Name: measuring stolons and rhizomes of turfgrasses using a digital image analysis system
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
Duration: 6 min 2 s
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1. recogida de muestras de biomasa
<ol><li>Recoger muestras incluyendo la biomasa aérea y una capa de suelo con una profundidad adecuada dependiendo de la especie (para especies de césped, una profundidad de 15 cm es suficiente) para garantizar la recogida de estolones y rizomas. Nota: En general parcela debe considerarse antes de iniciar el estudio, ya que se tomarán muestras destructivas. En general, cuanto más tiempo esté el experimento llevado a cabo, cuanto mayor sea la parcela requerida.</li>
	<li>Compruebe las condiciones del suelo antes de la recogida de muestras: Si el suelo es demasiado seco, sobre todo en suelos pesados, puede ser difícil de recoger las muestras. En este caso, regar las parcelas antes para suavizar las capas de la muestra.</li>
	<li>Recoger las muestras usando un muestreador de base de suelo (≥ 8 cm de diámetro) o definir el área de superficie para recoger con un marco (≥ 10 x 10 cm) y recoger las muestras con una pala. Rotule cada muestra con cinta de laboratorio.</li>
	<li>Recoger varias muestras al azar por parcela, por lo que son representativas de la población de planta.</li>
	<li>Utilizar el mismo sampler para todo el experimento y registrar el área que representa cada muestra para calcular densidad de estolones y rizomas. Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, y las muestras pueden almacenarse en bolsas de plástico y conservadas a una temperatura inferior a-18 ° C.</li>
</ol>2. limpieza de la biomasa de muestras
<ol><li>Colocar la muestra en un tamiz grande de 0.5-1.5 aberturas mm dependiendo del tamaño de estolones o rizomas. Las aberturas deben ser lo suficientemente pequeñas para retener todos los estolones y rizomas, pero lo suficientemente grande como para permitir que las partículas del suelo a ser eliminado. Para suelos arenosos, dos tamices con distintas aberturas, colocadas uno encima del otro, pueden permitir mejor precisión y eficiencia.</li>
	<li>Limpiar las muestras con un chorro de agua con suficiente energía para eliminar las partículas del suelo sin dañar las plantas.</li>
	<li>Recuperar las muestras limpias y colocarlos en una bandeja con papel de cocina, teniendo cuidado de etiquetar las bandejas adecuadamente. Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, y las muestras pueden almacenarse en bolsas de plástico y conservadas a una temperatura inferior a-18 ° C.</li>
	<li>Más limpiar las muestras mediante la eliminación de las raíces y las hojas con unas tijeras. Durante este proceso, separar estolones y rizomas, si es necesario y registrar información adicional como el número de plantas, tallos y estolones por planta. Nota: Retirar todo el tejido raíz y hoja de estolones y rizomas mejorará la precisión. Las raíces finas son difíciles de quitar; sin embargo, a través del análisis de imagen digital, es posible omitir del análisis mediante una aplicación de software que excluye a órganos con un diámetro menor que un valor elegido (ver paso 5.1), que es definido con bastante precisión basado en observaciones de imágenes reproducido en la pantalla.</li>
	<li>Lugar de estolones y rizomas en papel etiquetan bolsas. Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, y las muestras pueden almacenarse en bolsas de plástico y conservadas a una temperatura inferior a-18 ° C.</li>
</ol>3. exploración y análisis de muestras de imágenes
<ol><li>Coloque la muestra en una bandeja plástica transparente del estándar WinRHIZO exploración equipo. Colocar manualmente los estolones y rizomas con unas pinzas de laboratorio para minimizar la superposición. Muestras grandes deba ser dividido en submuestras.</li>
	<li>No agregue agua a la bandeja (como se recomienda para las raíces), porque estolones y rizomas tienen suficiente rigidez para evitar la excesiva proximidad de órganos que pueden causar errores de lectura, que suele ocurre con raíces finas.</li>
	<li>Coloque la bandeja sobre la superficie del escáner.</li>
	<li>En el escáner y ejecutar el programa.</li>
	<li>Compruebe el dpi de la imagen en el menú imagen , comando parámetros de adquisición de imagen, de un posible control posterior en la imagen guardada.</li>
	<li>Compruebe umbral de análisis, comando raíz y distinción de fondo, para la buena clasificación de píxeles pertenecientes a los órganos explorados.</li>
	<li>Compruebe que la superficie de la bandeja entera se analizarán en el menú imagen , comando parámetros de adquisición de imagen.</li>
	<li>Ver clase diámetro muestran para la distribución de órganos por cada diámetro, en el área gráfico por encima de la imagen escaneada. Seleccionar 20 clases de igual ancho con intervalos de 0,1 mm haciendo clic en el eje horizontal del gráfico. Esta función permite la exclusión de datos pertenecientes a las raíces o pequeños órganos, cuando no se limpiaron perfectamente estolones o rizomas. La literatura reporta que las raíces de la mayoría de especies de césped tienen diámetros inferiores a 0,2 mm. Nota: El ancho y número de clases pueden modificarse teniendo en cuenta el diámetro medio de estolones y rizomas de las muestras analizadas y variabilidad alrededor de esta media. Un control debe ser realizado en algunas muestras para determinar el diámetro mínimo debe ser excluido.</li>
	<li>Ejecute la primera exploración muestra y compruebe que la edición permite un buen análisis.</li>
	<li>Siga las instrucciones del software para guardar la imagen y procesado de análisis. Etiqueta de la imagen y el análisis con la etiqueta de la muestra.</li>
	<li>Continuar con la exploración de todas las muestras. Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, y las muestras pueden almacenarse en bolsas de plástico y conservadas a una temperatura inferior a-18 ° C.</li>
</ol>4. medición de peso seco
<ol><li>Usando un exacto equilibrio electrónico, coloque las muestras digitalizadas en una charola de aluminio previamente tarado.</li>
	<li>Repita el paso 4.1 para todas las muestras digitalizadas.</li>
	<li>Inserte todas las muestras en un horno a 105 ° C y secar durante 24 horas.</li>
	<li>Retirar las muestras y espere hasta que se haya estabilizado el peso del tejido.</li>
	<li>Pesar de todas las muestras con su Tara.</li>
	<li>Restar la Tara del peso registrado para obtener el peso neto de cada muestra.</li>
</ol>5. corrección de datos y cálculo de la longitud y densidad
<ol><li>Corrección de la longitud y diámetro promedio<ol>
<li>Convertir el archivo de .txt resultante del análisis con WinRHIZO a un archivo .csv.</li>
		<li>Utilizar los resultados agrupados para las clases de diámetro para excluir datos de órganos inferiores a 0,2 mm (raíces, hojas, o rasguños en la bandeja).</li>
		<li>Para cada WinRHIZO leyendo suma (filas de archivo .txt) todas las longitudes registran para las clases de diámetro mayores de 0,2 mm. La longitud calculada con esta corrección es la longitud efectiva para más procesamiento de datos.</li>
		<li>Para cada lectura WinRHIZO, suma las áreas de proyección grabadas para diámetro clases más de 0,2 mm. La proporción entre la longitud y proyección del área da el diámetro promedio corregido para la exclusión de los órganos con un diámetro inferior a 0,2 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si la muestra se ha dividido en submuestras, la longitud final se calcula como la suma de todas las longitudes de submuestra y calcular el diámetro promedio final como la proporción entre la suma de todas las longitudes de submuestra y suma de todas las áreas de proyección de la submuestra.</li>
	<li>Cuando es necesario, calcular la densidad de longitud y peso por unidad de área superficial basado en el tamaño de la muestra.</li>
	<li>Utilizar los datos obtenidos para el análisis estadístico.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí fue desarrollado y evaluado para el estudio de los céspedes. Sin embargo, puede ser utilizado en un rango de especie estolonífera o rizomatosa con ajustes necesarios según sus características morfológicas, condiciones ambientales y limpieza de precisión de la muestra.
El diámetro medio estimado por medio de este Protocolo no puede ser comparado con el diámetro de entrenudo medido con un calibrador. El análisis de imagen digital incluye nodos y entrenudos en el cálculo del diámetro medio, que es la relación entre la superficie de proyección total y total longitud. Según lo discutido por Pornaro et al. 24, diámetro promedio obtenido para estolones de Bermuda con WinRHIZO sistema sobrevalorado diámetro promedio valores medidos con la pinza en el entrenudo. Estolón de diámetro se utiliza normalmente para describir el diámetro de los entrenudos de estolones y es un parámetro común utilizado para la descripción botánica18,25. Por esta razón, Pornaro et al. 24 señaló que diámetro medio estimado a través del sistema WinRHIZO y el diámetro medido manualmente entrenudo describir dos aspectos de morfología diferentes.
El tiempo necesario para llevar a cabo este protocolo sigue siendo un factor limitante para el análisis de rutina. La fase más desperdiciadora de tiempo es la limpieza de las muestras (paso 2.4). Basándonos en nuestra experiencia, limpieza de una muestra de césped con una gran cantidad de biomasa (es decir, 20 x 20 cm) requiere aproximadamente tres trabajadores de 2 a 4 horas. Como se describe en el protocolo, el proceso de limpieza es necesario para el sistema de análisis digital y al utilizar la pinza y la regla. Las muestras consisten en un número limitado de estolones/rizomas, el tiempo necesario para recopilar datos con los dos métodos es similar. Sin embargo, como se aumenta el tamaño de la muestra, el método basado en el software no tiene un tiempo posterior aumentan, como el único factor limitante es la superficie del escáner. Por el contrario, el tiempo necesario para medir los órganos con la regla y calibrador aumenta con el número de estolones o rizomas que componen la muestra.
El estudio de los rasgos de estolón y rizoma en los céspedes maduros siempre se ha basado en la medición de la longitud del entrenudo y diámetro y masa seca peso7,11,26,27. Debido al gran tiempo necesario para procesar las muestras y la disminución en la precisión con el aumento de tamaño de la muestra, mediciones manuales deben limitarse a un pequeño número de estolones o rizomas11,20,25. Como tal, sólo pueden ser convenientes para los experimentos de sola planta. La ventaja de un sistema de análisis de imagen sobre los métodos tradicionales es que lo que se puede medir la longitud de grandes estolones o rizomas muestras y calcular la densidad de longitud y peso específico (relación peso-longitud).
Este protocolo permite la medición de longitud de estolón y rizoma y cálculo de densidades de longitud de las muestras con gran biomasa (para que el rizoma o estolón peso es actualmente el único parámetro que se utiliza para la descripción de la morfología). Longitud de estolón y rizoma puede ser un parámetro importante en muchos estudios que no pueda ser estimado con las técnicas actuales. Estudios recientes sobre césped diferentes especies6 han demostrado que las densidades de peso y longitud de estolones no siempre correlacionan, indicando que pueden ser deseable para medir varios parámetros para evaluar adecuadamente el sistema de estolón y rizoma. Este método debe ser particularmente conveniente para cultivar o cultural gestión de prácticas de comparación.
Varios pasos en el protocolo son críticos para una estimación acertada de longitud y diámetro medio de estolones y rizomas. Debido a la alta variabilidad de la morfología de la planta bajo condiciones de ambiente diferente, el número de muestras (tamaño muestral) y de superficie dimensiones que deben ser muestrean (dimensión de la muestra) deben ser evaluados cuidadosamente y ser lo más representativas posible de la población con el fin de reducir la variabilidad de los datos. Por otra parte, limpieza de raíces y hojas de los estolones antes de análisis es el trabajo meticuloso que requiere especial atención para evitar sobrestimaciones. Por último, antes de procesamiento de imágenes, se recomienda seleccionar cuidadosamente la anchura de las clases y mínimo diámetro usando opciones de software para excluir todo lo que no es un estolón rizoma a partir del análisis. Cada experimento requiere la selección de un diámetro mínimo diámetro varía con la especie y condiciones ambientales, incluyendo las prácticas culturales.

El estudio de la morfología vegetal se trata en gran medida en todas las disciplinas de la ciencia de las plantas incluyendo la ecología, la agronomía, la biología y la fisiología. El sistema de raíces de la planta es ampliamente estudiado por su importancia en la tolerancia al estrés, estabilidad del suelo, crecimiento de las plantas y productividad. Estolones y rizomas son también ampliamente estudiados por su papel en las estrategias de propagación de planta, capacidad de recuperación y almacenamiento de hidratos de carbono. Estolones y rizomas son tallos modificados que crecen horizontalmente, ya sea por encima del suelo (estolones) o subterránea (rizomas). Estolones y rizomas también contienen nodos espaciados regularmente y entrenudos, así como nodos meristemos que son capaces de dar lugar a nuevas raíces y brotes de1. Ha habido un gran número de estudios sobre diferentes temas de investigación de las raíces, estolones y rizomas de varias plantas2,3,4,5,6,7, 8. Sistemas de raíces, estolones y rizomas de céspedes se estudian debido a su importancia en el turf calidad9, primavera green-up después de invierno de latencia10y tolerancia de desgaste y recuperación capacidad11. Además, estos órganos se estudian también en otros cultivos, céspedes como arroz12,4de soja y maíz13y pastizales donde tallos laterales juegan un papel clave en el suelo erosión control5.
Densidad de longitud de raíz (longitud de raíces por volumen de suelo) y diámetro medio comúnmente se miden utilizando análisis de software3,4,5,9,14,15, 16,17,18. Por el contrario, la longitud y diámetro de estolones o rizomas generalmente se miden con una regla y calibrador3,19,20 y requieren mucho tiempo y mano de obra21,22 , 23 , 24. por lo tanto, que se miden a menudo en un número restringido de estolones o rizomas11,20,25 y a menudo se limitan a la caracterización morfológica de plantas espaciadas solamente. El estudio de rasgos de estolón y rizoma en un dosel maduro implica una gran cantidad de biomasa de muestreo que generalmente sólo estolón y rizoma seco densidad (peso seco por unidad de superficie) son determinados7,11, 26 , 27. masa seca de estolones, de hecho, puede ser más fácilmente medibles de diámetro y longitud de estolón secando las muestras en un horno. Sin embargo, la longitud de estolón es una especie importante y carácter varietal que no está bien relacionado a masa seca. Un estudio reciente en arrastramiento de ballico perenne (Lolium perenne) demostró que las muestras con densidad de longitud de estolón alta no necesariamente tienen estolones alto peso densidad6.
Los sistemas de análisis de imagen hacen el análisis de las raíces más rápido28,29, más preciso y menos propensos a error humano30,21 que métodos tradicionales, manual31,32, 33. por otra parte, estos sistemas proporcionan gran flexibilidad y fácil de usar herramientas, incluyendo la luz, configuración óptica y la resolución, que a menudo están calibrados para cada escaneado imagen34. Pornaro et al. 24 demostró que el sistema WinRHIZO, un sistema de análisis de imagen diseñado específicamente para la medición de raíces lavadas, puede proporcionar un método alternativo para analizar rasgos de estolón y rizoma más completa que los métodos actuales de superación errores de medición causados por errores humanos. Para una descripción morfológica y la información cuantitativa sobre el crecimiento del estolón y rizoma, sistemas de análisis de imagen pueden utilizarse para analizar un gran número de muestras rápidamente, incluso con una gran cantidad de biomasa, lo que permite mayor precisión estadística. Por lo tanto, paquetes de software de análisis de raíz proporcionan un método alternativo, rápida y fiable para estudiar el crecimiento y la morfología de los estolones y rizomas de plantas diferentes especies24.
Presentamos un experimento llevado a cabo en el noreste de Italia para estudiar desarrollo de estolón y rizoma de cuatro cultivares de pasto Bermuda (Cynodon spp.). El estudio pretende incrementar el conocimiento sobre el desarrollo de estolones y rizomas en semillas ("LaPaloma" y "Yukon") y vegetativo ("Patriot" y "Bermuda") variedades de pasto Bermuda. El experimento se estableció en mayo de 2013, y se tomaron muestras de césped en tres muestreos por año, a partir de otoño de 2013 para el verano de 2015 [marzo (antes de la marcha verde), julio (estación de crecimiento completa) y octubre (antes de la dormancia invernal)]. Para la descripción y la explicación de este método, se utilizaron muestras recolectadas en el verano de la segunda temporada de crecimiento (julio de 2014), como la gran biomasa de las muestras en este momento la necesidad de un análisis rápido. WinRHIZO, una herramienta de software de análisis digital de imágenes específicamente diseñada para la medición de la raíz lavada, se usó para determinar la densidad de longitud de estolón y diámetro medio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>laboratory tape</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Tags may be used to label samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic bags</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any plastic bag can be used to keep samples until they have been cleened</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper bags</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any paper bag can be used to keep cleaned samples to avoid mold formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper towels</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>After samples have been washed with water and before to clean them with scissors it is helpful to put them on a paper towel to absorb water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any scissor with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminium box</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any aluminium box large enough to contain the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trays</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>It is helpful to use plastic tray to hold samples during the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sieve with 0.5-1.5 mm openings</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soil core sampler</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>We use core sampler for soil collection with diameter of at least 8 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>squared frame</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To collect large samples we use squared frame (10 x 10 cm, or 15 x 15 cm, or 20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spade</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>We use spade to pull out samples delimited with squared frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precision electronic balance</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any precision electronic balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory oven</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any laboratory oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinRHIZO software</td>
			<td>Regent Instruments Inc., Quebec</td>
			<td>NA</td>
			<td>Excluded the &#34;basic&#34; version</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinRHIZO scanner</td>
			<td>Regent Instruments Inc., Quebec</td>
			<td>NA</td>
			<td>WinRHIZO system includes a scanner calibrated for the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinRHIZO scanner accessories</td>
			<td>Regent Instruments Inc., Quebec</td>
			<td>NA</td>
			<td>WinRHIZO system includes accessories, as plastic tray and positioner, to be used with the scanner</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring stolons and rhizomes of turfgrasses using a digital image analysis system

Longitud y diámetro de estolones o rizomas generalmente se miden utilizando pinzas y reglas simples. Este procedimiento es lento y laborioso, así que a menudo es utilizado en un número limitado de estolones o rizomas. Por esta razón, estos rasgos están limitados en su uso para la caracterización morfológica de las plantas. El uso de tecnología de software de análisis de imagen digital puede superar errores de medición debido a errores humanos, que tienden a aumentar a medida que también aumentan el número y tamaño de las muestras. El protocolo puede ser utilizado para cualquier tipo de cultivo pero es particularmente conveniente para forraje o pastos, donde las plantas son pequeñas y numerosas. Muestras de césped consiste en biomasa aérea y una capa de tierra superior a la profundidad de desarrollo rizoma máximo, dependiendo de la especie de interés. En los estudios, las muestras se lavan del suelo y estolones/rizomas se limpian con la mano antes del análisis por software de análisis de imagen digital. Las muestras se secan aún más en un laboratorio de calefacción horno para medir peso seco; por lo tanto, para cada muestra, los datos resultantes son longitud total, peso seco total y diámetro medio. Imágenes escaneadas se pueden corregir antes de análisis excluyendo partes extrañas visibles, como las restantes raíces o las hojas que no se elimina con el proceso de limpieza. De hecho, estos fragmentos normalmente tienen diámetros mucho más pequeños que los estolones o rizomas, así que puede ser fácilmente excluidas del análisis fijando el diámetro mínimo por debajo del cual no se consideran objetos. Densidad de estolones o rizomas por unidad de área puede entonces calcularse basado en tamaño de la muestra. La ventaja de este método es rápida y eficiente medición de la longitud y el diámetro promedio de los números de muestra grande de estolones o rizomas.

Un experimento de campo fue fundado en otoño de 2013 para comparar el desarrollo de estolón y rizoma de cuatro cultivares de pasto Bermuda, incluyendo dos tipos de semillas ("LaPaloma" y "Yukon") y dos híbridos vegetativos estériles ("Patriot" y "Bermuda"). El diseño experimental fue bloques al azar con tres repeticiones, para un total de 12 parcelas (2 x 2 m).
Catorce estolones y catorce rizomas de cada variedad de césped-tipo y el Bermuda salvaje se colectaron al azar en las parcelas, así como de plantas de bermudagrass salvajes crecen cerca de las parcelas, para un total de 70 estolones y 70 rizomas. Todos los estolones y rizomas fueron limpiados como se describe en el protocolo (paso 2) antes de seguir la medición. Longitud y diámetro del entrenudo se midieron con una pinza y la regla, respectivamente, y se contó el número de nodos para cada estolón o rizoma. También se registraron los tiempos necesarios para limpiar y medir muestras de estolón y rizoma con la regla y calibrador. Diámetros de estolón y rizoma se calcularon como el medio de todos los diámetros de entrenudo medidos. Total estolón y rizoma total longitudes se calcularon como la suma de todas las longitudes de entrenudo. Además, total analizado longitudes y diámetros escaneados de cada estolón y rizoma se midieron usando un sistema de análisis digital de imágenes, como se describe en los pasos 3 y 5. Se registraron los tiempos necesarios para medir rasgos de estolón y rizoma por el sistema de análisis digital. Cada estolón y rizoma se cortan con tijera para separar los entrenudos de los nodos, y los entrenudos se utilizaron para estimar el diámetro del entrenudo analizado como se describe en los pasos 3 y 5. Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson de estolones y rizomas (n = 70 estolones, números = 70 rizomas) entre medida y escanear longitudes, medido y analizado diámetros, número de nodos y el valor absoluto de la diferencia entre la medida y diámetros escaneados y entrenudo escaneadas diámetros y diámetros medidos. La longitud medida con la regla se utilizaron para calibrar la longitud estimada a través del sistema de análisis de imagen digital.
El análisis de regresión indica una alta correlación entre longitud de estolón escaneado y longitud medida (Figura 1a), con una pendiente de 1.03 y la intercepción de-4.22, así como escaneado de Rizoma largo y longitud medida (Figura 1b), con un pendiente de 1.03 y la intercepción de 4.22. Limpieza a mano, 14 estolones y 14 rizomas toman un tiempo promedio de 21 min y 24 s y 11 min y 12 s, respectivamente. El tiempo promedio para medir longitud y el diámetro con una regla y un calibrador fue 14 min y 6 s por estolones y 13 min y 35 s de rizomas. El escaneo y el software de análisis de muestras usando WinRHIZO tuvo un promedio de 11 min de estolones y 12 min y 4 s de rizomas.
Medidas y diámetros escaneados se correlacionaron significativamente también en estolones y rizomas. Las relaciones entre diámetro medido y analizado eran cerca de 1:1, indicando un buen ajuste de los datos (Figura 2a y 2b). Sin embargo, la intercepción indicó que el sistema de análisis de imagen digital sobreestimado diámetro medido, especialmente para valores más bajos, y que los valores más altos de diámetro de rizoma fueron subestimados. Esta sobrevaluación puede deberse a los nodos de estolones que son analizados por el software, que afectan a la superficie total de la proyección que se utiliza para calcular el diámetro (relación entre la superficie de proyección total y total longitud) y en su lugar quedan excluidas las medidas sean hecho con la pinza. La correlación entre el número de nodos y diferencia entre diámetro los valores obtenidos por ambos métodos (medido y analizado) fue significativa sólo en estolones (figura 3a); Además, las variaciones en el número de nodos explicaron solamente una parte pequeña de la variación de esta diferencia (R2 = 14%). La correlación significativa entre escanear diámetro de entrenudo y mide el diámetro (laderas de 1.01 y 0.98 de estolones y rizomas, respectivamente; intercepta de casi cero) (figura 4a y 4b) demuestra eso diámetro de entrenudo pueden ser estimadas con precisión a través del sistema de análisis de imagen digital como se eliminan los nodos. Por lo tanto, Estolón total longitud y media de diámetro de muestras compuestas por numerosos estolones o rizomas puede fácil y precisa cuantificar utilizando el sistema de análisis de imagen digital.
Como parte de un experimento continuo, una muestra del césped (20 x 20 x 15 cm de profundidad) se recolectó en cada parcela según la temporada de otoño de 2013 a 2015 del verano y se manejó como se describe en el protocolo. La longitud de estolón y rizoma por unidad de área superficial (densidad de la longitud) y peso por unidad de área superficial (densidad) de las muestras tomadas en julio de 2014 se presentan en la figura 5. Diferencias en la densidad de longitud de estolón se observaron entre los cultivares vegetativa ("Patriot" y "Bermuda") y las semillas ("La Paloma" y "Yukon"). "Patriota" muestra la mayor densidad de longitud de rizoma, seguida de "Bermuda" y los cultivares sembrados. La densidad de peso del estolón fue diferente para todos los cultivares, con "Patriota" que muestra el mayor valor seguido de "Bermuda", "La Paloma" y "Yukon". Los cultivares vegetativa también muestran mayores densidades de peso del rizoma que los cultivares sembrados. El desarrollo de la longitud de estolón y rizoma por unidad de superficie (densidad de longitud) y peso por unidad de área superficial (densidad) de cultivar patriota durante el período de estudio se reportan en la figura 6. Densidad de longitud de estolón muestra un aumento de marzo de 2014 a julio de 2014, y no variaron desde julio de 2014 para julio de 2015. Sólo unos pocos rizomas fueron encontrados en las muestras recogidas en octubre de 2013 y marzo de 2014. Densidad de longitud de rizoma aumentó en julio de 2104, alcanzando sus valores más altos, pero disminuido otra vez en octubre de 2014. Densidad de peso del estolón aumentado ligeramente desde marzo a julio de 2014; sin embargo, más rápido se observó un aumento desde julio a octubre de 2014, con una posterior disminución en marzo de 2015. Densidad de peso de rizoma tuvo una tendencia similar a la densidad de longitud de rizoma, con su valor más alto en julio de 2014.
El software incluye en el análisis de todos los objetos de la imagen escaneada. Un ejemplo de un esquema de análisis de imagen digital de software WinRHIZO se presenta (figura 7), donde las líneas de diferentes colores superposición de objetos (estolones) de diferente diámetro para calcular la longitud total por clase de diámetro. Podemos observar que el análisis toma en fragmentos de la cuenta de las raíces o las hojas. Como se describe en el paso 3.9, es posible restringir el ancho y el número de clases de diámetro que se analizan. El histograma muestra la distribución de longitudes en las clases de diámetro seleccionado (figura 7). Este histograma puede utilizarse para evaluar las clases de diámetro mínimo debe ser excluido. Una observación visual de este gráfico en la parte superior de la pantalla de imagen destaca que la longitud tiene una distribución normal alrededor de un promedio significa clase de diámetro, con la excepción de las dos primeras clases que muestran valores más altos que ésos guarnición normal distribución. Aunque las muestras han sido limpiadas cuidadosamente incluyendo estas pequeñas clases, análisis de datos pueden afectar los resultados, densidad de longitud de sobreestimar y subestimar el diámetro promedio. Nuestros resultados muestran que la duración de las clases más pequeñas (diámetro < 0,2 mm) 13-32% de los valores de longitud de rizoma total resultante de lo software de análisis (tabla 1). Por otra parte, el diámetro medio fue subestimado de 2-17% (tabla 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig1.jpg"> Figura 1: Análisis de regresión de valores de longitud medidos con la regla contra los valores estimados con el sistema de análisis digital de imágenes de bermudagrass estolones24 (a) y) rizomas (b). La línea discontinua representa una proporción de 1:1. Panel A ha sido modificado desde Pornaro et al. 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig2.jpg"> Figura 2: Análisis de regresión de los valores de diámetro medido con la pinza de freno contra los valores estimados con el sistema de análisis digital de imágenes de bermudagrass estolones24 (a) y rizomas (b). La línea discontinua representa una proporción de 1:1. Panel A ha sido modificado desde Pornaro et al. 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig3.jpg"> Figura 3: Análisis de regresión del número de nodos de estolones de Bermuda24 (a) y rizomas (b) contra valores absolutos de la diferencia entre el diámetro estimado con el sistema de análisis de imagen digital y medido con el calibre. La línea discontinua representa una proporción de 1:1. Panel A ha sido modificado desde Pornaro et al. 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig4.jpg"> Figura 4: Análisis de regresión de los valores de diámetro medido con la pinza de freno contra los valores estimados con el sistema de análisis digital de imágenes de estolones de Bermuda24 (a) y rizomas (b) para los entrenudos solo. La línea discontinua representa una proporción de 1:1. Panel A ha sido modificado desde Pornaro et al. 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig5.jpg"> Figura 5: resultados de ejemplo de la longitud y peso densidad de estolones y rizomas de un ensayo de campo comparando cuatro cultivares de pasto Bermuda césped (patriota, Bermuda, La Paloma, Yukon). Estolón longitud densidad (a), rizoma longitud densidad (b), estolones peso densidad (c) y rizoma de peso densidad (d). Barras verticales representan el error estándar de seis repeticiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig6.jpg"> Figura 6: resultados de ejemplo de la longitud y peso densidad de estolones y rizomas de un ensayo de campo que muestra desarrollo de estolón y rizoma del cultivar de bermudagrass patriota. Estolón longitud densidad (a), rizoma longitud densidad (b), estolones peso densidad (c) y rizoma de peso densidad (d). Barras verticales representan el error estándar de seis repeticiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig7.jpg"> Figura 7: esquema de ejemplo de análisis de imagen digital de software WinRHIZO. La imagen escaneada en el primero plano y los gráficos de barras en la parte superior de la imagen de la pantalla muestran la distribución de la longitud en las clases de diámetro seleccionado. Las líneas de color indican el análisis de imagen, y cada color corresponde a los colores de las clases de diámetro en los gráficos de barras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Cultivar</td>
			<td rowspan="2">Bloquear</td>
			<td colspan="3">Longitud de rizoma (cm/dm2)</td>
			<td colspan="3">Diámetro promedio (mm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 0,2 mm</td>
			<td>total</td>
			<td>relación entreun</td>
			<td>< 0,2 mm</td>
			<td>total</td>
			<td>cocienteb</td>
		</tr>
<tr>
<td>Patriot</td>
			<td>1</td>
			<td>231</td>
			<td>278</td>
			<td>16.9</td>
			<td>1.637846</td>
			<td>1.5994</td>
			<td>97.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Patriot</td>
			<td>2</td>
			<td>70°</td>
			<td>349</td>
			<td>12.8</td>
			<td>1.620667</td>
			<td>1.588371</td>
			<td>98.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Patriot</td>
			<td>3</td>
			<td>70°</td>
			<td>366</td>
			<td>16.8</td>
			<td>1.649918</td>
			<td>1.621367</td>
			<td>98.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bermuda</td>
			<td>1</td>
			<td>184</td>
			<td>231</td>
			<td>20.6</td>
			<td>2.149745</td>
			<td>1.9951</td>
			<td>92.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bermuda</td>
			<td>2</td>
			<td>155</td>
			<td>193</td>
			<td>19.9</td>
			<td>1.866253</td>
			<td>1.76605</td>
			<td>94.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bermuda</td>
			<td>3</td>
			<td>119</td>
			<td>150</td>
			<td>20.9</td>
			<td>1.877386</td>
			<td>1.75865</td>
			<td>93.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>La Paloma</td>
			<td>1</td>
			<td>17</td>
			<td>23</td>
			<td>24.4</td>
			<td>2.139019</td>
			<td>1.8904</td>
			<td>88.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>La Paloma</td>
			<td>2</td>
			<td>26</td>
			<td>38</td>
			<td>31.6</td>
			<td>2.101385</td>
			<td>1.7455</td>
			<td>83.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>La Paloma</td>
			<td>3</td>
			<td>34</td>
			<td>47</td>
			<td>27.5</td>
			<td>2.033729</td>
			<td>1.7354</td>
			<td>85.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yukon</td>
			<td>1</td>
			<td>32</td>
			<td>44</td>
			<td>28.0</td>
			<td>1.700155</td>
			<td>1.4945</td>
			<td>87.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yukon</td>
			<td>2</td>
			<td>17</td>
			<td>25</td>
			<td>33.2</td>
			<td>1.68339</td>
			<td>1.4284</td>
			<td>84.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yukon</td>
			<td>3</td>
			<td>67</td>
			<td>87</td>
			<td>23.6</td>
			<td>1.844721</td>
			<td>1.6774</td>
			<td>90.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">
una longitud de clases ≤0. 2 mm total de longitud</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
b Total diámetro de clases ≤0. 2 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: densidad de longitud de rizoma y rizoma diámetro promedio con y sin clases más pequeñas del diámetro. Densidad de longitud con y sin incluir las clases de diámetro inferiores a 0,2 mm y sus relaciones (longitud de clases ≤ 0,2 total mm de longitud); y diámetro promedio con y sin incluir las clases de diámetro inferiores a 0,2 mm y su relación (diámetro incluyendo clases < 0,2 diámetro sin incluir diámetro clases < 0,2 mm).

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Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System

Un sistema de análisis de imágenes basada en software proporciona un método alternativo para estudiar la morfología de la especie estolonífera y rizomatosa. Este protocolo permite la medición de la longitud y diámetro de estolones y rizomas y puede aplicarse a muestras con una gran cantidad de biomasa y una gran variedad de especies.

Medición de estolones y rizomas de céspedes mediante un sistema de análisis de imagen Digital

Length and diameter of stolons or rhizomes are usually measured using simple rulers and calipers. This procedure is slow and laborious, so it is often ...

Este método puede responder preguntas clave en el crecimiento y morfología de estolones y rizomas de diferentes cultivos como pastos de césped, prados y pastos. La principal ventaja de esta técnica es que la longitud del estolón y del rizoma se puede medir en muestras con una gran cantidad de biomasa para las que el peso es el único parámetro utilizado actualmente. Recoger muestras utilizando un tomamuestras de núcleo de suelo.Incluya la biomasa del suelo y una capa de suelo con una profundidad adecuada, dependiendo de las especies para asegurar la recolección de estolones y rizomas. Alternativamente, defina el área de superficie para recoger con un marco y recoja las muestras con una pala. Etiquete cada muestra con cinta de laboratorio.Para limpiar las muestras de biomasa, coloque la muestra en un tamiz grande con aberturas de 0,5 a 1,5 milímetros, dependiendo del tamaño de estolón o rizoma. Las aberturas deben ser lo suficientemente pequeñas como para retener todos los estolones y rizomas, pero lo suficientemente grandes como para permitir que las partículas del suelo sean eliminadas. Limpie las muestras con una corriente de agua con suficiente potencia para eliminar las partículas del suelo sin dañar las plantas.Recuperar las muestras limpias y colocarlas en una bandeja con toallas de papel, teniendo cuidado de etiquetar las bandejas adecuadamente. Limpie aún más las muestras eliminando raíces y hojas con tijeras. Durante este proceso, separe los estolones y rizomas si es necesario y registre información adicional, como el número de plantas, labradores y estolones por planta.Coloque los estolones y rizomas en bolsas con etiquetas en papel. Coloque la muestra en una bandeja de plástico transparente del equipo de escaneo estándar WinRHIZO. Coloque manualmente los estolones y rizomas utilizando fórceps de laboratorio para minimizar la superposición.Es posible que sea necesario dividir muestras grandes en subsondas. Coloque la bandeja en la superficie del escáner, luego encienda el escáner y comience a ejecutar el programa. Para un mayor control en una imagen guardada, compruebe el ppp de la imagen en el menú Imagen selección del comando Parámetro de adquisición de imagen.Para una buena clasificación de los píxeles que pertenecen a los órganos escaneados, compruebe el umbral y el análisis seleccionando el comando Distinción de fondo raíz. Compruebe que toda la superficie de la bandeja se escaneará en el menú Imagen seleccionando el comando Parámetro de adquisición de imagen. Ahora, compruebe la clase de diámetro mostrada para la distribución de órganos por diámetro en el área gráfica por encima de la imagen escaneada.Seleccione 20 clases de ancho igual con intervalos de 0,1 milímetros haciendo clic en el acceso horizontal del gráfico. Esta función permite la exclusión de datos pertenecientes a raíces u órganos pequeños cuando los estolones o rizomas no se limpiaban perfectamente. La literatura informa que la mayoría de las raíces de las especies de césped tienen un diámetro inferior a 0,2 milímetros.Ejecute el primer análisis de muestra y compruebe que la edición permite un buen análisis. Siga las instrucciones del software para guardar la imagen. Por último, procese el análisis siguiente de la opción de software y etiquete la imagen y el análisis con la etiqueta de muestra.Continúe con el escaneo de todas las muestras. Para realizar la medición del peso seco, coloque las muestras escaneadas en una bandeja de aluminio tarado en un balance electrónico preciso y registre su tara. Repita este paso para todas las muestras escaneadas.Inserte todas las muestras en un conjunto a menudo a 105 grados Celsius y séquelos durante 24 horas. Al día siguiente, retire las muestras y espere hasta que el peso del tejido se haya estabilizado. Luego, pesa todas las muestras con su tara.Restar la tara del peso registrado para obtener el peso neto de cada muestra. Ejemplo de resultados de un ensayo de campo que compara la densidad de longitud de estolón y rizoma de cuatro cultivares de hierba de Bermudas tipo césped. Hay una diferencia significativa en la densidad de longitud de estololon entre los cultivares vegetativos Patriot y Tifway, y los cultivares de semillas La Paloma y Yukon en muestras recogidas en julio de 2014.Para los rizomas, Patriot muestra la densidad de longitud más alta, seguido de Tifway, y los cultivares de semillas. El desarrollo de la densidad de longitud de estololon de cultivar Patriot a lo largo del período de estudio muestra un aumento de marzo de 2014 a julio de 2014 y no variaba de julio de 2014 a julio de 2015. Pocos rizomas fueron encontrados en muestras recogidas en octubre de 2013 y marzo de 2014.La densidad de la longitud del rizoma aumenta en julio de 2014, alcanzando los valores más altos. Pero vuelve a disminuir en octubre de 2014. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar muestras representativas, limpiar meticulosamente estolones y rizomas antes del análisis, y seleccionar el ancho de las clases de diámetro utilizando opciones de software para incluir sólo estolones y rizomas en el análisis.

Research

JoVE Journal

Environment

Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Análisis de contenido de ácido graso y Composición en microalgas

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

Investigación

Medio ambiente

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

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El uso de Chironomidae (Diptera) en superficie flotante pupal Exuviae como Protocolo Bioassessment rápida para las Masas de Agua

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Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

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La medición de contaminantes mineralización de base de carbono utilizando combinada CO<sub&gt; 2</sub&gt; flujo y análisis de radiocarbono

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A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

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Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

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Modificación y aplicación de un soplador de hojas-vac de campo Muestreo de artrópodos

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

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Nitrogen oxides (NOx = NO + NO2) are a family of atmospheric trace gases that have great impact on the environment. NOx concentrations directly influence ...

Image-based Lagrangian Particle Tracking in Bed-load Experiments

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On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

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Measuring the Flight Ability of the Ambrosia Beetle, Platypus Quercivorus (Murayama), Using a Low-Cost, Small, and Easily Constructed Flight Mill

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Medición de la capacidad de vuelo del escarabajo de ambrosía, Platypus Quercivorus (Murayama), con un bajo costo, pequeño y vuelo fácilmente construido molino

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