Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
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우리 감사 박사 폴 Bradfield 원고 읽기 및 피드백. A. S.는 선생님 쥘 가시 자선 해외 신뢰 등록에서 재정 지원을 받은

인간의 재료 자원 봉사 기증자의 및 임상 연구에 스위스 윤리 위원회에 통지 해준 동의 함께 사용 되었다.
1. 격리와 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)
<ol><li>HUVEC 절연을 시작 하기 전에 코팅 솔루션의 5 mL는 T75 플라스 크 (0.1 mg/mL 콜라겐 G 및 인산 버퍼 pH 7.4에서 염 분 PBS에 0.2% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분을 추가 합니다.</li>
	<li>PBS 가진 코드를 청소, 살 균 압축으로 닦 고 살 ...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

여기, 우리가 어떻게 monocyte 모집단 염증이 내 피 단층을 통해 transmigrate의 연구를 자세히 설명 하는 방법 보고. 토론된 방법 단계 대조 현미경 검사 법, 또한 흐름3,,1119monocyte 모집을 공부 하는 데 사용 되는 대신 confocal 현미경 검사 법을 사용 합니다. 시간 경과 영상에 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여의 주요 장점 중 하나는 ...

Monocytes의 병원 체, 손상 된 조직, 신생, 고 암1,2,3 포함 하 여 많은 질병의 병 태 생리학 정리 싸움을 위해 필수적 이다 타고 난 면역 phagocytic 구성 요소 구성 . Monocytes는 골 수 유래 세포 혈액에 순환 하지만 특정 분자 메커니즘을 통해 주변 조직에 염증의 사이트에 채용 될 수 있는 다른 유형의 모집단의 구성 이다. Monocytes, 백혈구에 관해서는 모집 캐스케이드 일반적으로 다른 단계 캡처, 압 연, 크롤링, 체포, transendothelial 마이그레이션 (환생) 및 혈관 벽 (지하실 멤브레인와 벽화를 통해 마이그레이션 등 연루 셀)4. 다음이 단계는 주로 ligands selectin 같은 백혈구에 풀, 당단백질 ligands, 발산, 세포 및 접합 접착 분자, 그리고 그들의 수용 체와 같은 내 피 luminal 표면에 염증 유발 분자를 포함 그리고 integrins입니다. 밀매 경로 중 하나는 내 피 세포 접합 (paracellular) 나 내 피 세포 체 (transcellular)를 통해 백혈구에 의해 내 피 장벽5를 사용할 수 있습니다. Monocytes transcellular 경로 통해 transmigrate를 역사적으로 문서화 되어, 하는 동안 그들의 철새 통로의 잠재적인 차이점 monocytes 균질 세포 인구 이라고 여겨진다 이상으로 제안 되었습니다. 그것은 이제 분명 monocyte 다양성 각 그들의 차이 공통점에 의해 정의 될 수 있습니다, 그들의 독특한 넘쳐 흐름에 관하여3,6폭포 되고있다. 따라서, monocyte 모집단 사이 차별 명확 하 게 하기 위해 시각화 하는 중요 한 고 형 채용 중이 다른 모집단의 각 동작을 처리.
인간 monocytes, 돼지, 쥐, 마우스 특정 관찰 기능 및 특정 철새 동작7,,89phenotypic 모집단으로 세분화 했다. 예를 들어 인간 monocytes는 CD16, Fc 감마 수용 체 III CD14, 세균성 lipopolysaccharide에 대 한 coreceptor의 그들의 표면 식에 따라 3 개의 하위 집합으로 나눌 수 있습니다. 인간 monocyte 모집단 클래식 CD14 포함+CD16-, CD14 중간+CD16+ 및 비 고전 CD14어둡게CD16+ 세포6,9. 클래식 CD14+CD16- monocytes는 주로 염증 성 표시 했다 반면 CD16 수영장+ monocytes 총칭 TIE2 표현과 proangiogenic 함수10선물을 발견 했다. 일관 되 게, 인간의 종양 괴 사 등 염증 성 cytokines와 내 피 성장 세포 자극 인자 (TNF) α 또는 인터 루 킨 (일리노이-1) 베타 (기존의 염증)은 고전 CD14의 완전 한 신규 모집을 실행 하는 충분 한+CD16 - monocytes입니다. 그러나, 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 TNFα (신생 요소 기반 염증)의 동시 작업은는 CD16의 환생을 자극 하는 데 필요한+ monocytes3의 proangiogenic 풀. 역사적으로, 정적 조건, 병렬 플레이트 흐름 챔버 및 µ-슬라이드 흐름 챔버 전통적인 Transwell 시스템 양적 분석 한 시간에서 시험관에11에 한 백혈구 인구의 모집 하는 데 사용 되었습니다. ,,1213. 이러한 프로토콜을 검증 하는 동안 여러 monocyte 모집단의 동시 분석을 허용 하는 더 강력한 방법 여겨질 것입니다 더 많은 통찰력. 이러한 방법론 여러 상호 작용 및 각 각각의 서로 다른 주파수를 담당 하 고 또한 각 monocyte 정의 하는 모집 계곡에 대 한 유사성과 특이성의 기계적 이해를 제공 해야 합니다. 하위 집합입니다.
여기, 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 동시에 공부 될 다른 monocyte 모집단의 철새 계곡 수 있는 흐름 아래 monocyte 모집의 시간 경과 영상에 따라 방법 제시. 이 방법은 hemodynamics 순환 후 모 세관 venules에 monocytes의 vivo에서 백혈구 신규 모집의 주요 위치 뿐 아니라 내 피 세포 염증, 모방 하는 특정 중요 한 기능을 통합 합니다. 제안 된 방법은 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 탯에서 고립의 잘 설립 된 프로토콜을 통해 생성 되는 사용 합니다. 이 임상 자원 또한 탯 줄 정 맥 으로부터 격리 될 수 있는 내 피 세포의 적당 한 수익률을 제공 하는 반면 생물 학적 부산물로 쉽게 사용할 수 있는 이점이 있다. 우리는 또한 사용 형광 염료와 면역 형광 monocyte 위치 (abluminal 대 luminal) 명확 하 게 정의에 confocal 현미경 검사 법 및 다른 세포질 구성 요소 구분을 시간이 지남에. 여기에 제시 된 프로토콜을 동시에 측정 monocyte 모집단의 환생 레벨 개발 되었습니다. 또한, 그것은 다른 biomarkers 및 라벨의 사용 하 여이 방법론 공부 다른 백혈구 모집단 및 채용 프로세스를 확장할 수 있습니다 주목 해야한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

타겟된 주변 조직에 혈액에서 monocytes의 모집 조직 부상, 종양 개발 및 자가 면역 질환 염증 과정에 중대 하다. 이것은 그들의 접착 및 transendothelial 마이그레이션 (환생) 뒤에 기본 영향을 받는 조직으로 활성화 된 내 피 세포의 표면에 luminal 무료 흐름에서 캡처의 과정을 통해 촉진 된다. 그러나, monocyte 모집단의 특혜와 맞는 채용을 지 원하는 메커니즘은 아직 완전히 이해. 따라서, 다른 monocyte 모집단 동시에 시각화 하 고 흐름에서 측정의 채용을 허용 하는 방법을 개발 했습니다. 시간 경과 confocal 영상에 따라이 메서드는 부착 및 transmigrated monocytes 사이 명확한 구별에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리는이 메서드를 사용 하 수 있습니다 프로 신생 및 비 신생 monocytes 체 외의 모집 캐스케이드를 동시에 공부 하는 방법을 설명 합니다. 또한,이 메서드는 최대 3 개의 monocyte 인구의 신규 모집의 다른 단계를 공부 하 확장할 수 있습니다.

HUVEC 활성화 TNFα에 의해 유도 된의 상태 확인
염증 성 cytokine TNFα의 생물 활동 일괄 처리 및 냉동 녹고 사이클의 반복에 따라 달라질 수 있습니다. 그것은 TNFα 치료와 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 것이 중요입니다. 이 풀, ICAM-1 및 VCAM-115,16,17의 염증 유도 con...

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Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

이 방법을 들어 염증 및 면역학 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들면, 백혈구 접착및 트랜스 내피 이동의 분자 기계장치는 무엇입니까. 이 기술의 주요 장점은 내피 단층층에 트랜스마이그레이션과 모노사이클을 강력하게 추가하는 것 사이의 무제한 사용 차별을 허용한다는 것입니다.이 방법은 흐름상단핵세포의 모집에 대한 정보를 제공하지만, T세포, B세포 또는 이의 소집단의 유도체와 같은 조혈 시스템의 다른 세포에도 적응될 수 있다. 세척 후 인간 배빌레 정맥 내피 세포 또는 HUVEC에 37도 의 마이크로리터 37도 M199 배지를 37°C의 마이크로몰라 CMFDA로 보충하여 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 10분간 라벨을 부착합니다. 인큐베이션이 끝나면 150마이크로리터의 완전한 M199 배지로 세포를 세척하고 150마이크로리터의 신선한 완전 M199 배지에서 30분 간 배양한다.그런 다음 상체를 적절한 실험 보충제를 함유한 완전한 M199 배지의 150 마이크로리터로 대체하고 6시간 동안 슬라이드 챔버 배양을 인큐베이터로 반환한다. 인간 PAN 단화 분리의 경우, PBS에서 갓 수집된 혈액 샘플을 1 대 1 비율로 보충하고 20 ml의 혈액 용액을 밀도 그라데이션 배지에 조심스럽게 층으로 희석하여 원심분리에 의한 밀도 그라데이션 분리를 위한 밀도 그라데이션 배지를 사용한다. 중간 말초 혈액 단핵 세포 혈소판을 1 밀리머 EDTA로 보충한 PBS 40ml를 포함하는 새로운 50ml 튜브로 수집하고 계산 후 추가 PBS-EDTA를 사용하여 최종 볼륨을 50ml로 가져와 제조업체의 지시에 따라 PAN 단핵 분리 키트로 단핵구를 분리합니다.그리고 EDTA의 흔적을 제거하기 위해 0.5%의 소세럼 알부민 또는 BSA로 보충된 M199 배지에서 세포를 세 번 세척한다. 단세포 절연의 품질은 강력한 트랜스마이그레이션 및 접착 결과를 보장하는 데 매우 중요합니다. 따라서 격리에 대한 제조업체의 권장 사항을 엄격히 따르는 것이 중요합니다.0.5%BSA로 보충된 신선한 M199 배지에서 ml 농도 당 6개의 단백구에 6회 10회에서 펠릿을 재연하고, 모집 분석당 마이크로센트리슈지 튜브당 200 마이크로리터 알리쿼트1개로 세포를 나눕니다. 그런 다음 유량 챔버에 주입하기 전에 20 분 동안 37도 섭씨에 세포를 놓습니다. 분석을 위한 유체 시스템을 준비하려면 먼저 8cm 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브의 한쪽 끝에 수컷 루어 커넥터를 삽입하고 다른 쪽 끝을 인라인 루어 주입 세트에 연결합니다.그런 다음 루어 커넥터를 40cm 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브 조각의 한쪽 끝에 연결합니다. 다음으로, 20mm 주사기는 1m 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브의 한쪽 끝에 있고 다른 쪽 끝에 수컷 루어 커넥터를 삽입합니다. 그런 다음 두 남성 루어 커넥터를 암컷 루어 잠금 커플러에 삽입하고 실리콘 튜브의 자유 끝을 섭씨 37도 M199 배지의 저수지에 0.5%BSA로 보충합니다.플런저를 철회하여 튜브를 유동 버퍼로 채우고 주사기 펌프의 주사기를 고정합니다. 그런 다음 펌프를 인출 모드로 설정하고 유량을 지정합니다. 슬라이드 챔버를 연결하려면 여성 루어 잠금 커플러 주위에 실리콘 튜브를 고정하고 커플러에서 두 루어 커넥터 남성을 분리하여 슬라이드의 저장소에 연결할 수 있습니다.기포는 이미지 품질을 방해할 뿐만 아니라 세포에 모세관 깎아지른 듯한 스트레스를 유발하여 세포 사멸을 유발합니다. 기포를 피하기 위해 루어를 저수지에 삽입하기 전에 튜브의 올바른 클램핑을 확인하십시오. 그런 다음 클램프를 제거하여 연결이 누출되지 않는지 확인하고 슬라이드를 현미경 아래에 배치합니다.흐름 하에서 단세포 모집의 화상 진찰을 위해, 밀가루 컨쥬게이징 된 안티 CD16 항체의 5 마이크로 리터와 실온에서 10 분 배양에 대한 각 알리인용 단핵 염료를 추가하고 간단한 원심분리로 세포를 수집합니다. 플로우 버퍼의 250 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 주사기 펌프를 시작합니다. 슬라이드의 한 챔버에 하나의 단핵 현탁액 30 마이크로 리터를 추가하고 공초점 현미경에 40X 목표를 선택합니다.적절한 형광 레이저를 활성화하고 표지된 단세포로 챔버를 사용하여 공초점 현미경의 획득 매개 변수를 설정하고, 다중 위치 공초점 이미징을 위해 반센티미터 반경 반반 내에 3개의 시야필드를 선택하고, Z 스택을 10~12마이크로미터 범위로 설정하고 시간 경과 획득을 1분마다 실행한다. 3분간의 이미징 후 인라인 루어 주입 포트를 통해 200마이크로리터의 단핵구를 주입하고 세포 상호 작용을 이미징하기 시작합니다. 적어도 30분 후에는 이미징과 흐름을 중지하고 튜브를 고정하여 슬라이드에서 분리할 수 있습니다.자극된 HUVECs를 통해 세포의 환원 율을 결정하기 위해, 이미지 J를 열고 각 분야에서 부착 된 단핵구의 총 수를 계산하여 평방 밀리미터당 셀 수를 결정합니다. 그런 다음 핵 주위의 블랙홀 영역의 존재에 의해 확인된 내피 세포 아래 기저 평면에 존재하는 변환된 단핵구의 수를 계산한다. 자극 후 HUVECs의 활성화 상태를 확인하는 간단한 방법은 염증 성 스트레스하에서 신장을 시각화하는 것입니다.시간 경과 공초점 이미징은 표현형을 평가할 수 있는 정평 평면에서 단핵구를 시각화할 수 있습니다. 이동 을 겪고 있는 이동 세포는 세포 간 세포-세포-세포 접합으로 이동한 후 정문 평면에서 사라지고 기저 평면에 다시 나타납니다. 시간이 지남에 따라 단세포 모집의 수량은 단일 세포 접착이 트랜스 마이그레이션 다음에 있음을 확인합니다.CD16 양성 단핵구의 환원율은 내피 세포가 TNF 알파로만 자극될 때 낮지만 내피 세포가 TNF 알파 및 혈관 내피 성장 인자 또는 VEGFA로 자극될 때 증가한다. TNF 알파 및 TNF 알파 플러스 VEGFA를 통한 HUVEC 자극은 CD14 음의 T, B 및 NK 세포에 대한 준수의 증가를 유도하며, CD14 양성 단핵구와 비교한다. 또한, HUVEC 자극은 T, B 및 NK 세포가 TNF 알파 또는 TNF 알파 플러스 VEGFA 자극 조건 하에서 마이그레이션하지 않기 때문에 단세포 집단의 환전을 유도한다.최적의 단세포 채용 분석서를 수행하려면 실험을 미리 계획하고 같은 날에 수행하는 것이 중요합니다. 그리고 세포를 정화할 때 현미경이 37도에 있는지 확인하여 실험 중에 세포를 다른 온도로 옮기지 않도록하십시오. 이 절차를 배우기 위하여는, HUVEC 사이토카인및 chemokine 발현의 프로파일링 과 같은 모든 방법 뿐 아니라 화학요법 연구 결과는 특정 단세포 집단의 환원 및 접착을 유지하는 분자 기계장치에 관하여 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...