Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
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Agradecemos Dr. Paul Bradfield manuscrito lectura y retroalimentación. A. S. recibió apoyo financiero de la Sir Jules espina beneficencia ultramar Trust reg.,

Materiales humanos fueron utilizados con el consentimiento informado de los donantes voluntarios y de acuerdo con el suizo comités de ética en investigación clínica.
1. aislamiento y congelación de Umbilical humano vena las células endoteliales (HUVEC)
<ol><li>Añadir 5 mL de solución de recubrimiento a un matraz T75 (0,1 mg/mL G de colágeno y gelatina de 0.2% en tampón fosfato salino PBS a pH 7.4) durante 30 min a 37 ° C antes de iniciar el aislamiento de HUVEC.</li>
	<li>Limpiar ...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

Aquí, Divulgamos un método que detalla un estudio de cómo transmigrada subpoblaciones de monocitos a través de la monocapa de endotelio inflamada. Utiliza el método discutido microscopia confocal en vez de microscopia de contraste de fase, que también se utiliza para el estudio de reclutamiento de monocitos bajo flujo3,11,19. Una ventaja importante del uso de la microscopia confocal para Time-lapse de imágenes es la capac...

Monocitos constituyen un componente fagocitario de la inmunidad innata que es esencial para la lucha contra patógenos, limpieza de los tejidos dañados, angiogénesis y la fisiopatología de muchas enfermedades incluyendo cáncer1,2,3 . Los monocitos son células derivadas de médula ósea, compuestas de subpoblaciones heterogéneas que circulan en la sangre pueden ser reclutadas en el sitio de la inflamación en tejido periférico a través de mecanismos moleculares específicos. Las cascadas de reclutamiento de monocitos, en cuanto a los leucocitos en general, implica diversos pasos incluyendo captura, rodar, gatear, detención, migración transendothelial (transmigración) y migración a través de la pared del vaso (la membrana del sótano y mural células)4. Estos pasos consisten principalmente en inflamación inducida por moléculas en la superficie luminal endotelial selectinas ligandos de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adhesión intercelular y junctional, y sus receptores en los leucocitos como ligandos de selectina y las integrinas. Vías de tráfico a través de las uniones celulares endoteliales (paracelular) o a través del cuerpo de la célula endotelial (transcelular) pueden utilizarse por los leucocitos para atravesar la barrera endotelial5. Mientras que los monocitos se han documentado históricamente a transmigrada a través de la ruta transcelular, se han propuesto posibles divergencias en su camino migratorio como monocitos ya no se consideran una población celular homogénea. Ahora resulta claro que la diversidad de monocitos puede ser definido por cada una de sus diferencias y similitudes, con respecto a su extravasación distintivo cascadas3,6. Por lo tanto, para discriminar claramente entre subpoblaciones de monocitos, es fundamental visualizar y fenotipo el comportamiento de cada una de estas subpoblaciones diferentes durante la contratación del proceso.
Monocitos de humano, cerdo, rata y ratón se subdivide en subpoblaciones fenotípicas con ciertas funciones adscrito y comportamientos migratorios específicos7,8,9. Por ejemplo, en los seres humanos, los monocitos pueden dividirse en tres subconjuntos basados en su superficial expresión de CD14, un correceptor para lipopolisacárido bacteriano y CD16, receptor Fc gamma III. Subpoblaciones de monocitos humanos incluyen CD14 clásico+CD16-, intermedio CD14+CD16+ y no clásica CD14dimCD16 células de+ 6,9. El CD14 clásico+CD16– monocitos fueron demostrados para ser principalmente inflamatorias mientras que la piscina de CD16+ monocitos encontraron colectivamente presentar TIE2 expresión proangiogénico función10. Constantemente, la estimulación de células endoteliales con las citoquinas inflamatorias tales como necrosis del tumor humano factor α (TNF) o la interleucina (IL-1) beta (inflamación convencional) sea suficiente para la completa captación de CD14 clásico+CD16 – monocitos. Sin embargo, son necesarias para provocar la transmigración de la CD16 acciones simultáneas de A factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y TNFα (inflamación impulsado por factores angiogénicos)+ piscina proangiogénico de monocitos3. Históricamente, el sistema tradicional de Transwell bajo condiciones estáticas, la cámara de flujo paralelo de la placa y las cámaras de flujo μ diapositiva se han utilizado para analizar cuantitativamente el reclutamiento de la población de un leucocito en un tiempo en vitro11 ,12,13. Mientras que estos protocolos se han validado, un método más robusto que permite el análisis simultáneo de varias subpoblaciones de monocitos se consideraría más perspicaz. Esas metodologías deben cuenta para múltiples interacciones y las diferentes frecuencias de cada población respectiva y también proporcionar una comprensión mecanicista de las similitudes y especificidades para las cascadas de reclutamiento que definen cada monocito subconjunto.
Aquí, presentamos un método basado en la proyección de imagen de Time-lapse de reclutamiento de monocitos bajo flujo que permite las cascadas migratorias de subpoblaciones de monocitos diferentes a estudiar simultáneamente mediante el uso de microscopia confocal. Este método integra ciertas características que imitan la inflamación endotelial de la célula, así como la hemodinámica de la circulación de monocitos en vénulas post-capilares, la principal situación de reclutamiento leucocitario en vivo. El método propuesto utiliza células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que se generan a través de un protocolo bien establecido de aislamiento de cordón umbilical humano. Este recurso clínico tiene la ventaja de ser fácilmente disponibles como subproductos biológicos, mientras que también proporciona un rendimiento razonable de las células endoteliales que pueden ser aisladas de la vena umbilical. También utilizamos tintes fluorescentes y la inmunofluorescencia para distinguir entre los diferentes componentes celulares y la microscopia confocal para definir inequívocamente monocito posicionamiento (luminal y abluminal) con el tiempo. El protocolo que presentamos ha sido desarrollado para medir simultáneamente los niveles de la transmigración de las subpoblaciones de monocitos. Por otra parte, cabe señalar que esta metodología puede ampliarse para estudiar otras subpoblaciones de leucocitos y procesos de selección por medio de diferentes biomarcadores y etiquetado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

El reclutamiento de monocitos de la sangre a los tejidos periféricos específicos es fundamental para el proceso inflamatorio durante la lesión tisular, desarrollo de tumores y enfermedades autoinmunes. Esto se facilita a través de un proceso de captura de flujo libre en la superficie luminal de las células endoteliales activadas, seguido por su migración de adherencia y transendothelial (transmigración) a los tejidos subyacentes afectados. Sin embargo, no se entienden los mecanismos que soportan la contratación preferencial y contextual de las subpoblaciones de monocitos. Por lo tanto, hemos desarrollado un método que permite la contratación de las subpoblaciones de monocitos diferentes para visualizar y medir bajo flujo simultáneamente. Este método, basado en la proyección de imagen confocal Time-lapse, permite la distinción inequívoca entre adherentes y transmigrated monocitos. Aquí, describimos cómo se puede utilizar este método para estudiar simultáneamente la cascada de reclutamiento de monocitos pro-angiogénica y no angiogénico in vitro. Además, este método se puede ampliar para estudiar las distintas etapas de la contratación de un máximo de tres poblaciones de monocitos.

Determinar el estado de activación de HUVEC inducida por el TNFα
La bio-actividad de las citoquinas inflamatorias TNFα puede variar según el lote y la reposición del ciclo de congelación-descongelación. Es importante comprobar el estado de activación de HUVEC con tratamiento de TNFα. Esto podría realizarse mediante tinción en paralelo algunas muestras de HUVEC confluente para la inducción inflamatoria de selectinas, ICA...

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Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Para este método puede ayudar a responder a la pregunta clave en el campo de la inflamación y la inmunología. Por ejemplo, ¿cuáles son el mecanismo molecular de la adhesión de leucocitos y la migración trans-endotelial. La principal ventaja de esta técnica es que permite la discriminación de uso ilimitado entre la transmigración y la fuerte adición de monocitos a la monocapa endotelial.Aunque este método proporciona información sobre el reclutamiento de monocitos en el flujo, también se puede adaptar a otras células de los sistemas hematopoyéticos como células T, células B, o derivados de la subpoblación de los mismos. Después del lavado, etiqueta las células endoteliales de la vena umbilical humana o HUVEC con 30 microlitros de 37 grados Celsius M199 medio complementado con un CMFDA micromolar durante 10 minutos a 37 grados Celsius y 5%Dióxido de carbono. Al final de la incubación, lavar las células con 150 microlitros de medio M199 completo e incubar el cultivo en 150 microlitros de medio M199 fresco completo durante otros 30 minutos.A continuación, reemplace el sobrenadante con 150 microlitros de medio M199 completo que contenga los suplementos experimentales apropiados y devuelva el cultivo de la cámara deslizante a la incubadora durante seis horas. Para el aislamiento de monocitos PAN humanos, diluya una muestra de sangre recién recogida en PBS complementada con un EDTA milimétrico en una proporción de uno a uno y caparya cuidadosamente 20 ml de la solución sanguínea en 20 ml de medio de gradiente de densidad para la separación de gradiente de densidad por centrifugación. Recoger la capa plaquetaria de células mononucleares de sangre periférica media en un nuevo tubo de 50 ml que contenga 40 ml de PBS complementado con EDTA 1 milimolar y llevar el volumen final a 50 ml con PBS-EDTA adicional Después de contar, aislar los monocitos con el kit de aislamiento de monocitos PAN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Y lavar las células tres veces en el medio M199 complementado con 0.5%Búbrico Suero Bovino, o BSA, para eliminar cualquier rastro de EDTA. La calidad del aislamiento de monocitos es fundamental para garantizar un resultado robusto de transmigración y adhesión. Por lo tanto, es importante seguir estrictamente la recomendación del fabricante para el aislamiento.Resuspender el pellet en un 6 veces 10 a los 6 monocitos por ml de concentración en medio M199 fresco complementado con 0.5%BSA y dividir las células en una alícuota de 200 microlitros por tubo de microcentrífuga por ensayo de reclutamiento. Luego coloque las células a 37 grados Celsius durante 20 minutos antes de la inyección en la cámara de flujo. Para preparar el sistema fluido para el análisis, inserte primero un conector luer macho en un extremo de una pieza de tubo de silicona de 8 cm de largo y 3 mm de espesor y conecte el otro extremo a un conjunto de inyección de luer en línea.A continuación, conecte el conector luer a un extremo de una pieza de tubo de silicona de 40 cm de largo y 3 mm de espesor. A continuación, la jeringa de 20 mm a un extremo de una pieza de tubo de silicona de 1 m de largo y 3 mm de espesor e inserte un conector de luer macho en el otro extremo. A continuación, inserte ambos conectores de luer macho en un acoplador de bloqueo luer hembra y coloque el extremo libre del tubo de silicona en un depósito de 37 grados Celsius M199 medio complementado con 0.5%BSA.Retirar el émbolo para llenar el tubo con el búfer de flujo y fijar la jeringa en la bomba de la jeringa. A continuación, ajuste la bomba al modo de retirada y especifique el caudal. Para conectar la cámara deslizante, sujete el tubo de silicona alrededor del acoplador de bloqueo luer hembra y desconecte los dos machos del conector luer del acoplador para permitir que se conecten al depósito de la corredera.Las burbujas de aire no sólo perturban la calidad de la imagen, sino que también inducen estrés capilar a las células, lo que conduce a la muerte celular. Para evitar burbujas de aire, confirme la sujeción correcta del tubo antes de insertar el luer en el depósito. A continuación, retire las abrazaderas para confirmar que la conexión no tiene fugas y coloque la diapositiva debajo del microscopio.Para obtener imágenes del reclutamiento de monocitos bajo flujo, agregue 5 microlitros de anticuerpos anti CD16 conjugados con harina y un tinte nuclear adecuado a cada monocitos alícuotas para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente y recoja las células con una breve centrifugación. Resuspender el pellet en 250 microlitros de búfer de flujo e iniciar la bomba de la jeringa. Agregue 30 microlitros de una suspensión de monocitos a una cámara de la corredera y seleccione el objetivo 40X en el microscopio confocal.Active los láseres fluorescentes adecuados y utilice la cámara con el monocitos etiquetados para establecer los parámetros de adquisición del microscopio confocal Next, seleccione tres campos de visión en un radio de medio centímetro para imágenes confocales de varias posiciones y establezca una pila Z en el rango de 10 a 12 micrómetros y la adquisición de lapso de tiempo para que se ejecute cada minuto. Después de tres minutos de imágenes, inyecte 200 microlitros de monocitos a través del puerto de inyección de luer en línea y comience a tomar imágenes de la interacción celular. Después de al menos 30 minutos, detenga la imagen y el flujo y sujete el tubo para permitir que se desconecte de la diapositiva.Para determinar la tasa de transmigración de las células a través de los HUVEC estimulados, abra la imagen J y cuente el número total de monocitos adherentes en cada campo para determinar el recuento de celdas por milímetro cuadrado. A continuación, cuente el número de monocitos transmicrados que están presentes en el plano basal debajo de las células endoteliales identificados por la presencia de una zona de agujero negro alrededor del núcleo. Una forma sencilla de comprobar el estado de activación de los HUVEC después de la estimulación es visualizar su elongación bajo estrés inflamatorio.Las imágenes confocales de lapso de tiempo permiten visualizar los monocitos en el plano apical donde se puede evaluar su fenotipo. Las células migratorias sometidas a transmigración se mueven a la unión intercelular de célula a célula antes de que desaparezcan del plano apical y reaparezcan en el plano basal. La cuantificación del reclutamiento de monocitos a lo largo del tiempo confirma que la adhesión de monocitos es seguida por la transmigración.La tasa de transmigración del monocitos positivos CD16 es baja cuando la célula endotelial se estimula con TNF alfa solamente, pero aumenta cuando las células endoteliales se estimulan con TNF alfa y factor de crecimiento endotelial vascular o VEGFA. La estimulación HUVEC con TNF alfa y TNF alfa más VEGFA induce un aumento en la adherencia a las células T, B y NK negativas CD14, en comparación con los monocitos positivos CD14. Además, la estimulación HUVEC induce la transmigración de la población de monocitos solamente, ya que las células T, B y NK no transmigran en condiciones de estimulación TNF alfa o TNF más VEGFA.Para realizar un ensayo óptimo de reclutamiento de monocitos, es importante que planee su experimento con antelación y lo haga en el mismo día. Y cuando purifique las células, asegúrese de que su microscopio esté a 37 grados para que no transfiera las células a diferentes temperaturas durante el experimento. Para aprender este procedimiento, se pueden realizar todos los métodos como el perfilado de la expresión de citoquinas HUVEC y quimiocina, así como los estudios de quimiotaxis para responder a preguntas adicionales sobre el mecanismo molecular que sostienen la transmigración y adhesión de la población específica de monocitos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...