この方法は、T細胞免疫学の分野における主要な質問とウイルスベクターワクチンの開発に役立ちます。この方法の主な利点は、少量の血液のみが必要であり、同じマウスからの測定を繰り返すことができることです。さらに、ウイルスおよび導入遺伝子特異的なCTLを同じサンプルから検出することができます。
この手順のデモンストレーションは、技術者のジャスミン・リネフナーと、卒業生のアニカ・ロスラーです。サンプルの測定と分析は、ポストドクターのゾルタン・バンキです。まず、テキストプロトコルに従ってマウスを安全に拘束します。
マウスの尾静脈からEDTAコーティングチューブに20マイクロリットルの血液を採取します。脾細胞を扱う場合は、脾臓を分離し、細胞のストレーナーを通して組織を押すために注射器のプランジャーを使用します。赤血球に対してライシスを行った後、細胞を数え、サンプルの濃度を調整する。
各サンプルに対して1つのFacsチューブを準備してラベル付けし、100マイクロリットルの臓器懸濁液、または20マイクロリットルの血液をチューブに移します。脾細胞を用いて作業する場合は、臓器懸濁液を5分間遠心分離し、上清を捨てます。次いで、チューブをボルテックスし、細胞ペレットを再懸濁させる。
使用する各チャンネルに対して、補償サンプル用のFacsチューブも用意します。1 つの追加サンプルを未染色コントロールとして準備します。最適な希釈液にテトラマーを使用したFacsバッファー、および混合する渦を持つチューブを準備します。
次に、各試料に50マイクロリットルの四量体希釈液を加え、渦を混合する。補償コントロールと未染色サンプルに四トラマーを含まない Facs バッファーを追加します。次に、37°Cの暗い状態でサンプルを20分間インキュベートします。
サンプルがインキュベートしている間に、チューブにFacsバッファを加えます。次に、テキストプロトコルの表2に指定した希釈液に従って抗体をバッファーに加え、溶液をボルテックスする。科学的な質問に保留中は、ここで説明したものとは別に、マーカーの組み合わせが使用される可能性があります。
CD3およびCD8に対する抗体を常にパネルに含める必要があります。各チャンネルに対して、200マイクロリットルのFacsバッファーを含むチューブを準備し、それぞれの色でCD8に対する抗体希釈液の1マイクロリットルを加え、渦を混合する。次に、テキストプロトコルで指定された抗体希釈液を保存する。
サンプルを洗浄するには、サンプルと遠心分離機にFacsバッファーのミリリットルを1ミリリットル加えます。その後、上清を捨て、残りの液体をペーパータオルで水切りします。血液を処理する場合は、残りの液体を排出するときに注意してください。
赤血球のリシスの前に、血液はチューブの底に固執しません。あるいは、上清を吸引することもできます。次に、各細胞ペレットに抗体溶液50マイクロリットルを加え、渦を穏やかに加える。
各補正ミックスの50マイクロリットルを対応する補償制御に加え、50マイクロリットルのファックスバッファーを未染色制御の細胞ペレットに加え、渦を穏やかに加える。脾細胞を扱う場合は、抗体染色後に1~2ミリリットルのFacsバッファーで直接サンプルを洗浄し、遠心分離機を5分間洗浄します。その後、上清を捨て、ペーパータオルの残りの液体を排出します。
各血液サンプルに500マイクロリットルのACKバッファーを加え、渦を穏やかに加えます。次に、試料を暗所で室温で5分間インキュベートする。サンプルに1ミリリットルのFacsバッファーを加え、遠心分離機を加えます。
その後、上清を捨て、残りの液体をペーパータオルで排出します。赤血球の適切なリシスは、ファクの測定を容易にする重要なステップであり、したがって、ペレットがむしろ湿っているとき、赤血球のリシスを繰り返す。前述のとおり、サンプルを再度洗浄します。
その後、上清を捨て、ペーパータオルに残った液体を排出します。固定する前に、塊の形成を防ぐために細胞が十分に再懸濁されていることを確認してください。各チューブに150〜300マイクロリットルのファックス固定バッファーを加え、渦を混ぜます。
その後、フローサイトメトリック測定をできるだけ早く進めます。まず、補正コントロールを測定し、スペクトルのオーバーラップを補正します。その後、CD3陽性セルとCD8陽性セルを選択するシーケンシャルゲートを設定します。
前方および横方向散乱領域を使用してリンパ球のゲート.次いで、リンパ球集団内で、前方散乱幅対面積を用いて単一細胞上にゲートを付ける。CD3およびCD8チャンネルを使用して、単細胞リンパ球をプロットします。
CD3陽性細胞とCD8陽性細胞をgatingして、CD8陽性T細胞を同定する。CD8低細胞が格言に含まれていることを確認します。CD3/CD8陽性細胞の伝播は、このプロトコルの重要なステップです。
細胞の活性化はCD3および/またはCD8のダウン調節につながることが多いので、CD3/CD8低細胞も含めるべきである。この後、CD8陽性細胞と四点細胞をプロットし、CD8陽性/四トラマー陽性細胞をガッティングする。可能であれば、各サンプルの CD3 陽性および CD8 陽性ゲートに 20, 000 個のセルを記録します。
最後に、測定値を FCS ファイルとして保存します。このプロトコルでは、抗原特異的CD8+T細胞を血液および組織サンプルで定量的に検出した。CD3陽性細胞およびCD8陽性細胞をガッティングした後、四トラマー陽性細胞を同定した。
染色のために同じチューブに2つの異なる四量体を組み合わせ、2つの異なるCTL特異性を同時に定量化することを可能にした。このプロトコルを使用すると、測定ごとに少量の血液しか必要とされないので、同じマウスからのT細胞応答を時間をかけて追跡することができます。さらに、抗原特異的なCTLのフェノタイプを解析することができる。
この手順を試みる間、これはT細胞受容体の内在化につながる可能性がありますので、長時間のインキュベーション時間を避けることが重要です。四量体技術の発見以来、四量体染色はT細胞分析に不可欠なツールとなり、四量体を含む幅広い用途に対応しています。明るい四トラマーのための明るい未来。
