Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Vi takker Dr. Paul Bradfield for manuskript læsning og feedbacks. A. S. modtaget økonomisk støtte fra Sir Jules Thorn velgørende oversøiske Trust Reg.,

Menneskelige materialer blev brugt med informeret samtykke af frivillige donorer, og i den schweiziske etiske komitéer på klinisk forskning.
1. isolering og indefrysning af menneskelige Umbilical vene endotelceller (HUVEC)
<ol><li>Tilsættes 5 mL belægning til T75 kolbe (0,1 mg/mL kollagen G og 0,2% gelatine i phosphat bufferet saltvand PBS på pH 7,4) i 30 minutter ved 37 ° C før indlede HUVEC isolation.</li>
	<li>Ren ledning med PBS, tør det med sterile kompresser og placere det i en...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

Her rapporterer vi en metode beskriver en undersøgelse af hvordan monocyt delpopulationer transmigrate gennem den betændte endotel éncellelag. Den omtalte metode brugt Konfokal mikroskopi i stedet for fasekonstrastmikroskopi, som også bruges til at studere monocyt rekruttering under flow3,11,19. En væsentlig fordel ved hjælp af Konfokal mikroskopi for time-lapse imaging er evnen til at utvetydigt forskelsbehandle transmigr...

Monocytter udgør en fagocyterende komponent af medfødt immunitet, der er nødvendig til bekæmpelse af patogener, rydde op beskadiget væv, angiogenese og Patofysiologi af mange sygdomme herunder kræft1,2,3 . Monocytter er knoglemarv-afledte celler sammensat af heterogene delpopulationer, der cirkulerer i blodet, men kan ansættes til stedet for betændelse i perifere væv gennem specifikke molekylære mekanismer. Rekruttering kaskader af monocytter, som for leukocytter i almindelighed, implicerer forskellige trin herunder opsamling, rullende, kravle, anholdelse, transendothelial migration (transmigration) og migration gennem karvæggen (basalmembranen og vægmaleri celler)4. Disse trin involverer primært betændelse-induceret molekyler på i endothelial luminale overflade som selectins, glycoprotein ligander, kemokiner, intercellulære og junctional adhæsionsmolekyler, og deres receptorer på leukocytter såsom selectin ligander og integriner. Menneskehandel veje gennem enten i endothelial celle vejkryds (paracellular) eller i endothelial cellen kroppen (transcellular) kan bruges af leukocytter for at krydse endotel barriere5. Mens monocytter har historisk dokumenteret for at transmigrate gennem transcellular ruten, er potentielle forskelle i deres vandrende pathway blevet foreslået som monocytter er ikke længere betragtes som en homogen celle population. Nu bliver det klart, at monocyt mangfoldighed kan defineres af hver af deres forskelle og fællestræk, med hensyn til deres særprægede ekstravasation kaskader3,6. Derfor, for at forskelsbehandle utvetydigt monocyt delpopulationer, er det afgørende at visualisere og fænotype funktionsmåden for hver af disse forskellige delpopulationer under rekruttering proces.
Monocytter fra menneskelige, svin, rotter og mus blev opdelt i fænotypiske delpopulationer med visse tilskrives funktioner og specifikke vandrende adfærd7,8,9. For eksempel, hos mennesker, kan monocytter inddeles i tre undergrupper baseret på deres overflade udtryk af CD14, en coreceptor for bakteriel LPS og CD16, Fc-gamma receptor III. Humane monocyt delpopulationer omfatter klassisk CD14+CD16-, mellemliggende CD14+CD16+ og ikke-klassisk CD14dimCD16+ celler,6,9. Den klassiske CD14+CD16- monocytter blev vist sig at være primært inflammatoriske boer puljen af CD16+ monocytter fandtes kollektivt for at præsentere TIE2 udtryk og proangiogenic funktion10. Konsekvent, endotel celle stimulation med inflammatoriske cytokiner såsom menneskelige tumor nekrose faktor (TNF) α eller interleukin (IL-1) beta (konventionelle betændelse) er tilstrækkelig til at udløse den komplette rekruttering af klassisk CD14+CD16 - monocytter. Samtidige handlinger af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) A og TNFα (angiogene faktorer-drevet betændelse) er dog forpligtet til at provokere CD16 transmigration+ proangiogenic pulje af monocytter3. Historisk, den traditionelle Transwell system under statiske betingelser, parallelle plade flow kammer og µ-slide flow kamre er blevet anvendt til kvantitativt analysere rekruttering af én leukocyt befolkning på et tidspunkt in vitro-11 ,12,13. Mens disse protokoller er blevet godkendt, betragtes en mere robust metode, der tillod en simultan analyse af flere monocyt delpopulationer mere indsigtsfulde. Sådanne metoder skal redegøre for flere interaktioner og de forskellige frekvenser af hver respektive befolkning og også give en mekanistisk forståelse af ligheder og forhold for rekruttering cascades, der definerer hver monocyt delmængde.
Her præsenterer vi en metode baseret på de time-lapse billeddannelse af monocyt rekruttering under flow, som tillader den vandrende kaskader af forskellige monocyt delpopulationer undersøges samtidigt ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Denne metode integrerer visse kritiske funktioner, der efterligner endotel celle betændelse samt Hæmodynamik af cirkulerende monocytter i post kapillær venules, den vigtigste placering af leukocyt ansættelse in vivo. Den foreslåede metode bruger menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVEC), der genereres gennem en veletableret protokol af isolation fra menneskelige umbilical snore. Denne kliniske ressource har fordelen at være nemt tilgængelig som et biologisk biprodukt, samtidig også giver et rimeligt udbytte i endothelial celler, der kan isoleres fra navlestrengen venen. Vi brugte også fluorescerende farvestoffer og immunfluorescens for at skelne mellem forskellige cellulære komponenter, og konfokal mikroskopi til utvetydigt definerer monocyt positionering (luminale vs abluminal) over tid. Protokollen præsenteres her er blevet udviklet til samtidig foranstaltning transmigration niveauer af monocyt delpopulationer. Desuden skal det bemærkes, at denne metode kan udvides til at studere andre leukocytter delpopulationer og rekrutteringsprocesser ved brug af forskellige biomarkører og mærkning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

Ansættelse af monocytter fra blodet til målrettede perifere væv er afgørende for den inflammatoriske proces under vævsskade, tumor udvikling og autoimmune sygdomme. Dette er lettet gennem en proces med opsamling fra frie strøm på den luminale overflade af aktiverede endotelceller, efterfulgt af deres vedhæftning og transendothelial migration (transmigration) i de underliggende berørte væv. Men de mekanismer, der understøtter de privilegerede og kontekst-afhængige rekruttering af monocyt delpopulationer er stadig ikke fuldt forstået. Derfor har vi udviklet en metode, der giver mulighed for ansættelse af forskellige monocyt delpopulationer samtidig visualiseret og målt under flow. Denne metode, baseret på time-lapse Konfokal billeddannelse, giver mulighed for en entydig skelnen mellem vedhængende og transmigrated monocytter. Her beskriver vi, hvordan denne metode kan bruges til at studere samtidigt rekruttering kaskade af pro-angiogene og ikke-angiogene monocytter in vitro. Denne metode kan endvidere udvides til at studere de forskellige trin i ansættelse af op til tre monocyt populationer.

Fastlæggelse af status for HUVEC aktivering induceret af TNFα
Bio-aktiviteten af inflammatorisk cytokin TNFα kan variere alt efter partiet og genopfyldning af frysning-optøning cyklus. Det er vigtigt at kontrollere aktivisering statussen af HUVEC med TNFα behandling. Dette kunne udføres af farvning parallelt nogle prøver af sammenflydende HUVEC for inflammatorisk induktion af selectins, ICAM-1 og VCAM-115</...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Vi præsenterer her, en integreret protokol, der måler monocyt delpopulation handel under flow in vitro-ved brug af specifikke overflade markører og konfokal Fluorescens mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at udforske sekventielle rekruttering trin samt for at profilere andre leukocyt undertyper ved hjælp af andre specifikke overflade markører.

Samtidige undersøgelse af ansættelse af monocyt delpopulationer Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

For denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for inflammation og immunologi. For eksempel, hvad er den molekylære mekanisme leukocyt vedhæftning og trans-endotel migration. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver mulighed for ubegrænset brug forskelsbehandling mellem transmigration og stærk tilsætning af monocytter til endotelmonstol.Selv om denne metode giver oplysninger om rekruttering af monocytter på strømmen, kan den også tilpasses andre celler i hæmatopoietiske systemer såsom T-celler, B-celler eller derivater af delpopulation heraf. Efter vask, mærke den menneskelige navlestrengen endotelceller eller HUVEC med 30 mikroliter af 37 grader Celsius M199 medium suppleret med en mikromolar CMFDA i 10 minutter ved 37 grader Celsius og 5% Kuldioxid. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne med 150 mikroliter af komplet M199-medium, og kulturen inkuberes i 150 mikroliter af frisk komplet M199-medium i yderligere 30 minutter.Derefter erstatte supernatant med 150 mikroliter af komplet M199 medium, der indeholder de relevante eksperimentelle kosttilskud og returnere dias kammer kultur til rugemaskinen i seks timer. For human PAN monocyt isolation fortyndes en frisk indsamlet blodprøve i PBS suppleret med en millimolar EDTA i et 1 til 1 forhold og omhyggeligt lag 20 ml af blodopløsningen på 20 ml massefyldegradient medium for massevis gradient adskillelse ved centrifugering. Det midterste perifere blodmonukleare cellepladelag opsamls i et nyt 50 ml rør med 40 ml PBS suppleret med 1 millimolar EDTA, og slutvolumen bringes til 50 ml med ekstra PBS-EDTA Efter optælling isoleres monocytterne med PAN monocyt isolationssættet i henhold til fabrikantens instruktion.Og vask cellerne tre gange i M199 medium suppleret med 0,5% Kvæg Serum Albumin, eller BSA, for at fjerne eventuelle spor af EDTA. Kvaliteten af monocytisolering er afgørende for at sikre robust transmigration og vedhæftningsresultat. Det er derfor vigtigt nøje at følge producentens anbefaling af isolationen.Opsplit pellet på en 6 gange 10 til 6 monocytter pr ml koncentration i frisk M199 medium suppleret med 0,5% BSA og opdele cellerne i en 200 mikroliter aliquot per mikrocentrifuge rør pr rekruttering assay. Derefter placere cellerne på 37 grader Celsius i 20 minutter før deres injektion i flowkammeret. For at forberede det flydende system til analysen, først indsætte en han luer stik i den ene ende af en 8 cm lang 3 mm tykt stykke silikonerør og forbinde den anden ende til en inline luer injektion sæt.Tilslut derefter luerstikket til den ene ende af et 40 cm langt 3 mm tykt stykke silikonerør. Dernæst 20 mm sprøjten i den ene ende af en 1 m lang 3mm tykt stykke silikonerør og indsætte en han luer stik til den anden ende. Derefter sættes begge hanlumerstik i en hunlumerlåskok og læg den frie ende af silikoneslangen i et reservoir på 37 grader Celsius M199-medium suppleret med 0,5 % BSA.Træk stemplet tilbage for at fylde slangen med flowbufferen, og fastgør sprøjten på sprøjtepumpen. Indstil derefter pumpen til træktilstanden, og angiv strømningshastigheden. For at forbinde slidekammeret skal silikoneslangen klemmes rundt om den kvindelige luerlåskobling og koble de to luerstikhaner fra koblingen, så de kan tilsluttes reservoiret på diaset.Luftbobler forstyrrer ikke kun billedkvaliteten, men fremkalder også kapillær ren og skær stress til cellerne, hvilket fører til celledød. For at undgå luftbobler skal du bekræfte den korrekte fastspænding af slangen, før lueren sættes ind i beholderen. Fjern derefter klemmerne for at bekræfte, at forbindelsen ikke lækker, og sæt diaset under mikroskopet.Til billeddannelse af monocytrekruttering under flow tilsættes 5 mikroliter flourescence konjugeret anti CD16 antistof og et passende nukleart farvestof til hver aliquoterede monocytter i en 10 minutters inkubation ved stuetemperatur og opsaml cellerne med en kort centrifugering. Opsvar pellet i 250 mikroliter af flow buffer og starte sprøjten pumpen. Tilføj 30 mikroliter af en monocyt suspension til et kammer af diaset og vælg 40X mål på konfokale mikroskop.Aktiver de relevante fluorescerende lasere og bruge kammeret med den mærkede monocyt til at indstille erhvervelse parametre konfokale mikroskop Næste, skal du vælge tre synsfelter inden for en halv centimeter radius for multi position konfokal billeddannelse, og sæt en Z stak til 10 til 12 mikrometer og tiden bortfalder erhvervelse til at køre hvert minut. Efter tre minutters billeddannelse injiceres 200 mikroliter monocytter gennem inline luer injektionsporten og begynder at billedre den cellulære interaktion. Efter mindst 30 minutter skal billeddannelsen og flowet standses, og slangen klemmes, så den kan kobles fra rutsjebanen.For at bestemme transmigrationsraten for cellerne gennem de stimulerede HUVEC'er skal du åbne billede J og tælle det samlede antal klæbende monocytter i hvert felt for at bestemme celletallet pr. kvadratmillimeter. Derefter tælle antallet af transmigrerede monocytter, der er til stede i basalplanet under endotelcellerne som identificeret ved tilstedeværelsen af en sort hulzone omkring kernen. En enkel måde at kontrollere aktivering status huvecs efter stimulation er at visualisere deres forlængelse under inflammatorisk stress.Time lapse confocal imaging giver mulighed for visualisering af monocytterne på det apiske plan, hvor deres fænotype kan vurderes. Migrerende celler, der gennemgår transmigration, flyttes til det intercellulære celle-til-celle-kryds, før de forsvinder fra det apikale plan og dukker op igen i det basale plan. Kvantisering af monocytrekruttering over tid bekræfter, at monocyt vedhæftning efterfølges af transmigration.Transmigrationsraten for CD16-positiv monocyt er lav, når endotelcellen kun stimuleres med TNF alpha, men øges, når endotelcellerne stimuleres med både TNF alfa og vaskulær endotelvækstfaktor eller VEGFA. HUVEC stimulation med TNF alpha og TNF alpha plus VEGFA inducerer en stigning i overholdelsen af CD14 negative T, B og NK celler, sammenlignet med CD14 positive monocytter. Desuden fremkalder HUVEC stimulation kun transmigration af monocytpopulationen, da T-, B- og NK-celler ikke transmigrerer under hverken TNF alpha eller TNF alpha plus VEGFA stimulerende tilstande.For at udføre en optimal monocyt rekruttering analyse, er det vigtigt, at du planlægger dit eksperiment på forhånd og gøre det på samme dag. Og når du renser cellerne, skal du sørge for, at dit mikroskop er på 37 grader, så du ikke overfører cellerne til forskellige temperaturer under eksperimentet. For at lære denne procedure, alle de metoder som profilering af HUVEC cytokin og chemokine udtryk samt chemotaxis undersøgelser kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om den molekylære mekanisme, der opretholder transmigration og vedhæftning af specifikke monocyt population.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering af Humane navlevene-endotelceller og deres anvendelse i undersøgelsen af ​​neutrofil transmigration Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Samtidig infektion model for at studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions i humane primære Monocytafledte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vedhæftning Assay til at studere Leucocyte Rekruttering til human hepatiske Sinusformede endotel Under betingelser for forskydningsspænding

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

At analysere virkningen af ​​stromacellers om ansættelse af Leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo model til at studere bakteriel adhæsion til karvæggen Under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

A Simple flowcytometriske metode til at måle glukoseoptagelse og Glucose Transporter Udtryk for Monocyt undergrupper i fuldblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering af Humane monocytafledte dendritiske celler fra Imaging flowcytometri: en sammenligning mellem to Monocyt Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse af Microglia og Monocyt-afledte Makrofager fra Centralnervesystemet ved Flowcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...