Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
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Wir danken Dr. Paul Bradfield Manuskript lesen und Feedbacks. A. S. erhielt finanziellen Unterstützung von der Sir Jules Thorn gemeinnützige Overseas Trust reg.,

Mit der Einwilligung von freiwilligen Spendern und in Übereinstimmung mit den schweizerischen Ethikkommissionen zur klinischen Forschung wurden menschliche Materialien verwendet.
1. Isolierung und Einfrieren der menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS)
<ol><li>Fügen Sie 5 mL der Beschichtungslösung vor Einleitung eines HUVECS Isolierung T75 Kolben (0,1 mg/mL Kollagen G und 0,2 % Gelatine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung PBS-Puffer bei pH 7,4) für 30 min bei 37 ° C hi...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

Hier berichten wir über eine Methode, die eine Studie über wie Monocyte Subpopulationen durch die entzündeten endotheliale Monolage transmigrate Detaillierung. Die besprochene Methode verwendet konfokalen Mikroskopie statt Phasenkontrast-Mikroskopie, die genutzt wird um Monocyte Rekrutierung unter Strömung3,11,19zu untersuchen. Ein großer Vorteil der konfokalen Mikroskopie für Zeitraffer-Aufnahmen mit ist die Fähigkeit zu...

Monozyten bilden eine phagocytic Komponente der angeborenen Immunität, die wichtig für die Bekämpfung von Krankheitserregern, Bereinigen von beschädigtem Gewebe, Angiogenese und der Pathophysiologie von vielen Krankheiten, einschließlich Krebs1,2,3 . Monozyten sind Knochenmark gewonnenen Zellen bestehend aus heterogener Subpopulationen, die im Blut zirkulieren, aber können an den Ort der Entzündung im peripheren Gewebe durch spezifische molekulare Mechanismen rekrutiert werden. Die Rekrutierung Kaskaden von Monozyten, wie bei Leukozyten impliziert in der Regel verschiedene Schritte einschließlich der Erfassung, Rollen, krabbeln, Verhaftung, Transendothelial Migration (Seelenwanderung) und Migration durch die Gefäßwand (Basalmembran und Wandbild Zellen)4. Diese Schritte beinhalten vor allem Entzündungen-induzierte Moleküle auf der endothelialen luminalen Oberfläche z. B. Selectins Glykoprotein Liganden, Chemokine, Knoten und interzelluläre Adhäsionsmoleküle und ihre Rezeptoren auf Leukozyten wie Selektin-Liganden und Integrine. Handel Wege über entweder die Endothelzellen Kreuzungen (parazellulär) oder über die endotheliale Zellkörper (transzelluläre) lässt sich die endotheliale Barriere5überqueren von Leukozyten. Während Monozyten historisch dokumentiert worden sind, um durch die transzelluläre Route transmigrate wurden mögliche Unterschiede in ihren wandernden Weg da Monozyten nicht mehr als eine homogene Zellpopulation gelten vorgeschlagen. Es wird jetzt klar, dass Monocyte Vielfalt kann von jedem ihrer Unterschiede und Gemeinsamkeiten definiert werden, in Bezug auf ihre unverwechselbare Extravasation Kaskaden3,6. Daher, um eindeutig zwischen Monocyte Subpopulationen unterscheiden, ist es entscheidend, zu visualisieren und Phänotyp das Verhalten der einzelnen von diesen verschiedenen Subpopulationen während der Rekrutierung verarbeiten.
Monozyten von Mensch, Schwein, Ratte und Maus waren unterteilt in phänotypischen Subpopulationen mit bestimmten zugeschriebenen Funktionen und spezielle wandernden Verhaltensweisen7,8,9. Beispielsweise können beim Menschen, Monozyten drei Teilmengen basierend auf deren Oberflächenexpression von CD14, ein Coreceptor für bakterielle Lipopolysaccharid und CD16, den Fc-Gamma-Rezeptor III unterteilt werden. Menschliche Monocyte Subpopulationen gehören klassische CD14+CD16-, Mittelstufe CD14+CD16+ und nicht-klassischen CD14dimCD16+ 6,9Zellen. Die klassische CD14+CD16– Monozyten erwiesen sich vor allem entzündliche während der Pool von CD16+ Monozyten fanden sich kollektiv TIE2 Ausdruck und Proangiogenic Funktion10zu präsentieren. Konsequent, Endothelzellen Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen wie menschliche Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α oder Interleukin (IL-1) Beta (konventionelle Entzündung) ist ausreichend, um die komplette Einstellung von klassischen CD14 auslösen+CD16 – Monozyten. Simultane Aktionen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) A und TNF (angiogenen Faktoren angetrieben Entzündung) sind jedoch erforderlich, um die Seelenwanderung die CD16 provozieren+ Proangiogenic Pool von Monozyten3. Historisch gesehen, das traditionelle Transwell-System unter statischen Bedingungen, die parallelen Platten Strömungsraum und die µ-Folie Fluss Kammern wurden verwendet, um quantitativ zu analysieren, die Rekrutierung von Leukozyten eine Bevölkerung an eine Zeit in-vitro-11 ,12,13. Während diese Protokolle validiert wurden, würde eine robustere Methode, die erlaubt die simultane Analyse von mehreren Monocyte Subpopulationen einsichtsvolleren betrachtet werden. Solche Methoden müssen mehrere Interaktionen und die unterschiedlichen Frequenzen jedes jeweiligen Bevölkerung ausmachen und auch bieten ein mechanistisches Verständnis für die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten für die Rekrutierung-Kaskaden, die jede Monocyte definieren Teilmenge.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode basiert auf der Time-Lapse Bildgebung der Monocyte Rekrutierung durch fließen, wodurch die wandernden Kaskaden von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig untersucht werden, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Diese Methode integriert bestimmte kritische Funktionen, die Endothelzellen Entzündung sowie die Hämodynamik des zirkulierenden Monozyten in Post-Kapillaren Venolen, am Hauptstandort der Leukozyten Rekrutierung in vivo zu imitieren. Die vorgeschlagene Methode verwendet menschliche Nabelader Endothelzellen (HUVECS), die durch ein etabliertes Protokoll der Isolation von menschlichen Nabelschnur erzeugt werden. Diese klinische Ressource hat den Vorteil des Seins leicht zugänglich als Nebenprodukt biologischer, während auch eine vernünftige Rendite von Endothelzellen, die von der Nabelader isoliert werden können. Wir auch zur Fluoreszenz-Farbstoffen und Immunfluoreszenz Unterscheidung der verschiedenen zellulären Komponenten und konfokalen Mikroskopie eindeutig definieren Monocyte Positionierung (luminalen vs. abluminalen) im Laufe der Zeit. Die hier vorgestellten Protokoll wurde gleichzeitig messen die Seelenwanderung Ebenen der Monocyte Subpopulationen entwickelt. Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass diese Methodik auf um andere Leukozyten-Subpopulationen und Einstellungsverfahren zu studieren erweitert werden kann, durch Einsatz von verschiedenen Biomarker und Kennzeichnung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

Die Rekrutierung von Monozyten aus dem Blut zu gezielten peripheren Geweben ist entscheidend für den Entzündungsprozess bei Gewebeverletzungen, Tumorentstehung und Autoimmunerkrankungen. Dies wird durch einen Prozess der Aufnahme von freien Informationsfluss auf der luminalen Oberfläche des aktivierten Endothelzellen, gefolgt von ihrer Haftung und Transendothelial Migration (Seelenwanderung) in das darunter liegende Gewebe der betroffenen erleichtert. Allerdings sind die Mechanismen, die die bevorzugte und Kontext-abhängige Einstellung von Monocyte Subpopulationen unterstützen noch nicht vollständig verstanden. Daher haben wir eine Methode entwickelt, die ermöglicht die Einstellung von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig visualisiert und unter Strom gemessen werden. Diese Methode, basierend auf Time-Lapse confocal Imaging ermöglicht die eindeutige Unterscheidung zwischen Anhänger und transmigrated Monozyten. Hier beschreiben wir, wie diese Methode verwendet werden kann, um gleichzeitig die Rekrutierung Kaskade von Pro-angiogenen und nicht-angiogenen Monozyten in-vitro-Studie. Darüber hinaus kann diese Methode erweitert werden, um die verschiedenen Schritte der Rekrutierung von bis zu drei Monocyte Populationen zu studieren.

Ermitteln des Status der HUVECS Aktivierung durch TNF induziert
Die Bio-Aktivität von inflammatorischen Zytokinen TNF können je nach Charge und die Kalorienzahl Einfrieren Auftauen Zyklus. Es ist wichtig, um den Aktivierungsstatus der HUVECS mit TNF-Behandlung zu überprüfen. Dies könnte durch Färbung einige Proben von konfluierende HUVECS für die entzündliche Induktion Selectins, ICAM-1 und VCAM-1...

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Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Denn diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entzündung und Immunologie zu beantworten. Zum Beispiel, was sind die molekularen Mechanismus der Leukozytenadhäsion und trans-endotheliale Migration. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine unbegrenzte Anwendungsdiskriminierung zwischen Transmigration und starker Zugabe von Monozyten zu endotheliaalen Monolayern ermöglicht.Obwohl diese Methode Informationen über die Rekrutierung von Monozyten auf dem Fluss liefert, kann sie auch an andere Zellen der hämatopoetischen Systeme wie T-Zellen, B-Zellen oder Derivate von Subpopulationen angepasst werden. Nach dem Waschen die humanen Nabelvenen-Endothelzellen oder HUVEC mit 30 Mikrolitern 37 Grad Celsius M199 Medium mit einem Mikromolaren CMFDA für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid ergänzt. Am Ende der Inkubation die Zellen mit 150 Mikrolitern komplettem M199-Medium waschen und die Kultur in 150 Mikroliter frischem m199-Medium für weitere 30 Minuten inkubieren.Dann ersetzen Sie den Überstand durch 150 Mikroliter komplettes M199-Medium, das die entsprechenden experimentellen Ergänzungen enthält, und geben Sie die Diakammerkultur für sechs Stunden an den Inkubator zurück. Zur isolierung der menschlichen PAN-Monozyten eine frisch entnommene Blutprobe in PBS, ergänzt mit einer Millimolar-EDTA im Verhältnis eins zu eins, verdünnen und sorgfältig 20 ml der Blutlösung auf 20 ml Dichtegradientenmedium schichten, um die Dichte gradienten durch Zentrifugation zu trennen. Sammeln Sie die mittlere periphere mononukleäre Blutplättchenschicht in eine neue 50 ml Tube mit 40 ml PBS, ergänzt mit 1 Millimolar EDTA, und bringen Sie das Endvolumen mit zusätzlicher PBS-EDTA auf 50 ml Nach dem Zählen isolieren Sie die Monozyten mit dem PAN Monozyten-Isolationskit gemäß der Anweisung des Herstellers.Und waschen Sie die Zellen dreimal in M199 Medium ergänzt mit 0.5%Bovine Serum Albumin, oder BSA, um alle Spuren von EDTA zu beseitigen. Die Qualität der Monozytenisolation ist entscheidend für die Gewährleistung eines robusten Transmigrations- und Haftungsergebnisses. Daher ist es wichtig, die Empfehlung des Herstellers für die Isolierung strikt zu befolgen.Setzen Sie das Pellet bei 6 mal 10 bis 6 Monozyten pro ml Konzentration in frischem M199-Medium, ergänzt mit 0,5%BSA, wieder auf und teilen Sie die Zellen in einen 200-Mikroliter-Aliquot pro Mikrozentrifugenrohr pro Rekrutierungstest auf. Dann legen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten vor ihrer Injektion in die Strömungskammer. Um das Fluidsystem für die Analyse vorzubereiten, legen Sie zunächst einen männlichen Luer-Stecker in ein Ende eines 8 cm langen 3 mm dicken Stücks Silikonschläuche ein und verbinden das andere Ende mit einem Inline-Luer-Injektionsset.Dann verbinden Sie den Luer-Stecker an einem Ende eines 40 cm langen 3 mm dicken Stück Silikonrohres. Als nächstes die 20 mm Spritze an ein Ende eines 1 m langen 3 mm dicken Stück Silikonschlauchs und legen Sie einen männlichen Luer-Stecker an das andere Ende. Dann legen Sie beide männlichen Luer-Steckverbinder in eine weibliche Luer-Lock-Kupplung und legen Sie das freie Ende der Silikonschläuche in ein Reservoir von 37 Grad Celsius M199 Medium ergänzt mit 0.5%BSA.Ziehen Sie den Kolben ein, um den Schlauch mit einem Durchflusspuffer zu füllen, und sichern Sie die Spritze an der Spritzenpumpe. Stellen Sie dann die Pumpe in den Rückzugsmodus ein und geben Sie den Durchfluss an. Um die Schiebekammer zu verbinden, klemmen Sie die Silikonschläuche um den weiblichen Luer-Lock-Koppler und trennen Sie die beiden Luer-Stecker-Männchen von der Kupplung, damit sie mit dem Reservoir des Schlittens verbunden werden können.Luftblasen stören nicht nur die Bildqualität, sondern induzieren auch Kapillarstress in den Zellen, was zum Zelltod führt. Um Luftblasen zu vermeiden, bestätigen Sie die korrekte Klemmung des Schlauches, bevor Sie den Luer in das Reservoir einsetzen. Entfernen Sie dann die Klemmen, um zu bestätigen, dass die Verbindung nicht undicht ist, und stellen Sie den Schlitten unter das Mikroskop.Zur Abbildung der Monozytenrekrutierung unter Fluss, fügen Sie 5 Mikroliter Mehleszenz konjugiert Anti CD16 Antikörper und einen geeigneten Kernfarbstoff zu jedem Aliquoted Monozyten für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur und sammeln die Zellen mit einer kurzen Zentrifugation. Das Pellet in 250 Mikroliter Durchflusspuffer aussetzen und die Spritzenpumpe starten. Fügen Sie 30 Mikroliter einer Monozytensuspension in eine Kammer des Dias und wählen Sie das 40X Objektiv auf dem konfokalen Mikroskop.Aktivieren Sie die entsprechenden Fluoreszenzlaser und verwenden Sie die Kammer mit der beschrifteten Monozyten, um die Erfassungsparameter des konfokalen Mikroskops Next einzustellen, wählen Sie drei Sichtfelder innerhalb eines halben Zentimeterradius für die konfokale Bildgebung mit mehreren Positionen aus und legen Sie einen Z-Stack auf den Bereich von 10 bis 12 Mikrometern und die Zeitraffererfassung alle eine Minute fest. Nach drei Minuten Der Bildgebung injizieren Sie 200 Mikroliter Monozyten durch den Inline-Luer-Injektionsport und beginnen Sie mit der Bildgebung der zellulären Interaktion. Stoppen Sie nach mindestens 30 Minuten die Bildgebung und den Durchfluss und klemmen Sie die Schläuche, damit sie vom Schlitten getrennt werden können.Um die Transmigrationsrate der Zellen über die stimulierten HUVECs zu bestimmen, öffnen Sie Bild J und zählen Sie die Gesamtzahl der anhaftenden Monozyten in jedem Feld, um die Zellzahl pro Quadratmillimeter zu bestimmen. Zählen Sie dann die Anzahl der transmigrierten Monozyten, die in der Basalebene unter den Endothelzellen vorhanden sind, die durch das Vorhandensein einer Schwarzen Lochzone um den Kern identifiziert werden. Eine einfache Möglichkeit, den Aktivierungsstatus der HUVECs nach der Stimulation zu überprüfen, ist die Visualisierung ihrer Dehnung unter Entzündungsstress.Die konfokale Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung der Monozyten auf der apikalen Ebene, auf der deren Phänotyp beurteilt werden kann. Migrierende Zellen, die sich einer Transmigration unterziehen, bewegen sich zum interzellulären Zell-zu-Zell-Knoten, bevor sie von der apikalen Ebene verschwinden und in der Basalebene wieder auftauchen. Die Quantifizierung der Monozytenrekrutierung im Laufe der Zeit bestätigt, dass auf die Monozytenadhäsion eine Transmigration folgt.Die Transmigrationsrate von CD16-positiver Monozyten ist niedrig, wenn die Endothelzelle nur mit TNF alpha stimuliert wird, erhöht sich aber, wenn die Endothelzellen sowohl mit TNF alpha als auch mit vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor oder VEGFA stimuliert werden. DIE HUVEC-Stimulation mit TNF alpha und TNF alpha plus VEGFA induziert eine Erhöhung der Adhärenz mit CD14-negativen T-, B- und NK-Zellen, verglichen mit CD14-positiven Monozyten. Darüber hinaus induziert die HUVEC-Stimulation nur eine Transmigration der Monozytenpopulation, da T-, B- und NK-Zellen weder unter TNF-Alpha- noch Untertanen-Alpha- oder TNF-Alpha- plus VEGFA-Stimulierenüberkieferbedingungen umwandern.Um einen optimalen Monozyten-Rekrutierungstest durchzuführen, ist es wichtig, dass Sie Ihr Experiment im Voraus planen und es am selben Tag tun. Und wenn Sie die Zellen reinigen, stellen Sie sicher, dass Ihr Mikroskop bei 37 Grad ist, damit Sie die Zellen während des Experiments nicht auf eine andere Temperatur übertragen. Um dieses Verfahren zu lernen, können alle Methoden wie die Profilierung von HUVEC-Zytokin- und Chemokin-Expression sowie Chemotaxis-Studien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den molekularen Mechanismus zu beantworten, die die Transmigration und Adhäsion einer bestimmten Monozytenpopulation aufrecht erhalten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

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Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

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Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...