Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Мы благодарим д-р Пол Брэдфилд за рукопись чтения и обратными связями. A. S. получил финансовую поддержку от сэра Жюль Торн благотворительных заморских доверять обл.,

С осознанного согласия добровольцев доноров и в соответствии со швейцарской комитетов по этике клинических исследований были использованы материалы человека.
1. изоляция и замораживание человека пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVEC)
<ol><li>Добавьте 5 мл раствора покр...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

Здесь мы приводим метод подробно исследование как Моноцит субпопуляций высыпками через воспаление эндотелия монослоя. Обсудили метод используется confocal микроскопии вместо фазово контрастной микроскопии, который также используется для изучения набора Моноцит под поток3<s...

Моноциты являются фагоцитирующих компонентом врожденного иммунитета, которая необходима для борьбы с патогенами, очистка поврежденных тканей, ангиогенез и патофизиологии многих заболеваний, включая рак1,2,3 . Моноциты являются клетки костного мозга, полученных состоит из гетерогенных субпопуляций, которые циркулируют в крови, но могут быть набраны на месте воспаления в периферических тканях через конкретные молекулярные механизмы. Набор каскадов моноцитов, а лейкоцитов в целом подразумевает различные шаги, включая захват, прокатки, ползать, арест, трансэндотелиальной миграции (переселение) и миграции через стенку сосуда (базальной мембраны и росписи 4клетки). Эти шаги включают главным образом воспаления индуцированной молекул на поверхности эндотелиальных Люминал селектинов, гликопротеин лигандов, chemokines, молекулы адгезии межклеточных и соединительной и их рецепторов на лейкоциты например селектина лигандами и интегринов. Торговли людьми пути через либо развязок эндотелиальных клеток (параклеточный) или через эндотелиальные клетки тела (transcellular) может использоваться лейкоциты пересечь эндотелиальный барьер5. Хотя исторически были задокументированы моноцитов к высыпками через маршрут transcellular, потенциальные расхождения в их миграционных пути были предложены моноциты больше не считаются популяции однородных клеток. В настоящее время становится ясно, что разнообразие Моноцит могут быть определены каждым из их различий и общности, в отношении их отличительные кровоподтек каскады3,6. Таким образом чтобы однозначно различать Моноцит субпопуляций, крайне важно для визуализации и фенотип поведение каждого из этих различных субпопуляций в ходе набора процесса.
Моноциты от человека, свинки, крысы и мыши были подразделены фенотипического субпопуляции с некоторыми объясняется социальными функциями и конкретных миграционных поведения7,8,9. Например в организме человека, моноциты можно подразделить три подгруппы, основанный на их поверхности выражение CD14, coreceptor для бактериальных липополисахарида и CD16, Fc-гамма-рецептор III. Человека Моноцит субпопуляций включают в себя классические CD14 окрашенных CD16 ++-, промежуточные CD14 окрашенных CD16 +++ и неклассические CD14тускломCD16+ клетки6,9. Классическая CD14 окрашенных CD16 ++– моноцитов были показаны в основном воспалительных тогда как бассейн CD16+ моноцитов коллективно были найдены представить TIE2 выражения и proangiogenic функции10. Последовательно, стимуляции эндотелиальных клеток с воспалительных цитокинов, таких как некроза опухолей человека фактор (ФНО) α или интерлейкина (IL-1) бета (обычные воспаление) достаточно, чтобы вызвать полный набор классических CD14 окрашенных CD16 ++ – моноцитов. Тем не менее, одновременных действий Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и TNFα (ангиогенных факторов driven воспаление) требуются спровоцировать трансмиграции CD16+ proangiogenic бассейн моноциты3. Исторически традиционная система Transwell при статических условиях, Камера потока параллельной пластине и µ слайд потока камеры были использованы для количественного анализа набора одного лейкоцита населения на время в пробирке11 ,12,13. Хотя эти протоколы были подтверждены, более надежный метод, который позволяет одновременный анализ нескольких Моноцит субпопуляций будет считаться более глубокий. Такие методологии должны учитывать различные частоты каждого соответствующего населения и несколько взаимодействий и также предусматривают набор каскадов, которые определяют каждый Моноцит механистического понимания сходства и особенностей подмножество.
Здесь мы представляем метод, основанный на промежуток времени изображений набора Моноцит под поток, который позволяет мигрирующих каскады Моноцит различных субпопуляций одновременно быть изучены с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод объединяет некоторых критических функций, которые имитируют эндотелиальных клеток воспаления, а также гемодинамики циркулирующих моноцитов в пост капиллярного венулы, основное место лейкоцита вербовки в естественных условиях. Предложенный метод использует эндотелиальных клеток человека пупочную вену (HUVEC), которые генерируются с помощью устоявшихся Протокол изоляции от человека пуповины. Этот клинический ресурс имеет преимущество легко доступны как побочный продукт биологического, также одновременно обеспечивая разумной доходности эндотелиальных клеток, которые могут быть изолированы от пупочную вену. Мы также использовали флуоресцентных красителей и иммунофлюоресценции для различения различных клеточных компонентов и confocal микроскопии однозначно определить Моноцит позиционирования (люминал против abluminal) с течением времени. Протокол, представленные здесь был разработан одновременно измерить уровни трансмиграции Моноцит субпопуляций. Кроме того следует отметить, что эта методология может быть расширен для изучения других субпопуляций лейкоцитов и процессы набора персонала путем использования различных биомаркеров и маркировки.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

Набор моноцитов в крови для целевых периферических тканях имеет решающее значение для воспалительного процесса во время повреждения тканей, развитие опухоли и аутоиммунных заболеваний. Этому способствует через процесс захвата от свободного потока на поверхность Люминал активированного эндотелиальных клеток, следуют их адгезии и трансэндотелиальной миграции (переселение) в базовом пораженной ткани. Однако механизмы, которые поддерживают преференциальных и контекстно зависимые вербовки Моноцит субпопуляций понимаются еще не полностью. Таким образом мы разработали метод, который позволяет набора различных Моноцит субпопуляций одновременно визуализировать и измеряется в поток. Этот метод, основанный на покадровой конфокальная томография, позволяет недвусмысленное различие между приверженцами и переселенных моноцитов. Здесь мы описываем, как этот метод может использоваться одновременно изучить набор Каскад pro ангиогенных и не ангиогенных моноцитов в пробирке. Кроме того этот метод может быть продлен изучить различные этапы найма до трех Моноцит населения.

Определение состояния активации HUVEC индуцированных TNFα
Био активности воспалительных цитокинов TNFα может зависимости пакета и пресыщения цикла замораживания оттаивания. Важно проверить состояние активации HUVEC TNFα лечения. Это может быт...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Здесь мы представляем Интегрированный протокол, который измеряет Моноцит субпопуляция людьми под потока в пробирке путем использования конкретных поверхностных маркеров и конфокальный флуоресцентной микроскопии. Этот протокол может использоваться для изучения последовательного набора мер, а также относительно профиль другие подтипы лейкоцитов, используя другие конкретные поверхностных маркеров.

Одновременное исследование вербовки Моноцит субпопуляций под поток в пробирке

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Для этого метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области воспаления и иммунологии. Например, что такое молекулярный механизм адгезии лейкоцитов и транс-эндотелиальной миграции. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет неограниченное использование дискриминации между трансмиграции и сильное добавление моноцитов к эндотелиальной монослой.Хотя этот метод предоставляет информацию о наборе моноцитов на поток, он также может быть адаптирован к другим клеткам гематопоэтических систем, таких как Т-клетки, В-клетки, или производные субпопуляции из них. После мытья, этикетка пупочной вены эндотелиальных клеток или HUVEC с 30 микролитров 37 градусов по Цельсию M199 среды дополняется одним микромолярной CMFDA в течение 10 минут при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. В конце инкубации, мыть клетки с 150 микролитров полного M199 среды и инкубировать культуру в 150 микролитров свежей полной M199 среды в течение еще 30 минут.Затем замените супернатант 150 микролитров полного носителя M199, содержащего соответствующие экспериментальные добавки, и верните культуру слайд-камеры в инкубатор на шесть часов. Для изоляции моноцитов PAN человека разбавляйте свежесобранный образец крови в PBS, дополненный одним миллимоляном ЭДТА при соотношении один к одному, и тщательно слой 20 мл раствора крови на 20 мл градиентной среды плотности для разделения градиента плотности центрифугации. Соберите средний слой моноядерных клеток периферической крови в новую трубку объемом 50 мл, содержащую 40 мл PBS, дополненную 1 миллимолярем EDTA, и довнесите окончательный объем до 50 мл с дополнительным PBS-EDTA После подсчета, изолируйте моноциты с комплектом изоляции моноцитов PAN в соответствии с инструкцией производителя.И мыть клетки три раза в M199 среды дополняется 0,5%Bovine сыворотки Альбумин, или BSA, чтобы устранить любые следы EDTA. Качество изоляции моноцитов имеет решающее значение для обеспечения надежного трансмиграции и результатов адгезии. Таким образом, важно строго следовать рекомендации производителя для изоляции.Повторное увеличение гранул в 6 раз от 10 до 6 моноцитов на мл концентрации в свежем M199 среды дополняется 0,5%BSA и разделить клетки на один 200 микролитер aliquot на микроцентрифуг трубки на набор анализа. Затем поместите клетки на 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут до их инъекции в камеру потока. Чтобы подготовить жидкостную систему к анализу, сначала вставьте мужской сочные разъемы в один конец 8 см длиной 3 мм толщиной кусок силиконовой трубки и подключить другой конец к рядному набору впрыска люэра.Затем подключите разъем люера к одному концу 40 см в длину 3 мм толщиной кусок силиконовой трубки. Далее, 20 мм шприц на один конец 1 м в длину 3 мм толщиной кусок силиконовой трубки и вставить мужской люер разъем на другой конец. Затем вставьте оба мужских люер разъемы в женский люер блокировки парой и место свободный конец силиконовой трубки в резервуар 37 градусов по Цельсию M199 среды дополнен 0,5%BSA.Увяните поршень, чтобы заполнить трубы с буфером потока и обеспечить шприц на шприц насоса. Затем установите насос в режим вывода и укажите скорость потока. Чтобы соединить слайд-камеру, зажим силиконовой трубки вокруг самки люер блокировки парой и отключить два люер разъем мужчин от парой, чтобы позволить им быть подключены к резервуару слайда.Воздушные пузырьки не только нарушают качество изображения, но и вызывают капиллярный стресс для клеток, что приводит к гибели клеток. Чтобы избежать пузырьков воздуха, подтвердите правильное зажим трубки перед вставкой люера в резервуар. Затем удалите зажимы, чтобы подтвердить, что соединение не протекает, и поместите слайд под микроскопом.Для визуализации набора моноцитов под потоком добавьте 5 микролитров конъюгированных антител против CD16 и соответствующий ядерный краситель для каждого алицита моноцитов в течение 10 минут инкубации при комнатной температуре и соберите клетки с краткой центрифугации. Перезаполнить гранулы в 250 микролитров буфера потока и начать шприц насоса. Добавьте 30 микролитров одной моноцитной подвески в одну камеру слайда и выберите цель 40X на конфокальцаторе.Активируйте соответствующие флуоресцентные лазеры и используйте камеру с помеченным моноцитом, чтобы установить параметры приобретения конфокального микроскопа Next, выберите три поля зрения в радиусе полуметра для многопозентной конфоканной визуализации, а также установите стек в диапазоне от 10 до 12 микрометров и приобретение промежутка времени для запуска каждую минуту. После трех минут визуализации ввимите 200 микролитров моноцитов через порт инъекций inline luer и начните визуализацию клеточного взаимодействия. После по крайней мере 30 минут, остановить изображение и поток и зажим трубки, чтобы позволить ему быть отключен от слайда.Чтобы определить скорость трансмиграции клеток через стимулируемые HUVECs, открытое изображение J и подсчитать общее количество адептов моноцитов в каждом поле, чтобы определить количество клеток на квадратный миллиметр. Затем подсчитайте количество трансмигратных моноцитов, которые присутствуют в базальной плоскости под эндотелиальными клетками, как это определено наличием зоны черной дыры вокруг ядра. Простой способ проверить состояние активации HUVECs после стимуляции является визуализация их удлинение при воспалительном стрессе.Конфокальные изображения замедленного действия позволяют визуализировать моноциты на апической плоскости, где можно оценить их фенотип. Мигрирующие клетки, проходящие трансмиграционный процесс, перемещаются на межклеточный стык, прежде чем исчезают из апической плоскости и вновь появляются в базальной плоскости. Количественная оценка набора моноцитов с течением времени подтверждает, что за адгезией моноцитов следует трансмиграция.Скорость трансмиграции CD16 положительные моноциты является низким, когда эндотелиальные клетки стимулируются с TNF альфа только, но увеличивается, когда эндотелиальные клетки стимулируются как СНФ альфа и сосудистого эндотелиального фактора роста или VEGFA. СТИМУЛЯЦИя HUVEC с помощью альфа-TNF и альфа-TNF плюс VEGFA вызывает увеличение присоединения к CD14 отрицательных Т, В и НК-клеток, по сравнению с CD14 положительные моноциты. Кроме того, стимуляция HUVEC вызывает трансмиграцию популяции моноцитов только, так как Т, В и НК клетки не трансмиграции ни в TNF альфа или TNF альфа плюс VEGFA стимулирующих условиях.Для выполнения оптимального анализа набора моноцитов, важно, что вы планируете свой эксперимент заранее и сделать это в тот же день. И когда вы очищаете клетки, убедитесь, что ваш микроскоп находится на 37 градусов, так что вы не перенести клетки к разной температуре во время эксперимента. Чтобы узнать эту процедуру, все методы, такие как профилирование цитокинов HUVEC и экспрессии хемокинов, а также исследования хемотаксиса могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительный вопрос о молекулярном механизме, который поддерживает трансмиграцию и адгезию специфической популяции моноцитов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; В пробирке</em&gt; Ко-инфекция моделью для изучения<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Расход Адгезия Анализ по изучению лейкоцитов набора на человека печеночных синусоидальных эндотелия в условиях напряжения сдвига

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

В пробирке и в естественных моделью для изучения бактериальной адгезии к стенке сосуда в проточных условиях

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Простой проточной цитометрии метод измерения глюкозы и глюкозы Transporter выражение для моноцитов субпопуляциях в цельной крови

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Характеристика человека моноцитов дендритные клетки путем обработки изображений проточной цитометрии: Сравнение между двумя моноцитов Isolation протоколов

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Анализ макрофагов Microglia и Monocyte из центральной нервной системы методом проточной цитометрии

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...