Name: metabolic analysis of drosophila melanogaster larval and adult brains
Uploaded: 2018-08-07T14:00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains at JoVE.com

מניות שהושגו מהמרכז בלומינגטון דרוזופילה מניות (NIH P40OD018637) נעשה שימוש במחקר זה. המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי רשת הפיתוח מוסדיים פרס (מושג) למצוינות במחקר ביו-רפואי מן הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט מספר P20GM103430, ועל ידי קרן רוד איילנד. מחברים תודה ווטרס ג' עמ' Snodgrass-חגורה לתמיכה שלהם בפיתוח פרוטוקול זה.

1. שיטת הכנה (יום 1)
<ol><li>מקם במנתח מטבולית (טבלה של חומרים) אינקובטור או חדר מבוקרי טמפרטורה מוגדר 11 ° C. הערה: טמפרטורה זה הינו אידיאלי עבור מדידות שצולמו 25 ° C, כמו זה מאפשר התנודות בטמפרטורה ~ 14 ° C המתרחשת בעת הפעלת וזמינותו. זו נגרמת על ידי החום שנוצר על ידי המכשיר במהלך הריצה.</li>
	<li>פתח את התוכנה המתאימה במחשב מחובר במנתח מטבולית. לחץ על הטמפרטורה נומרי בצד השמאלי התחתון של המסך. בחלון שנפתח, לחץ על התיבה לצד הפקודה "דוד על" ולהבטיח שמופיע סימן ביקורת. להתאים את הטמפרטורה עד 25 ° C ולהתאים בטווח הרגישות עד 0.2 ° C בעזרת החצים. הערה: מספר שעות נדרשים על מנת להשיג יציבות בטמפרטורות.</li>
	<li>פתח את מיכל דיו (טבלה של חומרים), להסיר את המחסנית הצלחת השירות מבלי לגעת את הגששים. הערה: הצלחת השירות משמש במהלך הכיול של המחסנית, לא נעשה שימוש בעת הפעלה וזמינותו מטבולית.</li>
	<li>להוסיף 200 μL של פתרון calibrant (טבלה של חומרים) הצלחת השירות והמקום הדיו בחזרה על גבי הצלחת השירות כדי להחזיר נוזלים החיישן רגשים שעל המחסנית. לא לגעת את הגששים, להגן עליהם מפני אור.</li>
	<li>חותם את המחסנית עם הסרט פרפין.</li>
	<li>דגירה הדיו בן לילה ב 25 º C.</li>
</ol>2. assay מדיה הכנה (יום 2)
<ol><li>להוסיף המדיום assay גלוקוז 10 מ"מ ו פירובט נתרן 10 מ מ.</li>
	<li>דגירה המדיום 25 ° c עד הנוזל יש equilibrated לטמפרטורה זו.</li>
	<li>להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות מד pH.</li>
</ol>3. התקנה של התוכנה לניתוח מטבולית של המוח דרוזופילה melanogaster (יום 2)
<ol><li>להגדיר את התוכנה המטבולית במנתח חילוף החומרים בשימוש בשלב 1.2.</li>
	<li>בחר "תבנית" במסך הבית של התוכנה.</li>
	<li>לחץ פעמיים על "ריק" להתחיל עיצוב assay חדש.</li>
	<li>לחץ על לחצן "צלחת מפה" בסרגל הכלים העליון כדי להציג את העיצוב של תא assay צלחת. הערה: הצלחת assay התא יכיל את דגימות המוח, will be בזוגות עם הדיו לפני תחילת וזמינותו מטבולית לרוץ.</li>
	<li>
לחץ על הוסף קבוצות כפתור 3 x.
	<ol>
<li>לחץ פעמיים על התווית "קבוצה 1", לשנות את שם "ניסיונית". הערה: קבוצה זו תכיל מוח לטוס ואיפוק מיקרו-רקמת מטופלים עם תרופות.</li>
		<li>לחץ פעמיים על התווית "קבוצה 2", לשנות את שם "שליטה". הערה: קבוצה זו תכיל מוח לטוס ואיפוק מיקרו-רקמות עם שום טיפול סמים.</li>
		<li>לחץ פעמיים על "קבוצה 3" תווית ולשנות כדי "איפוק רק". הערה: קבוצה זו תכיל מעצורים מיקרו-רקמות ללא מוח או הטיפול בתרופה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הקצה הבארות לכל קבוצה המבוססת על איפה דגימות בצלחת תא מיועדים להצבה.
	<ol>
<li>לחץ על התווית "ניסיונית", ואז לסמן בארות B2 - B8 במפה צלחת.</li>
		<li>לחץ על התווית "שליטה", ואז לסמן בארות C2-C8 במפה צלחת.</li>
		<li>לחץ על "איפוק היחידה" תווית ולאחר מכן סימון וולס D2-D8 במפה צלחת.</li>
		<li>בדוק כי כל ארבעת הפינות (A1, A12, H1 ו H12) המיועדים לשמש רקע. הערה: בארות לאורך ההיקף של הצלחת לא משמשים כדי לצמצם תופעות קצה. זה הגדרת ברירת מחדל בתוכנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לחץ על לחצן "פרוטוקול" בסרגל הכלים העליון כדי להגדיר את הפרוטוקול.
	<ol>
<li>לחץ על "ערוך מדידה הפרטים" בתיבה מדידה בסיסית.</li>
		<li>שינוי משך הזמן במנתח מטבולית ימדוד את המוח על-ידי שינוי המדד הבזליים זמן מחזור "3:00" על-ידי לחיצה הלמעלה ואני למטה בחצים.</li>
		<li>שינוי משך הזמן זה במנתח מטבולית ימתין בין המוח המידות על-ידי שינוי ההמתנה הבזליים זמן מחזור "0:00" על-ידי לחיצה הלמעלה ואני למטה בחצים.</li>
		<li>שינוי משך הזמן זה במנתח מטבולית ישלב את המדיה לפני מדידה המוח על-ידי שינוי הבסיס מערבבים זמן מחזור "1:00" על-ידי לחיצה הלמעלה ואני למטה בחצים.</li>
		<li>להתאים את המספר הכולל של מחזורי הבזליים, הכולל את המידה, רגע, שילוב מחזורי, ל "7" על-ידי לחיצה הלמעלה ואני למטה בחצים. הערה: מדידת קצב יציב של צריכת חמצן מתקבלים לאחר ~ 25 דקות מתחילת וזמינותו.</li>
		<li>לחץ על לחצן "הוסף הזרקת", הממוקם בסרגל הכלים השמאלי העליון.</li>
		<li>לחץ על התווית"הזרקת" ושנה אותה "Oligomycin".</li>
		<li>להתאים את אמצעי הזרקה, רגע ושעות שילוב לאלה על הבסיס.</li>
		<li>להתאים את המספר הכולל של הזרקת מחזורים ל- "6" על-ידי לחיצה הלמעלה למטה בחצים.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.7.6 - 3.7.8 אבל לשנות את התווית "רוט/AA" ולהתאים את המספר הכולל של הזרקת מחזורים ל 7 על-ידי לחיצה הלמעלה ואני למטה בחצים.</li>
		<li>לחץ על לחצן "הפעל Assay" בסרגל הכלים העליון.</li>
		<li>"שמור" וזמינותו, להתחיל בהגדרת הדיו assay (טבלה של חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנה של מיכל הדיו הכיול (יום 2)
<ol><li>
הסר את מיכל הדיו של החממה 25 ° C, להוריד את הכיסוי.
	<ol>
<li>להוסיף 20 μL של 100 μM oligomycin אל הנמל קטן הזרקת מעגלית השמאלי העליון, ליציאה A, במחסנית המתאימים כל ניסיוני וולס בצלחת תא ולהוסיף 20 μL assay המדיה ליציאה a בבארות כל האחרים, כולל הבארות הבקרה ואת הרקע. הערה: המחסנית מכילה 4 יציאות (A-D) עבור כל הבארות 96 התואם הצלחת תא מה יכיל את הדגימות. שלב זה מתבצע לפני הוספת הדגימות. הוספת μL 20 תוצאות oligomycin 100 μM ריכוז oligomycin הסופי של 10 μM בצלחת תא טוב ברגע הסם מוזרק על ידי רופא מנתח חילוף החומרים. Oligomycin הוא מעכב של ATP סינתאז. הערך שקיבל כתוצאה של צריכת חמצן ישקף את כמות מקושרים-ATP הנשימה במוח. כדי כראוי להזריק הסמים לתוך הבארות שצוין, כל יציאות באותו המכתב יש למלא באותו אמצעי אחסון של נוזל, אפילו אם לא בשימוש.</li>
		<li>להוסיף μL 22 של μM 50 rotenone/antimycin A נמל קטן נכון מעגלית העליון, פורט B, במחסנית המתאימים כל ניסיוני וולס בצלחת תא והוסף μL 22 של מדיה assay ליציאה B של כל בארות נוספות, כולל הבארות הבקרה ואת הרקע. הערה: התוצאה הסופי rotenone/Antimycin ריכוז של 5 μM בצלחת תא טוב ברגע הסם מוזרק על ידי רופא מנתח חילוף החומרים. Rotenone antimycin A הם מעכבי התחבורה אלקטרונים בשרשרת מתחמי I ו- III, בהתאמה. הערך שקיבל כתוצאה של צריכת חמצן ישקף שאינם מיטוכונדריאלי הנשימה במוח.</li>
		<li>לחץ על 'התחל הפעלה' כדי למקם את מחסנית טעון עם לוחית השירות במנתח מטבולית עם טוב A1 ממוקם בפינה השמאלית העליונה מול המכשיר, עם מטעין את הצלחת הרחבת מהצד הימני של המכונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר "אני מוכן" בתוכנה כדי להתחיל את equilibration ואת הכיול של מיכל הדיו לפני תחילת וזמינותו מטבולית עם לוחית התא המכיל את הדגימות. הערה: התוכנית תבקש לשמור את הקובץ ולאחר מכן להתחיל equilibrating, כיול. שלבים אלה יכול לקחת עד 1 ח' שלבים 5-8 נערכים במשך הזמן equilibration וכיול.</li>
</ol>5. הכנת הרצועות מיקרו-רקמות (יום 2)
<ol><li>בחר איפוק 1 מיקרו-רקמת לכל במוח נמדדים, בתוספת לפחות 3 לשימוש בפקדים איפוק בלבד, מהגורם אחסון (מכיל 70% אתנול).</li>
	<li>לשטוף את הרצועות עם אתנול 70% טריים ולשטוף אותם במים יונים 3 x עבור 2 דקות כל אחת, באמצעות רשת סלסלה עם 6-ובכן צלחת (טבלה של חומרים). להוסיף מים נוספת שוטף, אם לא מבינה עדיין לפלוט ריח אלכוהול.</li>
	<li>לשטוף את הרצועות מיקרו-רקמת בתקשורת assay ולהשאיר אותם בפתרון זה עד שיהיו מוכנים לשימוש.</li>
</ol>6. ניתוח דרוזופילה melanogaster זחל המוח (יום 2)
<ol><li>בחר מאוחר הזחלים לחלל (נודד) השלישי בקבוקון של זבובים אורגון-R בתרבית תוך שימוש ברמת דיוק גבוהה, בסגנון פינצטה (0.10 x 0.06 מ"מ2) 5.</li>
	<li>מקום הזחל הבדידות נקי ויבתר ספוט צלחת (טבלה של חומרים) המכיל 500 μL ל- 1 x PBS. הערה: צלחת ספוט היא צלחת זכוכית עם דיכאון, נהגו לנתח רקמות קטנה ואורגניזמים.</li>
	<li>רחץ הזחל ע י ניעור שלה בעדינות בתוך הבאר, באמצעות פינצטה.</li>
	<li>להעביר הזחל הבאר נקי של צלחת ספוט המכיל 500 μL ל- 1 x PBS.</li>
	<li>מקם את הצלחת לזהות במיקרוסקופ ויבתר.</li>
	<li>לתפוס הזחל-האמצעי שלה עם זוג אחד של פינצטה, בעת האוחז את הווים עין עם זוג השני של פינצטה.</li>
	<li>בעדינות בצורה חלקה משוך הזחל בכיוונים מנוגדים, באמצעות שתי קבוצות של פינצטה.</li>
	<li>לדמיין את המוח, אשר בדרך כלל נשאר מחובר ווים העין, יהיה בדרך כלל יש דיסקים עין-antennal קשור אליו.</li>
	<li>הסר בזהירות את רקמות נוספות מן המוח, באמצעות ווים העין כדי להחזיק את המוח במקום. לבסוף, הפרד את הווים עין מן המוח.</li>
	<li>השתמש פינצטה כדי לעבור ניתוח המוח באר חדשה על צלחת ספוט המכיל 1 x PBS.</li>
	<li>חזור על שלבים 6.1-6.10 עד 14 המוח הם גזור. הערה: הזמן הכולל מן ההתחלה של הקרע כדי לברוח assay לא יעלה על 30 דקות.</li>
</ol>7. תוספת של המוח ביתור לצלחת תא Assay 96-ובכן מטבולית (יום 2)
<ol><li>להוסיף 50 μL של מדיה assay הבארות של צלחת assay 96-ובכן מטבולית (טבלה של חומרים) בשימוש את הניסוי, כולל את ניסיוני, שליטה, איפוק בלבד, ואת הרקע בארות.</li>
	<li>בזהירות המקום מח אחד כל היטב מ A2-A8 ו- B2-B8 צלחת תא, באמצעות מלקחיים, מרית או על פיפטה. הערה: זה יכול להיעשות הרחק המיקרוסקופ ויבתר.</li>
	<li>תחת המיקרוסקופ לנתיחה, השתמש מיקרו-בדיקה המחט בנט לשקוע המוח בתחתית הבאר.</li>
	<li>מקם בעדינות במוח באמצע שלושה כדורים מורמת באמצעות המכשיר.</li>
</ol>8. תוספת של הרצועות מיקרו-רקמה על הלוח התא Assay 96-ובכן מטבולית (יום 2)
<ol><li>באמצעות פינצטה, מקם הריסון מיקרו-רקמה על הקצה של צלחת assay טוב ולאחר להשתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שזה שכיוונו את טבעת הפלסטיק פונה כלפי מטה, את רשת השינוי למעלה.</li>
	<li>הסר את הלוחית מתחת למיקרוסקופ ולהשתמש פינצטה כדי לתפוס את האיפוק משני הצדדים ושחרר אותה בעדינות לתוך הבאר.</li>
	<li>השתמש המחט בנט מיקרו-החללית כדי לדחוף את הריסון לתוך הבאר.</li>
	<li>תחת המיקרוסקופ, ודא כי המוח ניתן לראות דרך רקמות הריסון כי ממורכזת בתוך הבאר.</li>
	<li>חזור על השלבים 8.1 – 8.4 עבור כל הבארות שיהיו וזמינותו — A2-A8, B2-B8 ו- C2-C8.</li>
	<li>להוסיף בזהירות 130 μL assay המדיה לכל אחד ניסיוני, שליטה, בארות איפוק בלבד.</li>
	<li>ודא כי המוח ואת ריסון מיקרו-רקמות לא מתגייסות תוך הוספת המדיה דמיין אותם תחת המיקרוסקופ.</li>
	<li>להוסיף μL 180 של מדיה assay הבארות פינת ארבע לשימוש רקע הפקד.</li>
</ol>9. תוספת של צלחת תא במנתח מטבולית, תחילת וזמינותו (יום 2)
<ol><li>ודא equilibration ואת כיול מלאה מחכים התוכנה תציג הצלחת התא המכיל את הדגימה.</li>
	<li>בחר "מגש פתוח" ולחכות המכשיר להוציא את הצלחת השירות.</li>
	<li>הסר את לוחית השירות ולהוסיף את הצלחת תא, ללא המכסה, בכיוון זהה.</li>
	<li>בחר ' טען תא צלחת "עבור הכלי כדי לקחת את הצלחת תא ולסגור את המגש, ולאחר מכן להתחיל וזמינותו.</li>
	<li>הצג את המידות בשדה בזמן אמת עם קווי שגיאה במסך המחשב מפעיל את התוכנה.</li>
	<li>הסר את לוחית תא בשניה ואת מחסנית השלמת וזמינותו. הערה: מחסניות לזווג וצלחות התא יכול להיות שימוש חוזר 5 x.</li>
</ol>10. מדידה שלאחר ניתוח (יום 2)
<ol><li>להשתמש במיקרוסקופ ויבתר כדי לוודא כי המוח ואת הרצועות מיקרו-רקמת עדיין ממוקמות כהלכה בתוך הבאר לאחר השלמת וזמינותו. אל תכלול כל בארות עם מומים הניתוח.</li>
	<li>לייצא את קצב צריכת החמצן (OCR), הנתונים קצב Acidification חוץ-תאית (ECAR) עבור ניתוח נוסף.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+related+neurodegenerative+disorders.">Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders.</a> Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-derived+mutations+in+IDH1+dominantly+inhibit+IDH1+catalytic+activity+and+induce+HIF-1alpha.">Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha.</a> Science. 324 (5924), 261-265 (2009).</li><li>Brody, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metabolic+changes+in+major+depressive+disorder+from+pre-+to+post-treatment+with+paroxetine.">Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine.</a> Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>Dona, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+the+identification+of+metabolites+in+NMR-based+metabonomics/metabolomics+experiments.">A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. -. M., R&#252;hl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).</li><li>Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cancer+cell+metabolism+with(13)C+flux+analysis:+Recent+progress+and+future+challenges.">Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges.</a> Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).</li><li>Clark, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+recording+of+blood+oxygen+tensions+by+polarography.">Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography.</a> Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).</li><li>Lighton, J. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Metabolic+Rates.">Measuring Metabolic Rates.</a> Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).</li><li>Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+measuring+cellular+bioenergetics+using+extracellular+flux.">Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux.</a> Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).</li><li>Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+whole+white+adipose+tissues.">A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues.</a> Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).</li><li>Fan, Y. -. Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts,+organoids,+and+sorted+stem+cells.">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mitochondrial+activity+in+renal+proximal+tubule+cells+from+young+spontaneously+hypertensive+rats.">Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats.</a> Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+glycolysis+is+essential+for+neuronal+survival+in+drosophila.">Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).</li><li>Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+oxygen+consumption+increase+following+acute+HDAC/KDAC+inhibition+in+Drosophila+tissue.">Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Tipping, M., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+device+for+restraining+contents+of+a+cell+plate.">Method and device for restraining contents of a cell plate.</a> United States patent. , (2017).</li><li>Neville, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+method+for+measuring+whole+brain+metabolism+in+model+systems.">A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems.</a> Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).</li><li>Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+as+tools+for+metabolic+studies.+I.+A+survey+of+toxic+antibiotics+in+respiratory,+phosphorylative+and+glycolytic+systems.">Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).</li><li>Turrens, J. F., Boveris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+anion+by+the+NADH+dehydrogenase+of+bovine+heart+mitochondria.">Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria.</a> Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).</li><li>Potter, V. R., Reif, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+an+electron+transport+component+by+antimycin+A.">Inhibition of an electron transport component by antimycin A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Origin+of+Cancer+Cells.">On the Origin of Cancer Cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis:+A+Hallmark+of+Cancer+Metabolism.">Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).</li><li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen.">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).</li></ol>

מ Tipping בעלת פטנט זמני על הרצועות מיקרו-רקמת המתוארת בעלון זה פרוטוקול17.

כאן, מתוארת שיטה לניתוח מטבולית של melanogaster ד המוח זחל ומבוגרים ex-vivo . בתנאים הבזליים, צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית לציין איך סמויה פעיל המוח יכול לקבוע אם רקמה הפכה יותר תלויה מיטוכונדריאלי לעומת glycolytic הנשימה בהתאמה11.
מתייחסים המוח עם מעכבי או תרופות טיפוליות יכול לספק מידע נוסף אודות מצב מטבולי של הרקמה. ניתן גם להוסיף חילוף חומרים דיאלקטריים לקביעת יחסי תלות מטבוליטים ספציפיים, כגון גלוקוז כדי לבדוק אפקט ורבורג22 או גלוטמין לחקור glutaminolysis23— שני משותף ב התכנות מטבולית. לפי מחקרים ארוכי טווח, הזחלים או זבובים יכול גם להיות מוזן סמים במקום באמצעות הזרקת יציאות, המוח יכול להיות לבדיקה במרווחי זמן או את מובילים, בהתאם לעיצוב הניסיונית. בשיטה זו ניתן למטב עבור יישומים רבים.
שיטה זו מוטבה שכל אולם ניתן להשתמש כדי לנתח את הזחל18 ורקמות למבוגרים אחרים. בנוסף, מערכות אחרות מודל קטן יכולים לנצל בשיטה זו כדי למדוד את כל האורגניזמים18 או רקמות. המגבלה היחידה אופטימיזציה של שיטה זו עבור מערכות אחרות הוא הגודל של איבר, רקמה או אורגניזם. תא שנוצרו על-ידי מיקרו-רקמת הריסון היא המכשול גודל לרוץ וזמינותו. אם הפלט מטבולית הוא נמוך מדי של המוח או של הרקמה הנבדקת, גודל המדגם אינו אילוץ, איגוד דגימות יכול לשמש כדי להגביר את המידות assay ואת הרגישות. שינוי פרוטוקול זה עבור יישומים אחרים צריך רק דורשים אופטימיזציות קטין, כולל 1) בחירת המדד המתאים ומערבבים מחזור מספרים התזמון ואת 2) לקביעת ריכוזים טיפול יעיל עבור הרקמה. מדד ובשעות ערבוב של נקבעו על ידי ריכוז חמצן ניטור נמדדת במנתח מטבולית במהלך כל מחזור. זה ניתן להציג על-ידי בחירת O2 לחצן ציר Y2 בחלון סקירה בתום המרוץ. במהלך כל מחזור, צריך להיות ריכוז חמצן פתע המשקף את צריכת החמצן של הרקמה במשך הזמן נמדד, ולאחריו חזרה ריכוז החמצן ההתחלתי במהלך מחזור ערבוב. מיקס, מדידת הזמנים צריך להיבדק עד תבנית זו נוצרת. באמצעות שיטה זו, את המוח חרקים אחרים נחקרו. המוח האלה היו גדולים יותר משכל לעוף פה אבל עדיין מתאימים בתוך התא שנוצר על ידי הריסון רקמות. הקריאות OCR מן המוח האלה היו בגובה 400 pmol/min (נתונים לא מוצג). תוצאות מחקרים אלה, כמו גם שיעורי OCR להתיישר עם מחקרים אחרים מדידת צריכת חמצן כל-פליי18,24, מראים כי המוח melanogaster ד היו לא מוגבל חמצן. עבור המוח melanogaster ד והן רקמות אורגניזמים אחרים, יישום שיטה זו דורשת תשומת לב מיוחדת ארבעה שלבים קריטיים.
להשיג בהצלחה מדידות ביולוגית רלוונטית הדירים, יש שלבים קריטיים של פרוטוקול זה חייב להיות במעקב. ראשית, השימוש של מיקרו-רקמת מעצורים נדרש עבור שיטה זו. ייצור הרסנים האלו באמצעות מפרט חומרים המפורטים חיוני. החומרים נבחרו בשל ההרכב הכימי שלהם אינרטי, והיכולת שלהם כדי לאפשר חילופי המדיה המתאים במהלך השלבים ערבוב ללא יצירת בועות אוויר. שנית, הכנה בזמן לנתיחה וצלחת נדרש להגדיל את הפלט מטבולית של הרקמה. ניתוח קצר פעמים צריך פוגע באופן משמעותי את המוח. מחקרים אחרים הראו כי המוח לעוף יכול להשאר בחיים במשך שעות עד ימים לאחר ניתוח אם מאוחסנים כראוי זלוף קאמרית25. עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 3B ו- 3D, אם המוח נותרו יושב בתקשורת assay במשך פרקי זמן ארוכים לפני וזמינותו, הן ירד שיעור צריכת החמצן. במהלך וזמינותו, דגימות עוברים שלב ערבוב במהלך כל מחזור. ערבוב זה לא רק מסייע עם הזריקות של תרכובות כימיות, אלא פועלת גם recirculate בתקשורת ולספק חמצן. המוח מסוגלים להישאר סמויה פעיל למשך פרקי זמן ממושכים במהלך מחזורי מידה-מיקס מאשר הם המקננת בתקשורת על גבי ספסל. לפיכך, ניתוח מוח זחל צריך להיות מומחה לפני שמתחילים להגדיר זה וזמינותו. כאשר הגדרה זו assay, לנתח מספר קטן של אחרים בכל פעם, כדי לצמצם את מספר המוח זקוק, בארות מנוצל. פעולה זו תמנע עיכובים בין לנתח את המדידות וזמינותו. שלישית, שמירה על טמפרטורה יציבה דרוש כדי לנתח את קצב חילוף החומרים שיש בתנאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. טמפרטורות assay מוגברת עלולה לגרום מוות הרקמה, שנצפה על ידי שיעורי צריכת חמצן נמוכה (איור 3C). אם זבובים גדלים בטמפרטורה שונה למטרות ניסוי, המידות לבצע גם בטמפרטורה זו. בזמן ניתוח סביר יבוצעו בטמפרטורת החדר, אם וזמינותו ייערך בטמפרטורה שונה, המוח מצופה ומאופק צריך להיות מודגרות בטמפרטורה נדרש למשך 15 דקות לפני הפעלת וזמינותו. לבסוף, התבוננות וזמינותו שלאחר וולס הוא קריטי כדי לקבוע אם הרקמה מיצוב יושפע המדידות. לעיתים, יהיה אחד חריג חשוד טעות טוב זה, לאחר התבוננות את הצלחת תחת המיקרוסקופ ויבתר, ניתן לסלק מניתוח הנתונים עקב או אובדן של רקמת או mispositioning, שבו המוח חמק מתוך המרכז של הבאר, תקוע תחת הטבעת פולימר של הריסון. רקמות ייתכן שיאבדו אם הריסון לא אובטח כראוי אל הבאר היה מופרע במהלך מחזורי ערבוב. בעוד אף אחד האירועים הללו קורה לעתים קרובות, אם הם לא נכללים הניתוח, הם תפחית את ערכי קצב באופן משמעותי.
מידת השטף מטבולית כל רקמות על ידי ניטור צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית מספק שיטה ביולוגית רלוונטיים להבנת איך חילוף החומרים משתנה על ידי הנוף גנטי או תנאים אחרים ניסיוני. שיטה זו היא רגישה מספיק כדי לזהות שינויים מטבוליים יחיד melanogaster ד המוח, אשר אינה אפשרית באמצעות עצירה-flow respirometry או calorimetry עקיף. זה גם פחות טכנית מאתגר יותר באמצעות אלקטרודה של קלארק כדי למדוד את צריכת החמצן. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא היכולת לנתח את המוח כל אחד לכל טוב. התבנית 96-ובכן מאפשר קריאות יותר רגיש, לכן, גנוטיפ אחד או יותר יכול להיות לבדיקה במועד עקב מספר קטן של דוגמאות הנדרש לכל assay. בזמן מדידת מטבוליזם ברקמות הוא עדיין מאתגר ודורש בקפידה גדלו ובעלי מסונכרן, פרוטוקול זה מתאר שיטה פשטנית יחסית מהר, יש הפוטנציאל לנתח רגישויות מטבוליים רבים ד melanogaster המוח זחל ומבוגרים.

התכנות מטבולית זוהתה ב מחלות נוירולוגיות רבות, כולל Glioblastoma גליובלסטומה (GBM), מחלת הנטינגטון, הפרעת דיכאון הגדולות (MDD)1,2,3. חילוף החומרים הופך המוקד של אסטרטגיות טיפוליות, קידמו כלים למחקר בסיסי מטבולית. עם זאת, רוב השיטות האלה נועדו ללמוד שורות תאים ותאים הראשי או לנתח גדול יותר רקמות קיבוע שאחרי או - הקיפאון. כמה גישות צריכים לסמוך על ערכות למדוד בצורה פשטנית מטבוליטים ספציפיים, בעוד אחרים נעזרו יותר יקרה ומורכבת ניתוחים ניצול כרומטוגרפיה בשילוב עם ספקטרומטר מסה4 לאותה מטרה. כדי להבין את הנוף מטבולית גדולה יותר, חילוף החומרים פרופיל5,6 וניתוח השטף מטבולית (MFA)7 צמחו כדי להשלים את פרוטיאומיה מבנית בקנה מידה גדול ואת גנומית מחקרים. פרופיל מספק ייצוג כמותי של מטבוליטים בתא או רקמות בנקודה מסוימת בזמן, בעוד MFA ומרחיב על זה מתן אפשרות המעקב של מטבוליטים שכותרתו לאורך זמן. האחרון היה שימושי חושף כמה מקורות אנרגיה שאינם מנוצלים באופן שונה בתא או רקמות כאשר מצב המחלה8. עם זאת, שיטות אלה אינם כוללים את המדידה של קצב חילוף החומרים באופן כללי.
לחקור המדינה בסך הכל מטבולית של מערכות מודל קטן, שיטות מסורתיות, כגון קלארק אלקטרודה9 ו calorimetry עקיף10, ניתן למדידת צריכת חמצן או מוגדר עבור עצירה זרימה respirometry, למדוד חמצן, פחמן דו-חמצני ריכוז, בהתאמה. שיטות אלה, תוך מתן במדויק תובנה המדידה של התכנות מטבולית ברמת האורגניזם, יש מגבלות. השימוש של האלקטרודה קלארק יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, לא נועד ללימודי תפוקה גבוהה. Respirometer זרימה התחנה לא יכול לתפקד עם הרגישות נדרשים assay תאים או רקמות. לפני כמה שנים, טכנולוגיה חדשה שפותחה במיוחד עבור אלה יישומים קטנים11. המכשירים האלה נועדו תחילה למדוד את צריכת החמצן ואת חוץ-תאית לחומצי שורות תאים ותאים הראשי בתבנית 24 - או 96-ובכן. הפשטות של הפלט נתונים הקמה הוקמה שיטה זו כחלופה הגישות המסורתיות. מתודולוגיה זו היא כלי רב עוצמה עבור תאים, ההתקדמות אפשרו לשקילת רקמות אגרופים12,13,14. עם זאת, השיטות מנוצל מבחני אלה אינם מאפשרים לשקילת כל האיברים ממערכות מודל קטן.
ניתוח מטבולית של המחלה מודלים כרוך לעתים קרובות את האינטראקציה בין תאים של הפונקציה המקצועית המתגוררים בתוך רקמת אותו. לדוגמה, גלייה לייצר מטבוליטים מנוצל על ידי נוירונים. אינטראקציות מטבולית אלה דרושים עבור ה15-הישרדות עצביים. מודל קטן מערכות הן יתרון עבור חוקרים שאלות מעין אלה. מחקרים כדי למדוד את חילוף החומרים של איבר שלם, המכיל מגוון רחב של סוגי תאים, יוסיף ההבנה של ניצול האנרגיה בתוך vivo. לאחרונה, בקר. et al. דיווח על שיטת מדידת צריכת חמצן ראשי כל לטוס16. על ידי צירוף בעל מספר ראשים ביחד היטב אחד של צלחת תא 24-ובכן, קריאות צריכת חמצן התקבלו באמצעות מנתח מטבולית. בזמן זה עובד היטב עבור ראשי, אשר מופרדים בקלות מן הגוף, קשה הרבה יותר לשימוש עבור איברים כגון המוח זחל, כי כמות גדולה צריך להיות גזור על שיטה זו. לכן, שיטת ניצול צלחת תא 96-ובכן, אשר מגביר את הרגישות של צריכת החמצן, קריאות acidification חוץ-תאית, פותחה כדי assay מוח כל זחל בודד.
במנתח מטבולית השתמשו במחקר זה מחייב את הדגימה הנמדדים ישארו בתחתית הבאר של צלחת תא 96-ובכן. עבור תאים ורקמות שטוחה יחסית, זה לא אתגר; עם זאת, שכל זחל ומבוגרים melanogaster ד , בלתי אפשרי באמצעות פרוטוקולי ציפוי צלחת מסורתיים. צורת תלת כדורית של המוח לא דוגלים באמינות השטח צלחת, אלו. שעושים נפגעים לעתים בעת ניסיון למקם אותם כראוי בתוך הבאר. חלק קריטי של פרוטוקול חדש זה הוא העיצוב והפיתוח של מיקרו-רקמת ריסון17 המספקים חדר קטן על המוח לשכון בלי לשבש המידות מטבולית. תא שנוצר הוא כ 0.016 ב גובה מספק מספיק מקום כדי בקלות להחזיק את המוח melanogaster ד רבים. הרצועות מורכב רשת ניילון המצורפת טבעת פולימר אינרטי, יידונו בהמשך נציג תוצאות. שימוש באזיקים האלה ממזער את הזמן הנדרש כדי להתכונן המוח ביתור המדידה מטבולית. ייעול ההליך מדידה יוצרת את צריכת החמצן יציב, לשחזור וקצבי acidification חוץ-תאית לאחר שישה מחזורים מדידה (של 25 דקות). המוח להישאר סמויה פעילה בתנאים אלה למשך תקופה מינימלית של 2 h, המאפשרת זריקות של הרפוי, מעכבי או אחרים טיפולים דרך היציאות משלוח סמים מחסנית מנתח מטבולית. ניתן להתאים בקלות עבור אחרים רקמות, דגם קטן מערכות18גם פרוטוקול זה.
פרוטוקול שיפורטו להלן מתאר כיצד assay צריכת חמצן במוח כל דרוזופילה זחל כאשר הם אתגר מיטוכונדריאלי מתח. להדגיש את המוח, oligomycin נוספת כדי לעכב את ATP סינתאז19. הירידה בצריכת החמצן בהנחה הבזליים מראה מדידה של כמות נשימה בהתאם-ATP במוח. ירידות נוספות צריכת חמצן לאחר טיפולים עם rotenone20 ו- antimycin21, מעכבי של אלקטרון תחבורה שרשרת מתחמי I ו- III, בהתאמה, ציין את כמות צריכת חמצן מיטוכונדריאלי המוח. Assay הזה הוא דוגמה אחת של איך מיטוכונדריאלי הנשימה במוח לעוף אולי ניתן להשוות, כיצד ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את חילוף החומרים משתנים אחרים. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי למדוד את צריכת החמצן פשוט הבזליים וקצבי acidification חוץ-תאית, כמו גם לגבי עיצוב משוכלל יותר מחקרים חוקרת ניצול אנרגיה ספציפיים או המצע ניצול השערות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Assay medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102365-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DLW354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delrin</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2XMK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Schneider Media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont High Precision Tweezers (style 5)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 409</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitostress kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>oligomycin, rotenone, and antimycin A included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell inserts (6-well)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX spot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave v2.4 XFe96 analyzer software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop</td>
			<td>free download to mac or windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 catridge and cell plates</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic analysis of drosophila melanogaster larval and adult brains

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת חילוף החומרים במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . לכימות חילוף החומרים באיברים כל מספק הבנה ברמת רקמות של ניצול האנרגיה לא יכול להיות שנתפסו בעת ניתוח יסודי תאים, שורות תאים. בזמן ניתוח זה ex-vivo, הוא מאפשר המדידה ממספר תאים מיוחדים לעבוד ביחד לביצוע פונקציה ברקמה אחת, יותר מקרוב מודלים האיבר ויוו . התכנות מטבולית נצפתה מחלות נוירולוגיות רבות, לרבות neoplasia מחלות ניווניות. פרוטוקול זה פותחה כדי לסייע בחקירה של הקהילה melanogaster ד של חילוף החומרים במודלים מחלה נוירולוגית באמצעות מנתח חילוף החומרים זמינים מסחרית. מדידת חילוף החומרים של כל המוחות בכל במנתח מטבולית הוא מאתגר עקב הגיאומטריה של המוח. מנתח זה דורש דוגמאות ישארו בתחתית צלחת 96-ובכן. תא ודוגמאות רקמה אגרופים אפשר לדבוק פני השטח של הלוח התא או לנצל ספרואיד צלחות, בהתאמה. עם זאת, צורה כדורית, תלת מימדי של melanogaster ד המוח מונעת את הרקמה והקפדה על הלוח. פרוטוקול זה דורש איפוק מיקרו-רקמות מעוצב ומיוצר במיוחד כי עוקף את הבעיה על-ידי מניעת כל תנועה של המוח תוך מתן אפשרות מידות מטבולית שני רגשים במנתח חיישן של מצב מוצק. צריכת החמצן acidification חוץ-תאית המחירים הם רגישים טיפול עם מעכבי חילוף החומרים הדירים. עם אופטימיזציה קטין, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש עם כל כל רקמות ו/או מערכת מודל, ובלבד גודל המדגם אינו עולה על התא שנוצר על ידי הריסון. בזמן מדידות מטבולית הבזליים וניתוח לאחר טיפול עם מעכבי מיטוכונדריאלי מתוארים בתוך פרוטוקול זה, אין ספור תנאים ניסיוני, כגון העדפת מקור אנרגיה וסביבה לגידול, יכולה להיחקר.

פרוטוקול המובאת כאן מחייב שימוש מיקרו-רקמת ריסון זה לפגוש את המפרטים המתוארים להלן. בשיטות אחרות כדי להחזיק המוח במקום בתחתית הלוח התא 96-ובכן הצליחו להזיזה (איור 2A ו- 2B). ראשית, סוכנים שונים כדי להגביר את דבקותה רקמות לצלחת נבדקו. דבק רקמות זמינים מסחרית (טבלה של חומרים) מומלץ לשימוש של תאים, organoids עם תא לוחות, לוחות ספרואיד, בהתאמה. בתחילה, המוח הופיע לדבוק פני טוב; עם זאת, הממצאים (OCR) צריכת חמצן היו נמוך, התבוננות הבארות לאחר וזמינותו חשף כי המוח כבר לא צורפו אל פני השטח טוב (איור 2 א). אותן תוצאות אירעה עם דבק סופר (איור 2 א). . הבא בתור, ייצור מסכים קטנים כדי להחזיק המוח בתוך תא קטן בתחתית הבאר היה ניסיון (איור 2B).
מסכי מתכת הפיק קריאות OCR גבוה לבד, כפי מתכת המסכים עם טבעת פולימר מחזיק המסך במקומה (איור 2B). רשת פלסטיק רשת נעשה שימוש עם הטבעת פולימר אותו. התקן זה גרם קריאה OCR שלילי להתקבל. לבסוף, מיקרו-רקמת ריסון תוכננו באמצעות של פולימר אינרטי לטבעת מדידה של הקוטר החיצוני של 0.146 ב, של הקוטר הפנימי של 0.1335 ב, עובי של 0.0125 ב, ולגובה של 0.016 in (טבלה של חומרים). דבק סופר (טבלה של חומרים) נעשה שימוש כדי לצרף את הטבעת רשת ניילון עם גודל הנקבוביות ספציפי של 0.0039 בקוטר (טבלה של חומרים). גודל הנקבוביות הוא קריטי, כמו זה מאפשר החלפת מדיה, מטבוליט ללא היווצרות בועות אוויר, אך עדיין משמש כמחסום בראש. הרסנים האלו לבד התוצאה מעט ל- OCR אין קריאה, וגם בעת שימוש עם המוח, מאפשרים קריאות לשחזור (איור 2A ו- 2B). האימות לאחר וזמינותו הראו כי המוח היו עדיין מוצבים כראוי בתוך הבארות. הרסנים האלו רקמות כיום אינם זמינים מסחרית, אבל יכול להיות מיוצר על ידי ביצוע המפרט הנ. בזמן זה דורש ייצור מדויק, רוב החנויות מכונה יוכלו להתרבות באיפוק זה באמצעות החומרים הנזכרים לעיל.
הפרוטוקול היה אופטימיזציה נוספת לחשבון התקשורת assay, על הזמן המותר לפני לרוץ וזמינותו של הטמפרטורה (איור 3). בתחילה, מבחני הוקמו בתוך המדיום שניידר לדגם הסביבה זחל ויוו . עם זאת, התקשורת בשימוש אין אפשרות להכיל סוכנים חציצה מאז pH משמשת כדי למדוד את ECAR. מדיה זו, לכן, צריך להיות מותאם אישית שנעשו, וזה יקר. כדי למטב את זה, באמצעי התקשורת assay זמינים מסחרית תוכנן עבור ניתוח מטבולית (טבלה של חומרים) שימש במקום התקשורת שניידר. רמות OCR היו ללא שינוי, אפילו כאשר להגדיל את רמות הגלוקוז מעט לתנאים דגם assay מדיה (איור 3 א). כל מבחני מנקודה זו ואילך נערכו במדיום וזמינותו. תוספי למדיה אופטימציה על ידי התבוננות אם את צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית הראו תגובה בעת טיפול עם מעכבי מיטוכונדריאלי ידוע. הבא, ניתחנו את זמן ההמתנה בין ניתוח של שלשול וזמינותו. דגירה של 3 h ירד באופן משמעותי את רמות OCR (איור 3B). איור 3D מדגים את ההבדל בנקודת הזמן השישי, כאשר רמות OCR, ECAR לייצב שכל הן למבוגרים והן זחל. כך, הפרוטוקול מציין להתחיל וזמינותו מיד לאחר את והניתוחים, אלא אם כן הניסוי דורש equilibration טמפרטורה, שבו הוא הציע במקרה דגירה למשך פחות מ 30 דקות. במנתח מטבולית מאוחסן בתוך אינקובטור מוגדר כ- 11 ° C כדי לאפשר טמפרטורה 25 ° C ברחבי וזמינותו. אם הטמפרטורות גבוהות בשל טמפרטורת הסביבה של פעולת המכשיר, רמות OCR מופחתת שנצפו (איור 3C). זה המשוערות עקב מוות הרקמה.
כאשר התנאים ממוטבת עוקבים, מבחני עם זחל, למבוגרים המוח כתוצאה קריאות של OCR מעט העולה על 150 pmol/min-התייצב בפעם השישית הצבע, ~ 25 דקות לתוך וזמינותו (איור 4B). בקצב הזה נשמר במשך לפחות 30 דקות (איור 4A) ועד 2 h (נתונים לא מוצג). ECAR הוא נמוך במקצת במוח למבוגרים יותר במוח זחל בנקודת הזמן השישי (איור 4D), נשמר במשך לפחות 30 דקות (איור 4C). ממצא זה מקבילה לעלייה גליקוליזה הזחל לתמוך בצמיחה. זריקה עם מעכב מיטוכונדריאלי, כגון oligomycin, מוריד את המקראות OCR וחושף את הנשימה תלויית ATP, או לקדם טיפול עם הנמכת A rotenone, antimycin OCR כדי לחשוף את צריכת החמצן שאינם מיטוכונדריאלי (5A איור ). נתונים אלה מדגים כי מעכבי אלה מסוגלים לחדור לרקמת המוח, והוא יכול לשמש כדי להשוות בין נשימה מיטוכונדריאלי במוח של משתנים אחרים. לפי זה וזמינותו, לערבב, לחכות, מדד פעמים אופטימציה על ידי התבוננות רמות החמצן, לא את קצב הצריכה, ולהבטיח כי לאחר ערבוב, רמת החמצן חזר לרמה לפני המדידה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig1.jpg"> איור 1: תיאור סכמטי של מידות OCR, ECAR המוח זחל במנתח מטבולית. הדיו מוכן יום לפני הפעלת וזמינותו. למחרת, תרופות נוספות ליציאות הזרקה של מיכל הדיו. המוח זחל melanogaster ד הם גזור, ריסון מיקרו-רקמות נוספות כדי לאבטח את המוח בתחתית הבאר. התא לצלחת עם המוח הוא לבדיקה במנתח מטבולית, ניתוח המידע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig2.jpg"> איור 2: מיקרו-רקמת ריסון אינם פעילים סמויה והחזק המוח בתוך תא בתחתית צלחת טוב. OCR (A) של המוח זחל ד אורגון-R melanogaster נמדד בבארות מצופה עם רקמת דבק (טבלה של חומרים), או כאשר המוח סופר מודבקות בתחתית הבאר. התוצאות הן לעומת אלה של המוח ממוקם בתחתית הבאר באמצעות מיקרו-רקמת ריסון. OCR (B) נמדד בבארות המכיל assay ומדיה מתכת, מתכת עם טבעת פולימר, כילות רשת פלסטיק, טבעת פולימר או מיקרו-רקמת ריסון. p-הערך < 0.05, * * p-הערך < 0.01, * * * p-הערך < 0.001, * * * p-הערך < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig3.jpg"> איור 3: אופטימיזציה של מדיה, זמן הדגירה, טמפרטורה. (א) OCR נמדד melanogaster אורגון-R ד הוסיף זחל המוח באמצעות מדיה שניידר (S2) עם נתרן פירובט, S2 עם גלוקוז, נתרן פירובט הוסיף, ואת וזמינותו מדיה עם גלוקוז ו נתרן פירובט הוסיף. OCR (B) נמדד במוח זחל לאחר 3 שעות של דגירה לפני וזמינותו, או לאחר 30 דקות של דגירה לפני וזמינותו. (ג) ה OCR נמדד במוח זחל-assay לרוץ טמפרטורות של 33 ° C ו 25 º C. נקודת הזמן השישי הוא בגרף. (ד) ה OCR נמדד במוח זחל לאחר 3 שעות של דגירה לפני וזמינותו, או לאחר 30 דקות של דגירה לפני וזמינותו. הנתונים הוא דיווח עבור נקודת בפעם השישית. p-הערך < 0.05, * * p-הערך < 0.01, * * * p-הערך < 0.001, * * * p-הערך < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig4.jpg"> איור 4: OCR ואת ECAR נמדדים reproducibly למבוגרים וגם מוח זחל melanogaster ד . OCR ה (א) נמדד במוח למבוגרים, זחל melanogaster אורגון-R ד במשך 30 דקות (B) OCR הנתונים של נקודת זמן השישי בלוח A הוא בגרף. זוהי נקודת זמן שבה OCR שהקריאות יתייצבו. (ג) ECAR נמדד במוח למבוגרים, זחל melanogaster ד במשך 30 דקות (D) ECAR הנתונים של נקודת זמן השישי בלוח זה בגרף. זוהי נקודת זמן שבה ECAR שהקריאות יתייצבו. p-הערך < 0.05, * * p-הערך < 0.01, * * * p-הערך < 0.001, * * * p-הערך < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig5.jpg"> איור 5: Oligomycin מוריד את רמות זחל המוח OCR melanogaster ד לחשוף תלויית ATP נשימה ולאחר rotenone/antimycin נוספים מוריד OCR כדי לחשוף את צריכת החמצן שאינם מיטוכונדריאלי. (א) ה OCR נמדד המוח זחל אורגון-RD. melanogaster לאחר טיפול עם 20 מיקרומטר oligomycin, 5 מיקרומטר rotenone/antimycin A תערובת. הפקד ועל איפוק בלבד בארות הוזרקו assay מדיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains at JoVE.com

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

מיפוי יישומים הביטוי Flippase Enhancer-מלכודת הזחל וגם למבוגרים תסיסנית CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

רכישת באיכות גבוהה וידאו דיגיטלי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Behaviors הזחל ומבוגרים מנקודת מבט רוחבי

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...