Name: preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00
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Ce projet a été financé par l’Université norvégienne de Sciences de la vie et le Conseil de recherche norvégien, numéro de licence 243811 et 244461 (programme d’Aquaculture). Nous sommes reconnaissants à Lourdes Castelain Tan à l’Université norvégienne des Sciences de la vie pour le maintien de l’usine de poisson.

L’expérimentation animale dans cette étude ont été approuvées par l’Université norvégienne de Sciences de la vie, les directives suivantes pour les soins et le bien-être des animaux de recherche.
1. préparation des Solutions
<ol><li>Étalonner les instruments d’osmomètre et pH mètre selon les instructions du fabricant pour assurer des mesures correctes.</li>
	<li>
Préparer 500 mL de Ca2 +- et Mg2 +-libre tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD)...

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Ribeiro, L. P., Ahne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cell+culture:+initiation+of+a+line+of+pituitary+cells+from+carp+(Cyprinus+carpio)+to+study+the+release+of+gonadotropin+in+vitro.">Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro.</a> In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).</li><li>Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+pituitary+cells+of+carp+(Cyprinus+carpio)+for+the+study+of+gonadotropin+release.">Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release.</a> In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).</li><li>Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+inhibits+(d-Arg6,+Pro9-NEt)+salmon+gonadotropin-releasing+hormone-+and+dopamine+D1-stimulated+growth+hormone+release+from+perifused+pituitary+cells+of+chinese+grass+carp,+Ctenopharyngodon+idellus.">Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus.</a> General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).</li><li>Chang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+pituitary+cell+dispersion+method+and+primary+culture+system+for+the+studies+of+gonadotropin-releasing+hormone+action+in+the+goldfish,+Carassius+auratus.+I.+Initial+morphological,+static,+and+cell+column+perifusion+studies.">Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies.</a> General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).</li><li>Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pituitary+cells+in+primary+culture+to+study+the+secretion+in+rainbow-trout+-+Setting+up+and+validating+the+system+as+assessed+by+its+responsiveness+to+mammalian+and+salmon+gonadotropin-releasing+hormone.">Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone.</a> General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).</li><li>Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+dispersed+pituitary+cells+from+estradiol-pretreated+female+silver+eels+(Anguilla+anguilla+L):+Immunocytochemical+characterization+of+gonadotropic+cells+and+stimulation+of+gonadotropin+release.">Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release.</a> General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).</li><li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells.">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li><li>Lin, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+gonadotropins+(FSH+and+LH)+and+growth+hormone+(GH)+by+neuroendocrine,+endocrine,+and+paracrine+factors+in+the+zebrafish-An+in+vitro+approach.">Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach.</a> General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO2,+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH.</a> General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+-+a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka - a model organism from the far East.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).</li><li>Matsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMY+is+a+Y-specific+DM-domain+gene+required+for+male+development+in+the+medaka+fish.">DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish.</a> Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).</li><li>Kasahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medaka+draft+genome+and+insights+into+vertebrate+genome+evolution.">The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution.</a> Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Letters. 2 (12), (2016).</li><li>Waymouth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolality+of+mammalian+blood+and+of+media+for+culture+of+mammalian+cells.">Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells.</a> In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).</li><li>Cameron, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis+-+past+and+present+perspectives.">Acid-base homeostasis - past and present perspectives.</a> Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).</li><li>Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+regulation+in+fishes:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).</li><li>Perry, S. F., Tufts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish respiration. , (1998).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+&#946;-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone &#946;-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Strandab&#248;, R. A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+volume+regulation+in+response+to+changes+in+osmolality.">Brain volume regulation in response to changes in osmolality.</a> Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).</li></ol>

Systèmes de culture in vitro cell fournissent des outils puissants pour les chercheurs de répondre à une multitude de questions biologiques si utilisé dans le droit chemin1. Il est important de se rappeler que les cellules dissociées qui ont perdu leurs connexions aux cellules voisines peuvent avoir obtenu des propriétés fonctionnelles différentes qu’ils avaient initialement in vivo. Pour éviter d’être au risque d’une mauvaise interprétation des résultats obtenu...

Culture cellulaire est l’un des principaux outils utilisés dans la recherche en biologie moléculaire, grâce à un système excellent modèle pour répondre à des questions biologiques différentes allant de la physiologie cellulaire normale à drogues dépistage et carcinogenèse1. Les cellules primaires, prélevés directement les tissus d’origine animale par des méthodes enzymatiques et/ou mécaniques, sont souvent considérés comme biologiquement plus pertinentes que les lignées cellulaires comme la réaction biologique peut se rapprocher de la situation in vivo . Protocoles pour la préparation de cultures de cellules primaires doivent être optimisés pour chaque type d’espèces et de cellules d’intérêt afin de reproduire les caractéristiques auxquelles une cellule est adaptée et obtenir des résultats significatifs physiologiquement.
Nombreux protocoles décrivent les conditions de culture pour les systèmes cellulaires de mammifères, tandis que les protocoles similaires, décrivant les conditions de culture primaire de cellules de poissons sont plutôt rares en comparaison. Les cellules sont vulnérables aux changements rapides de température, le pH et l’osmolalité et sont particulièrement fragiles lors de la procédure de dissociation. Commerciales solutions salines et milieux de culture utilisés pour les cultures de cellules de mammifères ne sont pas optimaux pour les poissons téléostéens, surtout en ce qui concerne les systèmes tampon de pH et l’osmolalité. Par conséquent, il est important de mesurer et d’ajuster les solutions aux niveaux physiologiquement pertinents de ces paramètres chez les espèces d’intérêt.
Les cultures primaires hypophysaires ont été apportées de plusieurs espèces de poissons téléostéens, notamment la carpe commune (Cyprinus carpio)2,3, herbe la carpe herbivore (Ctenopharyngodon idella)4, cyprin doré (Carassius auratus )5,6de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), l’anguille européenne (Anguilla anguilla)7, le tilapia (Oreochromis mossambicus)8, poisson zèbre (Danio rerio)9, et Morue de l’Atlantique (Gadus morhua)10. Mis à part le réglage de la température d’incubation de l’espèce d’intérêt, plusieurs de ces protocoles ont incubé les cellules de mammifères comme conditions pouvant être sous-optimale pour les espèces d’intérêt, avec un pH de 7,2 à 7,5 en atmosphère humidifiée contenant de 3 à 5 % de CO2. En outre, il est difficile de savoir si l’osmolalité des solutions utilisées pour la préparation de plusieurs de ces cultures de cellules primaires ont été ajustée et stable entre différentes solutions.
Le protocole actuel repose sur des travaux antérieurs avec des cultures primaires de morue de l’Atlantique10 et comprend les réglages de la température d’incubation, osmolalité, pH et pH tampon systèmes, y compris la pression partielle de dioxyde de carbone (pCO2), à la physiologie des médakas (o. latipes). Chez les sujets exposés sont un poisson d’eau douce de petite taille (3 à 4 cm), originaire d’Asie du sud-est. Ces jours-ci, il est utilisé comme une espèce de modèle dans de nombreux laboratoires de recherche dans le monde entier, car il est relativement facile à reproduire et très résistants à beaucoup de maladies poisson commun11. Il y a plusieurs avantages à utiliser des médakas comme modèle, y compris une tolérance à la température de 4 à 40 ° C11, un temps de génération court, embryons transparents, un déterminant le sexe génétique12et un génome séquencé13, ainsi que plusieurs autres ressources génétiques disponibles.
Les conditions de culture primaire dans le présent protocole sont optimisées pour correspondre à la température de 26 ° C régressées conservés à dans l’usine de poisson. En outre, l’osmolalité est ramenée de 320 mOsm/kg de morue vivant dans l’eau salée à 290 mOsm/kg pour le médaka vivant en eau douce et est conforme à l’osmolarité normale de medaka plasma14. En comparaison, l’osmolalité typique du plasma chez les mammifères est de l’ordre de 275 – 295 mOsm15. Poisson vit dans une variété de températures et ont des branchies qui sont en contact direct avec l’eau, ce qui rend la capacité de pH et de la mémoire tampon du sang et de liquide extracellulaire chez les poissons différentes de celles des mammifères. Milieux de culture chez les mammifères comprennent généralement des systèmes tampons qui permettent à un pH d’environ 7,4 lors les médias soient équilibrés à une atmosphère standard de 5 % de CO2 dans l’air humidifié à 37 ° C. Le pH est dépendante de la température et la valeur de pH neutre (en eau) augmente avec une baisse de température16. Typique de poissons téléostéens plasma pH varie de 7,7 à 7,917. L’optimisation du présent protocole notamment une diminution de pH 7,85 cabillaud conservées à 12 ° C à un pH de 7,75 pour médaka maintenue à 26 ° C en augmentant le CO2 de 0,5 % à 1 %.
En outre, la capacité de tampon bicarbonate est très différente dans les poissons et les mammifères. CO2 est facilement échangés sur les branchies chez les poissons et le BCP2 dans l’eau n’est qu’une petite fraction du pCO2 dans le poumon18. Changement de la température ou la pCO2 va changer le pH et le tampon du milieu. Par conséquent, ni le pH ni la pCO2 suggérés en incubant les cellules de mammifères est optimal pour les cellules de poissons, et par conséquent, les milieux de culture doit être optimisée avec des systèmes tampons qui contiennent des valeurs physiologiquement pertinents pour les poissons et les espèce d’intérêt. Ce protocole décrit comment préparer des cultures de cellules primaires de glandes pituitaires médaka et inclut les ajustements de la système d’incubation température, osmolalité, pH et pH tampon, en plus d’autres paramètres importants à considérer lors de la préparation de cellules primaires cultures des espèces non mammifères.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>L5520</td>
			<td>Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &#181;m PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5761</td>
			<td>10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>63565</td>
			<td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>G5400</td>
			<td>4.5 mM&#160; D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 &#181;g/ml Streptomycin).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin type II-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T7409</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 &#181;g/ml Dnase I (see details below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D5025</td>
			<td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY)</td>
			<td>431097</td>
			<td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-10-C</td>
			<td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Straigt tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Angled 45&#176; tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>Use for dissection of pituitaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alegra X-22R Centrufuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td>
			<td></td>
			<td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Techne (Staffordshire, UK)</td>
			<td></td>
			<td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur glass pipettes</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>612-1701</td>
			<td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>521-2844</td>
			<td>Any small table centrigue will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine needles / insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>26001-40</td>
			<td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

Culture cellulaire primaire est un outil puissant couramment utilisé par les scientifiques pour étudier les propriétés cellulaires et les mécanismes des cellules isolées dans un environnement contrôlé. Malgré les grandes différences dans la physiologie entre les mammifères et les poissons, les protocoles de culture de cellules primaires de poissons reposent souvent sur des conditions de culture chez les mammifères, souvent avec des modifications mineures. Les différences environnementales affectent non seulement la température corporelle, mais aussi le sérum sanguin paramètres tels que l’osmolalité, du pH et pouvoir tampon pH. Comme milieux de culture cellulaire et des solutions de travail similaires sont censées imiter les caractéristiques du liquide extracellulaire et/ou sérum sanguin auquel une cellule est adaptée, il est crucial que ces paramètres soient adaptées spécifiquement à l’animal en question.
Le protocole actuel décrit les conditions de culture primaire optimisé pour medaka (Oryzias latipes). Le protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d’isoler et de maintenir en bonne santé dissocient des cellules hypophysaires pendant plus d’une semaine et comprend les étapes suivantes : 1. l’adaptation de l’osmolalité aux valeurs trouvées dans le plasma sanguin de medaka, 2. l’adaptation de la température d’incubation à température normale medaka (ici dans l’installation de l’aquarium) et 3. l’ajustement du pH et du bicarbonate tampon aux valeurs comparables à d’autres espèces de poissons vivant à des températures similaires. Les résultats présentés en utilisant le protocole décrit promouvoir physiologiquement significatives résulats médaka et peuvent être utilisés comme un guide de référence par les scientifiques faisant des cultures de cellules primaires des autres espèces non mammifères.

Ce protocole décrit la préparation d’une culture de cellules primaires de glandes pituitaires médaka et fournit des cellules saines qui peuvent être maintenues dans une culture pendant au moins une semaine. Le protocole repose sur des valeurs pertinentes physiologiques pour le médaka14 et est en outre optimisé pour le tissu hypophysaire chez les poissons adultes, à l’aide d’un pH de 7,75 et une osmolalité de 290 mOsm/kg pendant toute la procédure de ...

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Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Nous décrivons ici un protocole pour établir et maintenir des cultures primaires de cellules hypophysaires de medaka (Oryzias latipes). Les conditions optimisées dans le présent protocole compte paramètres importants tels que la température et l’osmolalité pH en imitant les conditions physiologiques du poisson, ce qui permet des résultats physiologiquement plus significatifs.

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