell nummer över plattan är 41,662 ± 3 366 SEM celler per brunn. Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades mellan brunnar. En envägsavgift ANOVA med Tukey's post-hoc-statistiska tester var anställd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Figur 3: Hepatocyte markör uttryck och CYP P450-aktivitet mätning i HLCs på dag 18. (A) procentandelen av hepatocyte nukleär faktor 4 alpha (HNF4α) uttryck ± SEM är baserad på trettio brunnar med tio synfält per brunn. (B) andelen albumin (ALB) uttryck +/-SEM, är baserad på 3 separata brunnar med tio synfält per brunn. (C) procentandelen av alpha fetoprotein (AFP) +/-SEM är baserad på 3 separata brunnar med tio synfält per brunn. (D) E-cadherin färgning. (E) CYP2D6 färgning. (F) CYP3A4 färgning. (G). immunglobulin G (IgG) färgning kontroll. Skalstapeln = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 och 3A metabolisk aktivitet i HLCs på dag 18. Den data representerar sex biologiska replikerar +/-SEM. aktivitet är noterad som relativa ljus enheter (RLUs) / ml per 1 mg protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Det här protokollet beskriver en halvautomatisk strategi för att producera hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller i en 96 väl platta format. Denna process är snabbt och kostnadseffektivt, vilket gör att produktionen av kvalitet försäkrade partier av hepatocyte-liknande celler för grundforskning och tillämpad mänsklig forskning.

Halvautomatisk tillverkning av Hepatocyte liknande celler från pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generering av inducerade-pluripotenta stamceller med hjälp fibroblastliknande synoviocyter Isolerad från fogar av patienter med reumatoid artrit

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Använder mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived Hepatocyte-liknande celler för läkemedelsutveckling

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation av första hjärtat fält-liknande hjärt stamfäder och ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna från mänskliga pluripotenta stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av mänskliga primordiala könsceller-liknande celler på ytan av Embryoid kroppar från primas-pluripotency inducerade pluripotenta stamceller

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...