Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Wij danken Dr. Paul Bradfield voor manuscript lezen en feedback. A. S. kreeg financiële steun van de Sir Jules Thorn charitatieve overzeese vertrouwen Reg.,

Menselijke materialen werden gebruikt met de geïnformeerde toestemming van vrijwillige donoren en in overeenstemming met de Zwitserse ethische comités op klinisch onderzoek.
1. isolatie en invriezen van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC)
<ol><li>Voeg 5 mL van coating oplossing in een maatkolf van T75 (0,1 mg/mL collageen G en 0,2% gelatine in fosfaatgebufferde zoutoplossing PBS met een pH van 7,4) gedurende 30 minuten bij 37 ° C voordat de HUVEC isolatie.</li>
	<li>He...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

Wij rapporteren hier, een methode die een studie van hoe monocyt subpopulaties via de ontstoken endothelial enkelgelaagde transmigrate detaillering. De besproken methode gebruikt confocale microscopie in plaats van fase contrast microscopie, die ook wordt gebruikt om te studeren monocyt recruitment onder stroom3,11,19. Een groot voordeel van het gebruik van de confocal microscopie voor time-lapse beeldvorming is de mogelijkheid ...

Monocyten een fagocytische onderdeel vormen van aangeboren immuniteit dat essentieel is voor de bestrijding van ziekteverwekkers, opruimen van beschadigde weefsels, angiogenese en de pathofysiologie van vele ziekten, waaronder kanker1,2,3 . Monocyten zijn beenmerg-afgeleide cellen samengesteld van heterogene subpopulaties die circuleren in het bloed, maar op de site van ontsteking in perifeer weefsel kunnen worden aangeworven door middel van specifieke moleculaire mechanismen. De aanwerving cascades van monocyten, wat betreft de leukocyten in het algemeen impliceert verschillende stappen waaronder vangen, rollen, kruipen, arrestatie, migratie van signaalcomplexen (zielsverhuizing) en migratie door de vaatwand (kelder membraan en muurschildering cellen)4. Deze maatregelen betreffen voornamelijk ontsteking geïnduceerde moleculen op het endotheel luminal oppervlak zoals selectinen, glycoproteïne liganden chemokines, intercellulaire en regulates celadhesie-moleculen en hun receptoren op leukocyten zoals selectine liganden en integrins. Mensenhandel trajecten via ofwel de endothelial cel kruispunten (paracellular) of via de endothelial cel lichaam (transcellulair) kunnen worden gebruikt door leukocyten te steken van het endotheel barrière-5. Terwijl monocyten zijn historisch gedocumenteerd te transmigrate door de transcellulair-route, hebben mogelijke verschillen in hun trekkende traject voorgesteld als monocyten zijn niet langer beschouwd als een homogene-celpopulatie. Het is nu duidelijk dat monocyt diversiteit kan worden gedefinieerd door elk van hun verschillen en overeenkomsten, met betrekking tot hun kenmerkende extravasation cascades3,6. Daarom, teneinde ondubbelzinnig onderscheid te maken tussen monocyt subpopulaties, is het van cruciaal belang om te visualiseren en fenotype het gedrag van elk van deze verschillende subpopulaties tijdens de aanwerving verwerken.
Monocyten van menselijke, pig, rat en muis waren onderverdeeld in fenotypische subpopulaties met bepaalde waaraan functies en specifieke trekkende gedrag7,8,9. Bijvoorbeeld, bij de mens, kunnen monocyten worden onderverdeeld in drie subgroepen op basis van hun oppervlakte uitdrukking van CD14, een co-receptor voor bacteriële lipopolysaccharide en CD16, de Fc-gamma receptor III. Menselijke monocyt subpopulaties omvatten klassieke CD14+CD16-, middenniveau CD14+CD16+ en niet-klassieke CD14dimCD16+ 6,9cellen. De klassieke CD14+CD16- monocyten bleken te zijn voornamelijk inflammatoire overwegende dat de pool van CD16+ monocyten bleken collectief te presenteren TIE2 meningsuiting en proangiogenic functie10. Consequent, endothelial cel stimulatie met inflammatoire cytokines zoals menselijke tumor necrose factor (TNF) α of Interleukine (IL-1) beta (conventionele ontsteking) is voldoende om te leiden tot de volledige aanwerving van klassieke CD14+CD16 - de monocyten. Gelijktijdige acties van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) A en TNFα (angiogenic factoren gestuurde ontsteking) zijn echter vereist om te provoceren de transmigratie van de CD16+ proangiogenic pool van monocyten3. In het verleden het traditionele systeem van de Transwell onder statische omstandigheden, de parallelle plaat stroom zaal en de µ-dia stroom kamers zijn gebruikt om het kwantitatief analyseren de aanwerving van een leukocyte bevolking op een tijd in vitro11 ,12,13. Terwijl deze protocollen zijn gevalideerd, een meer robuuste methode waardoor de gelijktijdige analyse van meerdere monocyt subpopulaties zou worden beschouwd als meer inzicht. Dergelijke methodologieën moeten rekening voor meerdere interacties en de verschillende frequenties van elke respectieve bevolking en bieden ook een mechanistische inzicht in de gelijkenissen en de specifieke kenmerken voor de aanwerving cascades die elke monocyt bepalen subset.
Hier presenteren we een methode gebaseerd op de time-lapse beeldvorming van monocyt recruitment onder stroom waarmee de trekkende cascades van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden bestudeerd met behulp van de confocal microscopie. Deze methode integreert bepaalde kritische features die endothelial cel ontsteking, evenals de hemodynamica van circulerende monocyten in post capillaire venules, de hoofdlocatie van leukocyten aanwerving in vivo na te bootsen. De voorgestelde methode maakt gebruik van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), die worden gegenereerd door een goed gangbaar protocol van isolatie van menselijke umbilical koorden. Deze klinische resource heeft het voordeel dat ze gemakkelijk beschikbaar als biologische bijproduct, terwijl ook het verstrekken van een redelijk rendement van endotheliale cellen die geïsoleerd uit de navelstreng ader worden kunnen. Wij ook gebruikt fluorescente kleurstoffen en immunofluorescentie onderscheid maken tussen de verschillende cellulaire componenten, en confocale microscopie ondubbelzinnig definiëren monocyt positionering (luminal vs. abluminal) na verloop van tijd. Het hier gepresenteerde protocol heeft ontwikkeld om tegelijkertijd maatregel de zielsverhuizing niveaus van monocyt subpopulaties. Bovendien moet worden opgemerkt dat deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van andere leukocyten subpopulaties en recruitment processen door gebruik van verschillende biomerkers en etikettering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

De aanwerving van monocyten uit het bloed aan gerichte perifere weefsels is kritiek aan het inflammatoire proces tijdens weefsel schade, ontwikkeling van de tumor en auto-immune ziekten. Dit wordt vergemakkelijkt door een proces van vangen van doorstroming op het luminal oppervlak van geactiveerde endotheliale cellen, gevolgd door hun migratie hechting en signaalcomplexen (zielsverhuizing) in het onderliggende aangetast weefsel. De mechanismen die ondersteuning bieden voor de preferentiële en context-afhankelijke werving van monocyt subpopulaties worden echter nog steeds niet volledig begrepen. Daarom hebben wij een methode waarmee de aanwerving van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden gevisualiseerd en gemeten onder stroom ontwikkeld. Deze methode, gebaseerd op time-lapse confocal imaging, voorziet het duidelijke onderscheid tussen aanhangend en transmigrated monocyten. Hier beschrijven we hoe deze methode kan worden gebruikt om gelijktijdig de opeenvolging van de werving van pro-angiogenic en niet-angiogenic monocyten in vitro studie. Bovendien, deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van de verschillende stappen van de aanwerving van maximaal drie monocyt populaties.

Vaststelling van de staat van de activering van de HUVEC veroorzaakt door TNFα
De bio-activiteit van de inflammatoire cytokine TNFα kan worden afhankelijk van de partij en de herverpakking van bevriezen-ontdooien cyclus. Het is belangrijk om te controleren van de status van de activering van HUVEC met TNFα behandeling. Dit kon worden uitgevoerd door kleuring parallel enkele monsters van confluente HUVEC voor de inflammatoire ind...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.

Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Voor deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontsteking en immunologie. Bijvoorbeeld, wat zijn de moleculaire mechanisme van leukocyten hechting en trans-endotheel migratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onbeperkt gebruik van discriminatie tussen transmigratie en sterke toevoeging van monocyten aan endotheelmonolaag mogelijk maakt.Hoewel deze methode informatie biedt over de rekrutering van monocyten op de stroom, kan deze ook worden aangepast aan andere cellen van de hematopoietische systemen zoals T-cellen, B-cellen of derivaten van subpopulatie daarvan. Na het wassen, etiket de menselijke navelstreng ader endotheelcellen of HUVEC met 30 microliter van 37 graden Celsius M199 medium aangevuld met een micromolar CMFDA gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5%Kooldioxide. Aan het einde van de incubatie, was de cellen met 150 microliter van volledige M199 medium en broeden de cultuur in 150 microliters van verse complete M199 medium voor nog eens 30 minuten.Vervang vervolgens de supernatant door 150 microliters van volledig M199-medium met de juiste experimentele supplementen en breng de diakamercultuur zes uur terug naar de couveuse. Verdun voor menselijke PAN monocyt isolatie een vers verzameld bloedmonster in PBS aangevuld met één millimolar EDTA met één-op-één verhouding en leg voorzichtig 20 ml van de bloedoplossing op 20 ml dichtheidsgradiëntmedium voor dichtheidsgradiëntscheiding door centrifugatie. Verzamel de middelste perifere bloed mononucleaire celplaatjeslaag in een nieuwe buis van 50 ml met 40 ml PBS aangevuld met 1 millimolar EDTA en breng het uiteindelijke volume op 50 ml met extra PBS-EDTA Na het tellen isoleren de monocyten met de PAN monocyte isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant.En was de cellen drie keer in M199 medium aangevuld met 0,5%Bovine Serum Albumin, of BSA, om eventuele sporen van EDTA te elimineren. De kwaliteit van monocytenisolatie is van cruciaal belang voor een robuuste transmigratie en hechtingsresultaat. Het is dus belangrijk om de aanbeveling van de fabrikant voor het isolement strikt te volgen.Resuspend de pellet op een 6 keer 10 tot de 6 monocyten per ml concentratie in verse M199 medium aangevuld met 0,5%BSA en verdeel de cellen in een 200 microliter aliquot per microcentrifuge buis per wervingstest. Plaats vervolgens de cellen op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten voor hun injectie in de flow kamer. Om het fluidic systeem voor te bereiden op de analyse, steek je eerst een mannelijke luer connector in het ene uiteinde van een 8 cm lang 3 mm dik stuk siliconenbuizen en sluit het andere uiteinde aan op een inline luer injectieset.Sluit vervolgens de luerconnector aan op één uiteinde van een 40 cm lang 3 mm dik stuk siliconenbuis. Vervolgens, de 20 mm spuit aan het ene uiteinde van een 1 m lang 3mm dik stuk siliconen buizen en steek een mannelijke luer connector aan de andere kant. Steek vervolgens beide mannelijke luer connectors in een vrouwelijke luer lock koppeling en plaats het vrije uiteinde van de siliconen buizen in een reservoir van 37 graden Celsius M199 medium aangevuld met 0,5%BSA.Trek de zuiger in om de slang te vullen met stroombuffer en zet de spuit vast op de spuitpomp. Stel vervolgens de pomp in op de opnamemodus en geef de stroomsnelheid op. Om de schuifkamer aan te sluiten, klemt u de siliconenbuis rond de vrouwelijke luerslotenkoppeling en koppelt u de twee luerconnectormannetjes los van de koppeling, zodat ze op het reservoir van de glijbaan kunnen worden aangesloten.Luchtbellen verstoren niet alleen de beeldkwaliteit, maar veroorzaken ook capillaire pure stress aan de cellen, wat leidt tot celdood. Om luchtbellen te voorkomen, bevestigt u de juiste klemmen van de slang voordat u de luer in het reservoir plaatst. Verwijder vervolgens de klemmen om te bevestigen dat de verbinding niet lekt en plaats de glijbaan onder de microscoop.Voor de beeldvorming van de monocyten werving onder stroom, voeg 5 microliter bloemscentie geconjugeerde anti-CD16 antilichaam en een geschikte nucleaire kleurstof aan elke aliquoted monocyten voor een 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur en het verzamelen van de cellen met een korte centrifugatie. Resuspend de pellet in 250 microliters van de stroom buffer en start de spuit pomp. Voeg 30 microliter van één monocytensuspensie toe aan één kamer van de dia en selecteer de 40X-doelstelling op de confocale microscoop.Activeer de juiste fluorescerende lasers en gebruik de kamer met de gelabelde monocyt om de aankoopparameters van de confocale microscoop in te stellen Vervolgens selecteert u drie gezichtsvelden binnen een straal van een halve centimeter voor confocale beeldvorming met meerdere posities en stelt u een Z-stapel in op het bereik van 10 tot 12 micrometer en de time lapse-acquisitie om elke minuut te lopen. Na drie minuten van beeldvorming, injecteren 200 microliter van monocyten via de inline luer injectie poort en beginnen met het imaging van de cellulaire interactie. Na ten minste 30 minuten stopt u de beeldvorming en de stroom en klemt u de slang zodat deze van de glijbaan kan worden losgekoppeld.Als u de transmigratiesnelheid van de cellen wilt bepalen via de gestimuleerde HUVECs, opent u afbeelding J en telt u het totale aantal aanhangende monocyten in elk veld om het aantal cellen per vierkante millimeter te bepalen. Tel vervolgens het aantal transmigreerde monocyten die aanwezig zijn in het basale vlak onder de endotheelcellen, zoals geïdentificeerd door de aanwezigheid van een zwarte gatzone rond de kern. Een eenvoudige manier om de activeringsstatus van de HUVECs na stimulatie te controleren, is door hun verlenging onder ontstekingsstress te visualiseren.Time lapse confocale beeldvorming maakt visualisatie van de monocyten op het apicale vlak waar hun fenotype kan worden beoordeeld. Migrerende cellen die transmigratie ondergaan, worden verplaatst naar de intercellulaire cel-naar-celverbinding voordat ze uit het apicale vlak verdwijnen en opnieuw in het basale vlak verschijnen. De kwantificering van de monocyte rekrutering in de loop van de tijd bevestigt dat monocyten adhesie wordt gevolgd door transmigratie.De transmigratiesnelheid van CD16 positieve monocyt is laag wanneer de endotheelcel alleen met TNF alpha wordt gestimuleerd, maar toeneemt wanneer de endotheelcellen worden gestimuleerd met zowel TNF alfa als vasculaire endotheelgroeifactor of VEGFA. HUVEC stimulatie met TNF alpha en TNF alpha plus VEGFA induceert een toename van de hechting aan CD14 negatieve T, B en NK cellen, te vergelijken met CD14 positieve monocyten. Bovendien induceert HUVEC-stimulatie alleen transmigratie van de monocytenpopulatie, omdat T-, B- en NK-cellen niet transmigreren onder TNF-alfa- of TNF-alfa- plus VEGFA-stimulerende omstandigheden.Om een optimale monocyte recruitment test uit te voeren, is het belangrijk dat u uw experiment van tevoren plant en op dezelfde dag doet. En als je de cellen zuivert, zorg er dan voor dat je microscoop op 37 graden is, zodat je de cellen niet op verschillende temperatuur overbrengt tijdens het experiment. Om deze procedure te leren, kunnen alle methoden zoals de profilering van HUVEC cytokine en chemokine expressie evenals chemotaxis studies worden uitgevoerd om aanvullende vragen over het moleculaire mechanisme dat de transmigratie en hechting van specifieke monocyten populatie te ondersteunen beantwoorden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...