Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
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博士ポール ブラッドは、原稿を読むとフィードバックを感謝いたします。A. S. デマンドレギュレーター サー ジュールとげ慈善海外信用、財政支援を受けてください。

人間の材料は、ボランティア ドナーとスイス臨床研究倫理委員会に従ってインフォームド・コンセントと使用されました。
1. 分離と凍結ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (株)
<ol><li>螢光分離を開始する前に、37 ° C で 30 分間 T75 フラスコ (0.1 mg/mL コラーゲン G とリン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 PBS で 0.2% のゼラチン) にコーティング溶液 5 mL を追加します。</li>
	<li>PBS のコードを?...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

単球サブポピュレーションが炎症血管内皮膜を通して生まれ変わる方法の研究を詳述した手法を報告する.議論の方法は、位相差顕微鏡検査、また、単球の流れ3,11,19の下で採用を検討するものです代わりに共焦点顕微鏡を使用しました。タイムラプス イメージング用共焦点顕微鏡を使用しての主な利点の 1 つは、輪廻と単...

単球は、損傷した組織、血管新生、癌1,2,3 を含む多くの疾患の病態をクリーンアップする病原体と戦うために不可欠な免疫の貪食コンポーネントを構成します。.単球は骨髄由来細胞が血液中を循環するが、特定の分子機構を末梢組織における炎症のサイトに募集することができます異種の集団から成る。白血球は、単球の募集カスケードは一般に、キャプチャ、圧延、クロール、逮捕、内皮下浸潤 (輪廻)、血管壁 (基底膜と壁画を通じて移行などの異なる手順を関係づけるセル)4。これらの手順は主にセレクチンのリガンドなどの白血球に注目している、糖タンパク質リガンド、ケモカイン、細胞と接合部の接着分子、その受容体など、内皮細胞内腔で炎症誘起分子を含むインテグリンです。血管内皮細胞の接合点 (傍細胞) や内皮細胞体 (transcellular) を通じて人身取引の経路は、内皮バリア5を横断する白血球により使用できます。単球は歴史的に transcellular ルートを通じて霊界に記載されている、しながら、単球はもはや均質の細胞集団を考えられているように、渡り鳥の経路に潜在的な相違が提案されている.多様性単球ごとの相違点と共通点の定義することができます、彼らの独特の血管外漏出に対するカスケード3,6ことが明らかとなりつつあります。したがって、明確に、単球集団間差別するために可視化することが重要だし、募集中のこれらの異なる集団のそれぞれの行動の表現型を処理します。
人間から単球、ブタ、ラット、マウス特定の生得的機能と特定の渡り鳥動作7,8,9形質集団に分割されました。たとえば、ヒトでは、単球が細菌リポ多糖のコレセプター CD14、CD16、Fc γ レセプター III の表面表現に基づく 3 つのサブセットに分けることが。ひと単球のサブポピュレーションを含めるクラシック CD14+CD16-、CD14 を中間+CD16+と非古典的 CD14薄暗いCD16+細胞6,9。古典の CD14+CD16-単球は、主に炎症性であることを示したに対し CD16 のプール+単球は現在 TIE2 発現と血管新生関数10総称して発見されました。一貫して、人間の腫瘍の壊死などの炎症性サイトカインと内皮細胞刺激因子 (TNF) α やインターロイキン (il-1) ベータ (従来の炎症) は古典的な CD14 の完全な募集をトリガーするのに十分な+CD16-単球。ただし、血管内皮増殖因子 (VEGF) と tnf α (血管新生因子による炎症) の同時作用が、CD16 の輪廻を挑発する必要+単球3の血管新生プール。歴史的には、伝統的な Transwell 静的な条件、平行平板の流れ区域や μ スライド流室制度は、時間の in vitro11 で 1 つの末梢血白血球ポピュレーションの募集を定量的に解析に使用されています。 ,12,13。これらのプロトコルを検証しながら複数の単球サブポピュレーションの同時解析を許可より強固な方法がより洞察力があると見なされます。このような手法必要があります複数の対話および各それぞれの人口の異なる周波数のアカウントし、類似点と特異性のメカニズムの理解は、各単球を定義する募集カスケードサブセット。
同時に共焦点顕微鏡を用いた研究に異なる単球サブポピュレーションの渡り鳥のカスケードを可能にする流動場下における単球採用のタイムラプス イメージングに基づく方法を紹介します。このメソッドは、単球後毛細血管細静脈の循環の血行動態、白血球動員の生体内での主要な場所と同様に、血管内皮細胞炎症を模倣する特定の重要な機能を統合します。提案手法は、ひと臍帯からの分離の確立されたプロトコルを介して生成されるひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) を使用します。この臨床のリソースも臍静脈から分離でき、血管内皮細胞の合理的な利回りを提供しながら生物学的副産物として簡単に利用できるという利点があります。我々 も蛍光色素や蛍光を別の細胞成分と共焦点顕微鏡による単球の位置 (abluminal 対内腔) の明確な定義を区別する使用時間をかけて。ここで提示されたプロトコル開発した同時に測定する単球サブポピュレーションの転生レベル。また、他の白血球サブポピュレーションや採用プロセスを研究するこの方法を異なるバイオ マーカーおよびラベルの使用によって拡張できることに注意してください。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

ターゲットの末梢組織に血液中から単球の採用は、組織の損傷、腫瘍の開発、自己免疫疾患の中に炎症性プロセスに不可欠です。これは、基になる影響を受ける組織に接着や内皮下移行 (輪廻) が続いて活性化の内皮細胞の管腔表面に自由な流れからのキャプチャのプロセスによって実現されます。ただし、単球サブポピュレーションの優遇とコンテキスト依存の募集をサポートするメカニズムはまだ完全に理解しました。そこで、同時に可視化し、流動場下における測定に異なる単球サブポピュレーションの採用を可能にする方法を開発しました。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージング、に基づいて、このメソッドは明確な付着性と転生の球を区別することができます。ここでは、このメソッドを使用して、同時にプロ血管新生と血管新生の非単球の in vitro の募集カスケードを勉強する方法について述べる。さらに、このメソッドは、最大 3 つの単球集団のリクルートの別の手順を勉強する拡張できます。

Tnf α によって誘導される血管内皮活性化の状態の判断
炎症性サイトカイン tnf α の生物活性は、バッチと凍結融解サイクルの補充によって異なります。Tnf α の治療と血管内皮のライセンス認証の状態をチェックすることが重要です。これは、並列に注目している、icam-1 および VCAM 115,...

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Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

ここでは、単球 subpopulation の特定の表面マーカーと共焦点蛍光顕微鏡を用いて in vitro における流動場下における人身売買対策統合のプロトコルを提案する.このプロトコルは、他の特定の表面マーカーを使用して他の白血球のサブタイプをプロファイルとして順次募集手順同様を探索する使用できます。

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

この方法は、炎症と免疫学の分野で重要な質問に答えることができます。例えば、白血球接着と経内皮移動の分子機構は何ですか。この技術の主な利点は、それが半透明単層への単球のトランスマイグレーションと強い付加との間の無制限の使用の差別を可能にすることです。この方法は、流れ上の単球の採用に関する情報を提供するが、T細胞、B細胞、またはその亜集団の誘導体のような造血系の他の細胞にも適応することができる。洗浄後、37°Cおよび5%炭酸ガスで10分間1マイクロモルCMFDAを添加した30マイクロモルM199培地の30マイクロリットルでヒト臍静脈内皮細胞またはHUVECにラベルを付けます。インキュベーションの終わりに、完全なM199培地の150マイクロリットルで細胞を洗浄し、さらに30分間新鮮な完全なM199培地の150マイクロリットルで培養をインキュベートします。次に、上清を適切な実験用サプリメントを含む完全なM199培地の150マイクロリットルに交換し、スライドチャンバー培養液を6時間インキュベーターに戻します。ヒトPAN単球単球分離の場合、1対1の比率で1ミリモルEDTAを添加したPBSで採取した新しい血液サンプルを希釈し、遠心分離による密度勾配分離のために20mlの密度勾配培地上に20mlの血液溶液を慎重に層化する。中末梢血単核細胞血小板層を1ミリモルEDTAで補った40mlのPBSを含む新しい50mlチューブに集め、追加のPBS-EDTAで最終体積を50mlに持ち込み、数えた後、メーカーの指示に従ってPAN単球分離キットで単球を単球に分離する。そして、0.5%牛血清アルブミン、またはBSAを添加したM199培地で細胞を3回洗浄して、EDTAの痕跡を排除する。単球分離の品質は、堅牢なトランスマイグレーションと接着結果を確保するために重要です。したがって、分離のためのメーカーの勧告に厳密に従うことが重要です。0.5%BSAを補充した新鮮なM199培地中のml濃度当たり6倍の10倍の10回でペレットを再懸濁し、細胞を採用アッセイ当て試算1回当たりのマイクロ遠心分離管当たり1つの200マイクロセントリコートに分割する。その後、フローチャンバーへの注入の前に20分間、セルを摂氏37度に置きます。分析用の流体システムを準備するには、まず、長さ8cmの3mm厚いシリコンチューブの一方の端にオスのルアーコネクタを挿入し、もう一方の端をインラインルアーインジェクションセットに接続します。その後、ルアーコネクタを長さ40cmの3mm厚いシリコンチューブの一端に接続します。次に、20mmシリンジを長さ1mの厚さ3mmのシリコンチューブの一方の端に、オスのルアーコネクタをもう一方の端に挿入します。次に、両方の男性ルアーコネクタを女性のルアーロックカプラに挿入し、シリコーンチューブのフリーエンドを0.5%BSAを補った37°CM199培地の貯水池に入れ。プランジャーを引き込んで、チューブをフローバッファで満たし、シリンジポンプのシリンジを固定します。次に、ポンプを引き出しモードに設定し、流量を指定します。スライドチャンバーを接続するには、女性のルアーロックカプラの周りにシリコーンチューブをクランプし、それらをスライドのリザーバに接続できるようにカプラーから2つのルアーコネクタオスを取り外します。気泡は画質を乱すだけでなく、毛細血管の薄いストレスを細胞に誘導し、細胞死を引き起こす。気泡を避けるために、貯蔵所にルアーを挿入する前に管の正しいクランプを確認しなさい。次にクランプを取り外して、接続が漏れていないことを確認し、スライドを顕微鏡の下に置きます。フロー下での単球募集のイメージングのために、5マイクロリットルの蛍光結合抗CD16抗体と適切な核染色を各アリクォート単球に室温で10分間インキュベーションし、短い遠心分離で細胞を収集する。250マイクロリットルのフローバッファでペレットを再懸濁し、シリンジポンプを開始します。スライドの1つのチャンバーに1つの単球懸濁液の30マイクロリットルを加え、共焦点顕微鏡の40X目的を選択します。適切な蛍光レーザーをアクティブにし、ラベル付き単球でチャンバーを使用して共焦点顕微鏡の取得パラメータを設定する次へ、マルチポジション共焦点イメージングのために半径半センチメートル以内の3つの視野を選択し、Zスタックを10〜12マイクロメートルの範囲に設定し、時間取得を1分ごとに実行します。3分間のイメージングの後、インラインルアー注入口を通して200マイクロリットルの単球を注入し、細胞相互作用のイメージングを開始する。少なくとも30分後、撮像と流れを止め、チューブをクランプしてスライドから切り離せるようにします。刺激されたHUVECを介した細胞の転写速度を決定するために、画像Jを開き、各フィールドの接着単球の総数をカウントして、1平方ミリメートルあたりの細胞数を決定する。次に、核の周りにブラックホールゾーンが存在することによって識別されるように、内皮細胞の下の基底面に存在するトランスマイグレーションされた単球の数を数えます。刺激後のHUVECsの活性化状態を確認する簡単な方法は、炎症性ストレス下でのそれらの伸びの視覚化です。タイムラプス共焦点イメージングは、その表現型を評価することができる尖体面での単球の可視化を可能にする。トランスマイグレーションを受けている移動細胞は、尖体面から消失して基底面に再び現れる前に、細胞間細胞間接合部に移動する。時間の経過に伴う単球の採用の定量化は、単球接着が続いてトランスマイグレーションされることを確認する。CD16陽性単球のトランスマイグレーション率は、内皮細胞がTNFアルファのみで刺激される場合には低いが、内皮細胞がTNFアルファおよび血管内皮成長因子またはVEGFAの両方で刺激されると増加する。TNFαおよびTNFアルファ+VEGFAを有するHUVEC刺激は、CD14陰性T、BおよびNK細胞への付着の増加を誘導し、CD14陽性単球と比較する。さらに、HUVEC刺激は、T、BおよびNK細胞がTNFアルファまたはTNFアルファプラスVEGFA刺激条件下でトランスマイグレーションを行わないので、単球集団の単球集団の単一の移動のみを誘導する。最適な単球採用アッセイを行うには、実験を事前に計画し、同じ日に行うことが重要です。また、細胞を精製する際には、実験中に細胞を異なる温度に変換しないように、顕微鏡が37度であることを確認してください。この手順を学ぶために、HUVECサイトカインおよびケモカイン発現のプロファイリングおよび化学血軸研究のようなすべての方法は、特定の単球集団の移行および接着を維持する分子メカニズムに関する追加の質問に答えるために行うことができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...