Name: preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

Dit project werd gefinancierd door de Noorse Universiteit van levenswetenschappen en de Raad onderzoek van Noorwegen, subsidie aantal 243811 en 244461 (aquacultuur programma). We zijn dankbaar Lourdes Carreon Tan aan de Noorse Universiteit van levenswetenschappen voor het behoud van de vis-faciliteit.

De dierproeven uitgevoerd in deze studie werden goedgekeurd door de Noorse Universiteit van levenswetenschappen, volgende richtlijnen voor de zorg en het welzijn van dieren voor onderzoek.
1. bereiding van de oplossingen
<ol><li>Kalibreren van de osmometer en pH meter instrumenten volgens de instructies van de fabrikant om de juiste metingen.</li>
	<li>
Bereiden van 500 mL van Ca2 +- en Mg2 +-gratis Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (dPBS), 7,75 (sta...

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Ribeiro, L. P., Ahne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cell+culture:+initiation+of+a+line+of+pituitary+cells+from+carp+(Cyprinus+carpio)+to+study+the+release+of+gonadotropin+in+vitro.">Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro.</a> In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).</li><li>Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+pituitary+cells+of+carp+(Cyprinus+carpio)+for+the+study+of+gonadotropin+release.">Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release.</a> In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).</li><li>Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+inhibits+(d-Arg6,+Pro9-NEt)+salmon+gonadotropin-releasing+hormone-+and+dopamine+D1-stimulated+growth+hormone+release+from+perifused+pituitary+cells+of+chinese+grass+carp,+Ctenopharyngodon+idellus.">Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus.</a> General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).</li><li>Chang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+pituitary+cell+dispersion+method+and+primary+culture+system+for+the+studies+of+gonadotropin-releasing+hormone+action+in+the+goldfish,+Carassius+auratus.+I.+Initial+morphological,+static,+and+cell+column+perifusion+studies.">Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies.</a> General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).</li><li>Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pituitary+cells+in+primary+culture+to+study+the+secretion+in+rainbow-trout+-+Setting+up+and+validating+the+system+as+assessed+by+its+responsiveness+to+mammalian+and+salmon+gonadotropin-releasing+hormone.">Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone.</a> General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).</li><li>Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+dispersed+pituitary+cells+from+estradiol-pretreated+female+silver+eels+(Anguilla+anguilla+L):+Immunocytochemical+characterization+of+gonadotropic+cells+and+stimulation+of+gonadotropin+release.">Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release.</a> General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).</li><li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells.">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li><li>Lin, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+gonadotropins+(FSH+and+LH)+and+growth+hormone+(GH)+by+neuroendocrine,+endocrine,+and+paracrine+factors+in+the+zebrafish-An+in+vitro+approach.">Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach.</a> General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO2,+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH.</a> General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+-+a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka - a model organism from the far East.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).</li><li>Matsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMY+is+a+Y-specific+DM-domain+gene+required+for+male+development+in+the+medaka+fish.">DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish.</a> Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).</li><li>Kasahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medaka+draft+genome+and+insights+into+vertebrate+genome+evolution.">The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution.</a> Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Letters. 2 (12), (2016).</li><li>Waymouth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolality+of+mammalian+blood+and+of+media+for+culture+of+mammalian+cells.">Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells.</a> In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).</li><li>Cameron, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis+-+past+and+present+perspectives.">Acid-base homeostasis - past and present perspectives.</a> Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).</li><li>Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+regulation+in+fishes:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).</li><li>Perry, S. F., Tufts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish respiration. , (1998).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+&#946;-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone &#946;-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Strandab&#248;, R. A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+volume+regulation+in+response+to+changes+in+osmolality.">Brain volume regulation in response to changes in osmolality.</a> Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).</li></ol>

In vitro cel cultuur systemen bieden krachtige hulpmiddelen voor onderzoekers een overvloed aan verschillende biologische vragen beantwoorden als gebruikt in de juiste manier1. Het is belangrijk te onthouden dat gedissocieerde cellen die verloren hun verbindingen met de naburige cellen hebben verschillende functionele eigenschappen verkregen wellicht dan ze oorspronkelijk had in vivo. Om te voorkomen dat gevaar voor verkeerde uitleg van de resultaten uit in vitro experim...

Cultuur van de cel is één van de belangrijkste instrumenten in moleculair biologisch onderzoek, biedt een uitstekende modelsysteem voor het beantwoorden van verschillende biologische vragen variërend van normale cellulaire fysiologie tot drug screening en carcinogenese1gebruikt. Primaire cellen, rechtstreeks van het dierlijk weefsel met behulp van enzymatische en/of mechanische methoden, geïsoleerd worden vaak beschouwd als een meer biologisch relevant dan cellijnen als de biologische reactie dichter bij de in vivo situatie worden kan. Protocollen voor het voorbereiden van primaire celculturen moeten worden geoptimaliseerd voor elk soort en cel type van belang om te bootsen de kenmerken waarnaar een cel aangepast is en fysiologisch zinvolle resultaten te verkrijgen.
Talrijke protocollen beschrijven kweekomstandigheden voor zoogdiercellen systemen, terwijl soortgelijke protocollen beschrijven van primaire kweekomstandigheden voor vis cellen eerder schaars in vergelijking zijn. Cellen zijn gevoelig voor snelle veranderingen in de temperatuur, pH en de osmolaliteit, en zijn vooral kwetsbaar tijdens de procedure dissociatie. Commerciële zoutoplossingen en Kweekmedia gebruikt voor zoogdieren celculturen zijn niet optimaal voor teleost vis, met name wat betreft de pH buffer systemen en de osmolaliteit. Het is daarom belangrijk om te meten en aanpassen van de oplossingen voor fysiologisch relevante niveaus van deze parameters in de soorten van belang.
Primaire hypofyse culturen zijn gemaakt van verschillende vissoorten van de teleost, met inbegrip van de karper (Cyprinus carpio)2,3, gras carp (Ctenopharyngodon idella)4, goudvis (Carassius auratus )5, regenboogforel (Oncorhynchus mykiss)6, Europese aal (Anguilla anguilla)7, tilapia (Labeo fimbriatus)8, zebravissen (Danio rerio)9, en Kabeljauw (Gadus morhua)10. Afgezien van het aanpassen van de incubatietemperatuur tot de soorten van belang, hebben verscheidene van deze protocollen de cellen bij zoogdieren-achtige omstandigheden die voor de soorten van belang, met een pH van 7,2 tot 7,5 in een bevochtigde sfeer suboptimaal zijn kunnen geïncubeerd. met 3-5% CO2. Bovendien is het onduidelijk of de osmolaliteit van oplossingen gebruikt voor het voorbereiden van verscheidene van deze primaire celculturen werden aangepast en stabiel tussen verschillende oplossingen.
Het huidige protocol is gebaseerd op eerdere werk met primaire culturen van kabeljauw10 en omvat aanpassingen van incubatietemperatuur, osmolaliteit, pH en pH buffer systemen, met inbegrip van de gedeeltelijke druk van kooldioxide (pCO2), om te de Fysiologie van medaka (O. latipes). Medaka is een zoetwatervis van kleine (3-4 cm), inheems in Oost-Azië. Deze dagen, wordt het gebruikt als een soort model in veel onderzoekslaboratoria over de hele wereld, want het is relatief eenvoudig te kweken en zeer resistent tegen veel voorkomende vis ziekten11. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van medaka als een model, met inbegrip van een temperatuur tolerantie van 4 – 40 ° C11, een korte generatietijd, transparante embryo's, een seks-bepalen gene12, en een gesequenceerd genoom13, evenals veel andere beschikbare genetische hulpbronnen.
De primaire kweekomstandigheden in dit protocol worden geoptimaliseerd zodat deze overeenkomen met de temperatuur van 26 ° C die medakas worden bewaard in de vis-faciliteit. Verder is de osmolaliteit wordt teruggebracht van 320 mOsm/kg van kabeljauw leeft in zout water tot 290 mOsm/kg voor medaka leven in zoet water en is in overeenstemming met de normale osmolaliteit van medaka plasma14. In vergelijking is de typische osmolaliteit van zoogdieren plasma in het bereik van 275-295 mOsm15. Vissen leven in een verscheidenheid van temperaturen en hebben kieuwen die in direct contact met water, waardoor de pH en buffer capaciteit van het bloed en het extracellulaire vloeistof in vis afwijken bij zoogdieren. Zoogdieren voedingsbodems bestaan meestal uit buffer-systemen die leiden tot een pH van ongeveer 7.4 wanneer de media zijn geëquilibreerd aan een standaard sfeer van 5% CO2 in bevochtigde lucht bij 37 ° C. De pH is afhankelijk van temperatuur en de waarde voor de verhoging van de neutrale pH (in water) met een dalende temperatuur-16. Typisch teleost vis plasma pH varieert van 7,7 7,917. De optimalisering van dit protocol opgenomen een reductie van pH 7.85 voor kabeljauw bij 12 ° C tot pH 7,75 voor medaka gehouden bij 26 ° C door het verhogen van de CO-2 van 0,5% tot 1% beperkt.
Daarnaast is de buffercapaciteit van bicarbonaat heel anders in vissen en zoogdieren. CO2 gemakkelijk worden verzonden via de kieuwen in vis en de pCO2 in water is slechts een klein deel van de pCO2 in de Long-18. De temperatuur of de pCO2 wijzigt, de pH en de buffer van het medium. Noch de pCO2 aanbevolen voor het broeden van zoogdiercellen als de pH dus optimaal voor vis cellen, en daarom moet de voedingsbodems worden geoptimaliseerd met buffer systemen met fysiologisch relevante waarden voor vis en de bepaalde soorten van belang. Dit protocol beschrijft hoe te bereiden van primaire celculturen van medaka pituitaries en omvatten aanpassingen van de incubatie temperatuur, osmolaliteit, pH en pH buffersysteem, naast andere belangrijke parameters te overwegen bij de voorbereiding van de oplaadbare batterij bij niet-zoogdieren soorten culturen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>L5520</td>
			<td>Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &#181;m PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5761</td>
			<td>10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>63565</td>
			<td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>G5400</td>
			<td>4.5 mM&#160; D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 &#181;g/ml Streptomycin).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin type II-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T7409</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 &#181;g/ml Dnase I (see details below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D5025</td>
			<td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY)</td>
			<td>431097</td>
			<td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-10-C</td>
			<td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Straigt tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Angled 45&#176; tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>Use for dissection of pituitaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alegra X-22R Centrufuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td>
			<td></td>
			<td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Techne (Staffordshire, UK)</td>
			<td></td>
			<td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur glass pipettes</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>612-1701</td>
			<td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>521-2844</td>
			<td>Any small table centrigue will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine needles / insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>26001-40</td>
			<td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

Primaire celculturen is een krachtig hulpmiddel gebruikt door wetenschappers bij het bestuderen van cellulaire eigenschappen en mechanismen van geïsoleerde cellen in een gecontroleerde omgeving. Ondanks de enorme verschillen in de Fysiologie tussen zoogdieren en vissen, zijn de protocollen van de cultuur van de primaire cel van vis vaak gebaseerd op zoogdieren kweekomstandigheden, vaak met slechts kleine wijzigingen. De ecologische verschillen van invloed zijn op niet alleen de lichaamstemperatuur, maar ook het bloedserum parameters zoals osmolaliteit, pH en buffercapaciteit van de pH. Als cel cultuurmedia en soortgelijke werkoplossingen zijn bedoeld om na te bootsen de kenmerken van de extracellulaire vloeistof en/of bloedserum waarnaar een cel aangepast wordt, is het van cruciaal belang dat deze parameters zijn aangepast specifiek aan het betrokken dier.
Het huidige protocol beschrijft geoptimaliseerde primaire kweekomstandigheden voor medaka (Oryzias latipes). Het protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe te isoleren en handhaven van gezonde losgekoppeld hypofyse cellen voor meer dan een week en bestaat uit de volgende stappen: 1. de aanpassing van de osmolaliteit de waarden gevonden in medaka bloedplasma, 2. de aanpassing van de incubatietemperatuur tot normale medaka temperatuur (hier in de aquarium faciliteit), en 3. de aanpassing van de pH en bicarbonaat buffer waarden vergelijkbaar met andere vissoorten leven bij soortgelijke temperaturen. De resultaten gepresenteerd met behulp van het protocol beschreven fysiologisch zinvolle resultaten voor medaka bevorderen en als een naslagwerk kunnen worden gebruikt door wetenschappers maken van primaire celculturen van andere diersoorten bij niet-zoogdieren.

Dit protocol beschrijving van de voorbereiding van een cultuur van de primaire cel van medaka pituitaries en gezonde cellen die kunnen worden gehandhaafd in een cultuur voor ten minste een week. Het protocol is gebaseerd op fysiologische relevante waarden voor medaka14 en bovendien aan de hypofyse weefsel in volwassen vis, met behulp van een pH van 7,75 en een osmolaliteit van 290 mOsm/kg gedurende de gehele procedure van het weefsel oogsten tot de vergulde is geop...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Hier beschrijven we een protocol voor te bereiden en handhaven van hypofyse en primaire celculturen van medaka (Oryzias latipes). De geoptimaliseerde voorwaarden in dit protocol rekening belangrijke parameters zoals temperatuur, osmolaliteit en pH door het nabootsen van de fysiologische omstandigheden van de vis, waardoor fysiologisch meer zinvolle resultaten.

Voorbereiding van een kwalitatief hoogwaardige primaire celcultuur van vis Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Overname van hoge kwaliteit digitale video van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en volwassen gedrag van een Lateral Perspectief

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Een RVS Protocol voor hoge kwaliteit RNA isolatie van Laser vangen Microdissected Purkinje cellen in het menselijke Post Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primaire cel cultuur van gezuiverde erge of glutamaterge neuronen opgericht door fluorescentie-geactiveerde cel sorteren

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...