Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Vi takker Dr. Paul Bradfield for manuskript leser og tilbakemeldinger. A. S. mottatt økonomisk støtte fra det Sir Jules Thorn veldedige oversjøiske stoler Reg.,

Menneskelige materialer ble brukt med samtykke av frivillige donorer og i samsvar med den sveitsiske komiteer på klinisk forskning.
1. isolering og frysing av menneskelig Umbilical vene endotelceller (HUVEC)
<ol><li>Legge til 5 mL belegg løsning en MT75 kolbe (0,1 mg/mL kollagen G og 0,2% gelatin i fosfat bufret saltvann PBS ved pH 7.4) i 30 min på 37 ° C før du starter HUVEC isolasjon.</li>
	<li>Rengjør ledningen med PBS, tørk av den med sterilt komprimerer og plassere den i et steri...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

Her rapporterer vi en metode detaljering en studie av hvordan monocytt subpopulasjoner transmigrate gjennom den betente endotelial monolayer. Metoden diskutert brukt AC confocal mikroskopi i stedet for fase kontrast mikroskopi, som også brukes til å studere monocytt rekruttering under flyt3,11,19. En stor fordel ved å bruke AC confocal mikroskopi tidsinnstilt bildebehandling er muligheten til å entydig forskjellsbehandle tra...

Monocytter utgjør en phagocytic komponent i medfødt immunitet som er nødvendig for å bekjempe patogener, rydde opp skadet vev og angiogenese i Patofysiologien ved mange sykdommer, inkludert kreft1,2,3 . Monocytter er Ben margtransplantasjon-avledet celler består av heterogene subpopulasjoner som sirkulerer i blodet, men kan bli rekruttert til området av betennelse i perifere vev gjennom bestemte molekylære mekanismer. Rekruttering kaskader av monocytter, som leukocytter, impliserer fremgangsmåten inkludert fange, rullende, krypende, arrestasjon, transendothelial overføring (transmigration) og overføring gjennom fartøyet veggen (kjelleren membran og veggmaleri celler)4. Disse trinnene omfatter hovedsakelig betennelse-indusert molekyler på endothelial luminal overflaten som selectins, glykoprotein ligander, chemokines, junctional og intercellulær adhesjon molekyler og deres reseptorer på leukocytter som selectin ligander og integrins. Menneskehandel veier gjennom enten endothelial celle veikryss (paracellular) eller via endothelial celle kroppen (transcellular) kan brukes av leukocytter for å krysse endothelial barriere5. Mens monocytter historisk dokumentert for å transmigrate gjennom transcellular ruten, er potensielle forskjeller i deres vandrende veien foreslått som monocytter er ikke lenger ansett som en homogen celle befolkningen. Nå blir det klart at monocytt mangfold kan defineres av hver av sine fellestrekk og ulikheter, med hensyn til deres karakteristiske bloduttredelse kaskader3,6. Derfor for å entydig forskjellsbehandle monocytt subpopulasjoner, er det avgjørende å visualisere og fenotypen virkemåten til hver av disse forskjellige subpopulasjoner under rekruttering behandle.
Monocytter fra menneske, gris, rotte og mus var inndelt i fenotypiske subpopulasjoner med visse tilskrives funksjoner og spesifikk vandrende atferd7,8,9. For eksempel i mennesker, kan monocytter deles inn i tre undergrupper basert på deres overflate gjengivelsen av CD14, en coreceptor for bakteriell lipopolysakkarid, og CD16, Fc-gamma reseptoren III. Menneskelige monocytt subpopulasjoner inkluderer klassisk CD14+CD16-, middels CD14+CD16+ og ikke-klassiske CD14dimCD16+ celler6,9. Den klassiske CD14+CD16- monocytter ble vist å være hovedsakelig inflammatorisk mens utvalget av CD16+ monocytter fant kollektivt for å presentere TIE2 uttrykk og proangiogenic funksjonen10. Konsekvent endothelial celle stimulering med inflammatoriske cytokiner som menneskelige tumor nekrose faktor (TNF) α eller interleukin (IL-1) beta (konvensjonelle betennelse) er tilstrekkelig til å utløse komplett rekruttering av klassisk CD14+CD16 - reaksjoner. Men samtidig handlinger av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) A og TNFα (angiogenic faktorer-drevet betennelse) er påkrevd å provosere transmigration av CD16+ proangiogenic pool av monocytter3. Historisk, tradisjonell Transwell systemet under statisk forhold, parallelle plate flow chamber og μ-slide flyt kamrene har blitt brukt kvantitativt analysere rekruttering av en leukocytter befolkningen på en gang i vitro11 ,12,13. Mens disse protokollene har validert, betraktes en mer robust metode som tillater samtidig analyse av flere monocytt subpopulasjoner mer innsiktsfulle. Slike metoder må konto for flere interaksjoner og ulike frekvenser av hver respektive befolkningen og også gi en mekanistisk forståelse av likheter og særegenheter for rekruttering kaskader som definerer hver monocytt delsett.
Her presenterer vi en metode basert på time-lapse avbilding av monocyte rekruttering under flyt som lar den vandrende kaskader av ulike monocytt subpopulasjoner studier samtidig ved hjelp av AC confocal mikroskopi. Denne metoden integrerer visse kritiske funksjoner som etterligner endothelial celle betennelse, samt hemodynamics i sirkulerende monocytter i post kapillært venules, viktigste plasseringen av leukocytter rekruttering i vivo. Den foreslåtte metoden bruker menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVEC), som er generert gjennom en veletablert protokoll isolasjon fra menneskelige kontrollkabler. Denne kliniske ressursen har fordelen av å lett tilgjengelig som et biologisk biprodukt, samtidig gir en rimelig avkastning av endotelceller som kan isoleres fra navle venen. Vi brukte også fluorescerende fargestoffer og immunofluorescence for å skille mellom forskjellige cellulære komponenter og AC confocal mikroskopi utvetydig definere monocytt posisjonering (luminal vs. abluminal) over tid. Protokollen presenteres her er utviklet til samtidig måle transmigration nivåer av monocyte subpopulasjoner. Videre bør det bemerkes at denne metodikken kan utvides for å studere andre leukocytter subpopulasjoner og rekrutteringsprosesser ved bruk av forskjellige biomarkers og merking.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

Rekruttering av monocytter fra blodet til målrettet perifere vev er avgjørende for inflammatorisk prosessen under tissue skade, tumor utvikling og autoimmune sykdommer. Dette er tilrettelagt gjennom en fange fra fri flyt på luminal overflaten av aktivert endotelceller, etterfulgt av folkevandring vedheft og transendothelial (transmigration) i det underliggende berørte vev. Men er mekanismer som støtter fortrinnsrett og kontekst-avhengige rekruttering av monocyte subpopulasjoner fortsatt ikke fullt ut forstått. Derfor har vi utviklet en metode der rekruttering av ulike monocytt subpopulasjoner samtidig visualisert og målt under flyt. Denne metoden, basert på tidsinnstilt AC confocal bildebehandling, gjør entydig skillet mellom tilhenger og transmigrated monocytter. Her beskriver vi hvordan denne metoden kan brukes samtidig studere rekruttering kaskade av pro-angiogenic og ikke-angiogenic monocytter i vitro. Denne metoden kan videre utvides for å studere de ulike trinnene i rekrutteringen av opptil tre monocytt populasjoner.

Bestemme tilstanden i HUVEC aktivering av TNFα
Bio-aktiviteten av inflammatoriske cytokin TNFα kan variere avhengig av batchen og repletion av frysing-tining syklus. Det er viktig å sjekk aktivisering rang av HUVEC med TNFα behandling. Dette kan utføres av flekker parallelt noen prøver av confluent HUVEC for inflammatorisk induksjon av selectins, ICAM-1 og VCAM-115,16...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Her presenterer vi en integrert protokoll som måler monocytt subpopulasjon smugling under flyt i vitro ved bruk av bestemte overflate markører og AC confocal fluorescens mikroskopi. Denne protokollen kan brukes å utforske sekvensiell rekruttering trinn også om profil andre leukocytter subtyper med andre spesifikke overflate markører.

Samtidige studie av rekrutteringen av Monocyte subpopulasjoner Under flyt In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

For denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen betennelse og immunologi. For eksempel, hva er den molekylære mekanismen for leukocytt vedheft og trans-endotelmigrasjon. Den største fordelen med denne teknikken er at det tillater ubegrenset bruk diskriminering mellom transmigrasjon og sterk tillegg av monocytter til endotelmonolag.Selv om denne metoden gir informasjon om rekruttering av monocytter på flyten, kan den også tilpasses andre celler i hematopoetiske systemer som T-celler, B-celler eller derivater av underbefolkning av disse. Etter vask, merk de menneskelige navlestrengende endeotelcellene eller HUVEC med 30 mikroliter på 37 grader Celsius M199 medium supplert med en mikromus CMFDA i 10 minutter ved 37 grader Celsius og 5%Karbondioksid. På slutten av inkubasjonen vask cellene med 150 mikroliter komplett M199 medium og inkubere kulturen i 150 mikroliter friskt komplett M199 medium i ytterligere 30 minutter.Bytt deretter supernatanten med 150 mikroliter komplett M199-medium som inneholder de riktige eksperimentelle kosttilskuddene og returnerer lysbildekammerkulturen til inkubatoren i seks timer. For human PAN monocyttisolasjon, fortynne en nyoppsamlede blodprøve i PBS supplert med en millimolar EDTA med ett til ett forhold og lag forsiktig 20 ml av blodoppløsningen på 20 ml tetthetsgradientmedium for tetthetsgradientseparasjon ved sentrifugering. Samle det midterste perifere blod mononukleære celleplateplatelaget i et nytt 50 ml rør som inneholder 40 ml PBS supplert med 1 millimolar EDTA og bring det endelige volumet til 50 ml med ekstra PBS-EDTA Etter telling, isolere monocytter med PAN monocytt isolasjonssett i henhold til produsentens instruksjon.Og vask cellene tre ganger i M199 medium supplert med 0,5% Storfe Serum Albumin, eller BSA, for å eliminere eventuelle spor av EDTA. Kvaliteten på monocyttisolasjon er avgjørende for å sikre robust transmigrasjon og vedheftsresultat. Dermed er det viktig å følge produsentens anbefaling for isolasjonen nøye.Resuspend pellet på en 6 ganger 10 til 6 monocytter per ml konsentrasjon i frisk M199 medium supplert med 0,5% BSA og dele cellene i en 200 mikroliter aliquot per microcentrifuge tube per rekruttering analyse. Plasser deretter cellene ved 37 grader Celsius i 20 minutter før injeksjonen inn i strømningskammeret. For å forberede det fluidiske systemet for analysen, sett først inn en mannlig luerkontakt i den ene enden av et 8 cm langt 3 mm tykt stykke silikonrør og koble den andre enden til et inline luer injeksjonssett.Koble deretter luerkontakten til den ene enden av en 40 cm lang 3 mm tykk stykke silikonrør. Deretter 20 mm sprøyten til den ene enden av en 1 m lang 3mm tykk stykke silikon rør og sette inn en mannlig luer kontakt til den andre enden. Sett deretter begge mannlige luerkontakter inn i en kvinnelig luerlåskobling og plasser den frie enden av silikonslangen i et reservoar på 37 grader Celsius M199 medium supplert med 0,5%BSA.Trekk stempelet tilbake for å fylle slangen med strømningsbuffer og fest sprøyten på sprøytepumpen. Sett deretter pumpen til uttaksmodus og angi strømningshastigheten. For å koble skyvekammeret, klemme silikon slangen rundt den kvinnelige luer låskobling og koble de to luer kontakt menn fra kobling for å tillate dem å være koblet til reservoaret av lysbildet.Luftbobler forstyrrer ikke bare bildekvaliteten, men induserer også kapillært ren stress til cellene, noe som fører til celledød. For å unngå luftbobler må du kontrollere riktig klemming av slangen før du setter lueren inn i beholderen. Fjern deretter klemmene for å bekrefte at tilkoblingen ikke lekker og plasser lysbildet under mikroskopet.For avbildning av monocyttrekrutteringen under flyt, tilsett 5 mikroliter melkonjugert anti CD16-antistoff og et passende kjernefysisk fargestoff til hver aliquoted monocytter for en 10 minutters inkubasjon ved romtemperatur og samle cellene med en kort sentrifugering. Bruk pelleten på nytt i 250 mikroliter strømningsbuffer og start sprøytepumpen. Legg til 30 mikroliter av en monocytt suspensjon til ett kammer av lysbildet og velg 40X målet på konfokal mikroskop.Aktiver de riktige fluorescerende lasere og bruk kammeret med merket monocytt for å angi oppkjøpsparametrene til det konfokale mikroskopet Neste, velg tre synsfelt innen en halv centimeter radius for multi posisjon confocal imaging, og sett en Z-stabel til 10 til 12 mikrometerområdet og tidsforløpsoppkjøpet for å kjøre hvert minutt. Etter tre minutters bildebehandling injiserer du 200 mikroliter monocytter gjennom inline luer injeksjonsporten og begynner å forestille seg cellulær interaksjon. Etter minst 30 minutter stopper du bildet og strømmen og klemmer slangen slik at den kobles fra lysbildet.Hvis du vil bestemme transmigrasjonshastigheten til cellene gjennom de stimulerte HUVECene, åpner du bilde J og teller totalt antall tilslutningsmoncytter i hvert felt for å bestemme celleantallet per kvadratimender. Deretter teller antall transmigrerte monocytter som er tilstede i basalplanet under endotelcellene som identifisert ved tilstedeværelse av en svart hullsone rundt kjernen. En enkel måte å sjekke aktiveringsstatusen til HUVECs etter stimulering er å visualisere deres forlengelse under inflammatorisk stress.Tidsforløp confocal imaging tillater visualisering av monocytter på det a apical plan hvor deres fenotype kan vurderes. Migrering av celler som gjennomgår transmigrasjon, flyttes til det intercellulære celle-til-celle-krysset før de forsvinner fra det a apiske planet og dukker opp igjen i basalplanet. Kvantisering av monocyttrekrutteringen over tid bekrefter at monocytt vedheft etterfølges av transmigrasjon.Transmigrasjonshastigheten av CD16 positiv monocytt er lav når endotelcellen stimuleres bare med TNF alfa, men øker bare når endotelcellene stimuleres med både TNF alfa og vaskulær endotelvekstfaktor eller VEGFA. HUVEC stimulering med TNF alfa og TNF alfa pluss VEGFA induserer en økning i overholdelse av CD14 negative T-, B- og NK-celler, sammenlignet med CD14 positive monocytter. I tillegg induserer HUVEC stimulering transmigrasjon av monocyttpopulasjonen bare, da T-, B- og NK-celler ikke transmigrerer under enten TNF alfa eller TNF alfa pluss VEGFA stimulerende forhold.For å utføre en optimal monocytt rekrutteringsanalyse, er det viktig at du planlegger eksperimentet på forhånd og gjør det på samme dag. Og når du renser cellene, må du kontrollere at mikroskopet er på 37 grader, slik at du ikke overfører cellene til annen temperatur under eksperimentet. For å lære denne prosedyren kan alle metodene som profilering av HUVEC cytokin og chemokinuttrykk samt chemotaxis-studier utføres for å svare på ytterligere spørsmål om den molekylære mekanismen som opprettholder transmigrasjon og vedheft av spesifikk monocyttpopulasjon.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av menneskelige umbilical vein endotelceller og deres bruk i studiet av Neutrofil Sjelevandring Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Adhesion analysen til Study leucocyte Rekruttering til humane Sinus endotelet under forhold med Skjær Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning av Fluorescent Nanoparticle Interaksjoner med Primær immun celle subpopulasjoner av flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo modell for å studere bakteriell adhesjon til fartøyet veggen under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

En enkel Flowcytometriske metode for å måle glukoseopptak og Glukose Transporter Expression for Monocyttnivåene subpopulasjoner i fullblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler ved Imaging flowcytometrisystemer: En sammenligning mellom to Monocyte Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse av mikroglia og monocyt-avledede makrofager fra sentralnervesystemet ved hjelp av flytcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...