Name: preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

تم تمويل هذا المشروع من جامعة النرويج لعلوم الحياة ومجلس البحوث في النرويج، رقم المنحة 243811 و 244461 (برنامج تربية الأحياء المائية). ونحن ممتنون للورد كاريون تان في جامعة النرويج لعلوم الحياة لصيانة المرفق الأسماك.

ووافقت جامعة النرويج لعلوم الحياة، والمبادئ التوجيهية التالية للعناية والرعاية لأبحاث الحيوانات التجارب على الحيوانات في هذه الدراسة.
1-إعداد الحلول
<ol><li>معايرة أدوات متر أوسموميتير والحموضة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لضمان صحة القياسات.</li>
	<li>
إعداد 500 مل من Ca2 +...

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Ribeiro, L. P., Ahne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cell+culture:+initiation+of+a+line+of+pituitary+cells+from+carp+(Cyprinus+carpio)+to+study+the+release+of+gonadotropin+in+vitro.">Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro.</a> In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).</li><li>Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+pituitary+cells+of+carp+(Cyprinus+carpio)+for+the+study+of+gonadotropin+release.">Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release.</a> In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).</li><li>Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+inhibits+(d-Arg6,+Pro9-NEt)+salmon+gonadotropin-releasing+hormone-+and+dopamine+D1-stimulated+growth+hormone+release+from+perifused+pituitary+cells+of+chinese+grass+carp,+Ctenopharyngodon+idellus.">Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus.</a> General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).</li><li>Chang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+pituitary+cell+dispersion+method+and+primary+culture+system+for+the+studies+of+gonadotropin-releasing+hormone+action+in+the+goldfish,+Carassius+auratus.+I.+Initial+morphological,+static,+and+cell+column+perifusion+studies.">Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies.</a> General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).</li><li>Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pituitary+cells+in+primary+culture+to+study+the+secretion+in+rainbow-trout+-+Setting+up+and+validating+the+system+as+assessed+by+its+responsiveness+to+mammalian+and+salmon+gonadotropin-releasing+hormone.">Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone.</a> General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).</li><li>Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+dispersed+pituitary+cells+from+estradiol-pretreated+female+silver+eels+(Anguilla+anguilla+L):+Immunocytochemical+characterization+of+gonadotropic+cells+and+stimulation+of+gonadotropin+release.">Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release.</a> General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).</li><li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells.">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li><li>Lin, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+gonadotropins+(FSH+and+LH)+and+growth+hormone+(GH)+by+neuroendocrine,+endocrine,+and+paracrine+factors+in+the+zebrafish-An+in+vitro+approach.">Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach.</a> General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO2,+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH.</a> General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+-+a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka - a model organism from the far East.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).</li><li>Matsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMY+is+a+Y-specific+DM-domain+gene+required+for+male+development+in+the+medaka+fish.">DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish.</a> Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).</li><li>Kasahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medaka+draft+genome+and+insights+into+vertebrate+genome+evolution.">The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution.</a> Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Letters. 2 (12), (2016).</li><li>Waymouth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolality+of+mammalian+blood+and+of+media+for+culture+of+mammalian+cells.">Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells.</a> In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).</li><li>Cameron, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis+-+past+and+present+perspectives.">Acid-base homeostasis - past and present perspectives.</a> Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).</li><li>Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+regulation+in+fishes:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).</li><li>Perry, S. F., Tufts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish respiration. , (1998).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+&#946;-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone &#946;-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Strandab&#248;, R. A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+volume+regulation+in+response+to+changes+in+osmolality.">Brain volume regulation in response to changes in osmolality.</a> Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).</li></ol>

في المختبر خلية ثقافة أنظمة توفر أدوات قوية للباحثين للإجابة على عدد كبير أسئلة البيولوجية المختلفة إذا ما استخدمت ب الطريقة الصحيحة1. من المهم أن نتذكر أن ينتابها الخلايا التي فقدوا صلاتهم بالخلايا المجاورة قد حصلوا على خصائص وظيفية مختلفة مما كانت أصلاً في فيفو. ل...

ثقافة الخلية واحدة من الأدوات الرئيسية المستخدمة في البحوث البيولوجية الجزيئية، وتوفير نظام نموذجا ممتازا للإجابة على أسئلة بيولوجية مختلفة تتراوح بين الفيزيولوجيا الخلوية العادية ل الفحص والتسرطن المخدرات1. غالباً ما تعتبر الخلايا الأولية، معزولة مباشرة من الأنسجة الحيوانية باستخدام أساليب الانزيمية و/أو الميكانيكية، بيولوجيا أكثر أهمية من خطوط الخلايا الاستجابة البيولوجية قد تكون أقرب إلى الحالة في فيفو . ينبغي أن يكون الأمثل بروتوكولات من أجل إعداد الثقافات الخلية الأولية لكل نوع خلية والأنواع ذات الاهتمام من أجل محاكاة الخصائص التي خلية تكييف والحصول على نتائج مفيدة من الناحية الفسيولوجية.
بروتوكولات عديدة توضح شروط الثقافة نظم خلايا الثدييات، بينما بروتوكولات مماثلة تصف ظروف الثقافة الأولية للخلايا الأسماك شحيحة بل في المقارنة. الخلايا عرضه للتغيرات السريعة في درجة الحرارة ودرجة الحموضة وأوسمولاليتي، وهشة لا سيما أثناء إجراء الانفصال. حلول الملح التجاري وثقافة وسائل الإعلام المستخدمة لخلايا الثدييات الثقافات ليست الأمثل للأسماك تيليوست، لا سيما من حيث درجة الحموضة العازلة نظام كفؤ و osmolality. ولذلك، من المهم لقياس وضبط الحلول إلى المستويات ذات الصلة الفيزيولوجية لهذه المعلمات في الأنواع ذات الأهمية.
الثقافات الغدة النخامية الأولية قد بذلت من العديد من أنواع الأسماك تيليوست، بما في ذلك الكارب العادي () (Cyprinus carpio)2،3، عشب الكارب (idella كارب)4ذهبية (الذهبي Carassius )5، تراوت قوس قزح (Oncorhynchus mykiss)6, ثعبان (أنغيلا أنغيلا)7، البلطي (Oreochromis mossambicus)8،9من الزرد (دانيو rerio)، و سمك القد الأطلسي (جادوس مروة)10. وبصرف النظر عن ضبط درجة حرارة الحضانة لهذه أنواع الفوائد، العديد من هذه البروتوكولات قد المحتضنة الخلايا في ظروف شبيهة بالثدييات التي قد تكون دون المستوى الأمثل لهذا نوع الاهتمام، مع درجة حموضة من 7.2 إلى 7.5 في جو هوميديفيد تحتوي على 3-5% CO2. وبالإضافة إلى ذلك، أنها غير واضحة إذا عدلت osmolality الحلول المستخدمة في إعداد العديد من هذه الثقافات الخلية الأولية ومستقرة بين حلول مختلفة.
البروتوكول الحالي يستند إلى العمل السابق مع الثقافات الأولية من سمك القد الأطلسي10 ويشمل تعديلات لدرجة حرارة الحضانة و osmolality ودرجة الحموضة والحموضة العازلة النظم، بما في ذلك الضغط الجزئي لثاني أكسيد الكربون (pCO2)، إلى فسيولوجيا الميداكا (O. latipes). الميداكا من أسماك المياه العذبة صغيرة (3-4 سم) أصلي إلى شرق آسيا. في هذه الأيام، يتم استخدامه كأنواع نموذجية في العديد من المختبرات البحثية العالم، كما أنه من السهل نسبيا لتربية ومقاومة عالية للعديد من الأمراض السمكية المشتركة11. هناك العديد من المزايا لاستخدام الميداكا كنموذج، بما في ذلك تسامح درجة حرارة من 4 – 40 درجة مئوية11، وقت قصير الجيل، الأجنة شفافة، تحديد الجنس الجيني12، و تسلسل الجينوم13، كذلك العديد من الآخرين الموارد الجينية المتاحة.
شروط الثقافة الأولية في هذا البروتوكول هي الأمثل لتتناسب مع درجة الحرارة 26 درجة مئوية في إبقاء في ميداكاس في مرفق الأسماك. علاوة على ذلك، osmolality خفضت من موسم 320/كغ من سمك القد الأطلسي التي تعيش في المياه المالحة لموسم 290/كغ بالنسبة الميداكا التي تعيش في المياه العذبة وهو وفقا osmolality العادي الميداكا البلازما14. وبالمقارنة، osmolality نموذجية للبلازما الثدييات في النطاق من 275-295 موسم15. الأسماك يعيش في مجموعة متنوعة من درجات الحرارة والخياشيم التي على اتصال مباشر مع الماء، مما يجعل قدرة على درجة الحموضة والمخزن المؤقت للدم والسوائل خارج الخلية في الأسماك مختلفة عن تلك الموجودة في الثدييات. عادة ما تتضمن الثدييات ثقافة الإعلام نظم المخزن المؤقت الذي ينتج الرقم الهيدروجيني من حوالي 7.4 عند وسائل الإعلام هي اكويليبراتيد إلى جو قياسية من 5% CO2 في الهواء هوميديفيد عند 37 درجة مئوية. هو الرقم الهيدروجيني درجة الحرارة تعتمد والقيمة من أجل زيادة الأس الهيدروجيني المحايدة (في المياه) مع انخفاض درجة حرارة16. الأسماك تيليوست نموذجي البلازما pH يتراوح من 7.7 إلى 7.917. وشملت الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول الحد من درجة الحموضة 7.85 لسمك القد أبقى على 12 درجة مئوية إلى درجة الحموضة 7.75 الميداكا أبقى على 26 درجة مئوية بزيادة أول أكسيد الكربون2 من 0.5% إلى 1%.
وباﻹضافة إلى ذلك، سعة المخزن المؤقت بيكربونات يختلف تماما في الأسماك والثدييات. CO2 يتم تبادلها بسهولة عبر الخياشيم في الأسماك و pCO2 في الماء سوى جزء صغير من pCO2 في الرئة18. تغيير درجة الحرارة أو pCO2 سيقوم بتغيير درجة الحموضة والمخزن المؤقت من المتوسط. ونتيجة لذلك، درجة الحموضة ولا pCO2 وأوصت تفرخ خلايا الثدييات الأمثل لخلايا الأسماك، وذلك، ينبغي أن يكون الأمثل وسائل الإعلام الثقافة مع نظم المخزن المؤقت الذي يحتوي على القيم ذات الصلة الناحية الفسيولوجية للأسماك نوع معين من الفائدة. هذا البروتوكول توضح كيفية إعداد الثقافات الخلية الأولية من بيتويتاريس الميداكا وتشمل التعديلات حضانة osmolality ودرجة الحموضة، درجة الحرارة ودرجة الحموضة المخزن المؤقت للنظام، بالإضافة إلى المعلمات الأخرى الهامة في الاعتبار عند إعداد الخلية الابتدائية الثقافات من الأنواع غير الثدييات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>L5520</td>
			<td>Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &#181;m PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5761</td>
			<td>10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>63565</td>
			<td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>G5400</td>
			<td>4.5 mM&#160; D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 &#181;g/ml Streptomycin).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin type II-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T7409</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 &#181;g/ml Dnase I (see details below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D5025</td>
			<td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY)</td>
			<td>431097</td>
			<td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-10-C</td>
			<td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Straigt tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Angled 45&#176; tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>Use for dissection of pituitaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alegra X-22R Centrufuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td>
			<td></td>
			<td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Techne (Staffordshire, UK)</td>
			<td></td>
			<td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur glass pipettes</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>612-1701</td>
			<td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>521-2844</td>
			<td>Any small table centrigue will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine needles / insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>26001-40</td>
			<td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

ثقافة الخلية الأولية أداة قوية تستخدم عادة من قبل العلماء لدراسة الخصائص الخلوية والآليات للخلايا المعزولة في بيئة تسيطر عليها. على الرغم من الاختلافات الشاسعة في الفسيولوجيا بين الثدييات والأسماك، بروتوكولات الثقافة الخلية الأولية من الأسماك كثيرا ما تستند إلى ظروف الثقافة الثدييات، غالباً مع تعديلات طفيفة فقط. الاختلافات البيئية تؤثر على درجة حرارة الجسم، ليس فقط، بل أيضا المعلمات مصل الدم مثل أوسمولاليتي ودرجة الحموضة pH سعة المخزن المؤقت. كما خلية ثقافة الإعلام وحلول العمل مماثلة تهدف إلى تقليد خصائص السوائل خارج الخلية و/أو مصل الدم الذي خلية تكييفها، من الأهمية بمكان أن يتم ضبط هذه المعلمات على وجه التحديد للحيوان في السؤال.
البروتوكول الحالي توضح شروط الثقافة الأولية الأمثل الميداكا (Oryzias latipes). البروتوكول يوفر خطوات تفصيلية حول كيفية عزل والحفاظ على صحة فصل خلايا الغدة النخامية لأكثر من أسبوع، ويتضمن الخطوات التالية: 1. تعديل osmolality إلى القيم الموجودة في بلازما الدم الميداكا، 2. التعديل درجة حرارة الحضانة إلى درجة الحرارة العادية الميداكا (هنا في المرفق الحوض)، و 3. تعديل درجة الحموضة وبيكربونات المخزن المؤقت إلى قيم قابلة للمقارنة بالأنواع الأخرى من الأسماك تعيش في درجات حرارة مماثلة. النتائج المعروضة باستخدام بروتوكول وصف تعزيز نتائج مجدية من الناحية الفسيولوجية الميداكا، ويمكن أن يستخدمها العلماء مما يجعل الثقافات الخلية الأولية من الأنواع غير الثدييات الأخرى كدليل مرجعي.

وصف إعداد ثقافة الخلية الأولية من بيتويتاريس الميداكا هذا البروتوكول وتوفير الخلايا السليمة التي يمكن الحفاظ على ثقافة لمدة أسبوع واحد على الأقل. البروتوكول يستند إلى القيم ذات الصلة الفسيولوجية الميداكا14 وهو الأمثل بالإضافة إلى ذلك إلى أنسجة الغدة النخا?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

هنا يمكننا وصف بروتوكول لإعداد والحفاظ على ثقافات خلايا الغدة النخامية الأولية من الميداكا (Oryzias latipes). الشروط الأمثل في هذا البروتوكول تراعي المعالم الهامة مثل درجة الحرارة، أوسمولاليتي، ودرجة الحموضة عن طريق محاكاة الظروف الفسيولوجية للأسماك، مما يمكن من نتائج أكثر جدوى من الناحية الفسيولوجية.

إعداد ثقافة الخلية الأولية عالية الجودة من الأسماك بيتويتاريس

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

شراء عالية الجودة الفيديو الرقمية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; السلوكيات اليرقات والكبار من منظور الجانبي

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

منخفض الكثافة الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

بروتوكول غير القابل للصدأ لعزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من الليزر التقاط خلايا ميكروديسيكتيد بوركنجي في المخيخ تشريح الإنسان

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

الخلايا الاساسيه الثقافة المنقية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاميجيك أنشئت من خلال الفرز الخلية المنشطة الفلورية

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...