Name: evaluating virulence and pathogenesis of aeromonas infection in a caenorhabditis elegans model
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00
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線虫中核施設診断微生物学、台湾からの支援に感謝しており、抗菌抵抗研究所の国立チェン Kung 大学病院アエロモナスを提供するための分離します。また、線虫の遺伝学センター (CGC) や、WormBase を認めます。我々 はまた、原稿を編集 Savana ムーアを感謝します。
本研究はパ陳に科学省と台湾の技術 (最も 105-2628-B-006-017-MY3) 国立チェン Kung 大学病院 (NCKUH-10705001) からの助成金によって部分的に支えられました。

1. 培地の準備
注: ソリューションの準備のための表 1 を参照してください。
<ol><li>M9 中12を準備するには、KH2PO41.5 g、Na2HPO4、5.66 g と 500 mL の脱イオン水で塩化ナトリウム 2.5 g を溶かします。121 ° C、20 分でのオートクレーブは室温に冷却されるまで待つし、最初に使用する前に 1 M MgSO4の 0.5 mL を追加します。</li...

<ol>
	<li>Parker, J. L., Shaw, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas+spp.+clinical+microbiology+and+disease.">Aeromonas spp. clinical microbiology and disease.</a> Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).</li><li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+soft-tissue+infections+caused+by+Aeromonas+species.">Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).</li><li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tract+infections+caused+by+Aeromonas+species.">Biliary tract infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).</li><li>Chuang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+clinical+characteristics+among+Aeromonas+hydrophila,+Aeromonas+veronii+biovar+sobria+and+Aeromonas+caviae+monomicrobial+bacteremia.">Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia.</a> Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).</li><li>Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+soft+tissue+infection+caused+by+Aeromonas+species+in+cancer+patients.">Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).</li><li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Disease+Model+of+Muscle+necrosis+caused+by+Aeromonas+dhakensis+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 2058 (2016).</li><li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+diversity+among+bacteremic+Aeromonas+isolates:+ex+vivo,+animal,+and+clinical+evidences.">Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences.</a> PLoS One. 9 (11), 111213 (2014).</li><li>Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+infection+models+in+zebrafish+larvae+(Danio+rerio)+to+study+the+pathogenesis+of+Aeromonas+hydrophila.">Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1219 (2016).</li><li>Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIOK-1+Is+a+Suppressor+of+the+p38+MAPK+Innate+Immune+Pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Immunology. 9, 774 (2018).</li><li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Caenorhabditis+elegans+infection+by+bacterial+and+fungal+pathogens.">Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens.</a> Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).</li><li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Engelmann, I., Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+C.+elegans.">Innate immunity in C. elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).</li><li>Feinbaum, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Pseudomonas+aeruginosa+virulence-related+genes+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model.">Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813 (2012).</li></ol>

線虫は bacterivorous 線虫、自然食品として摂取菌し、その進化のプロセスの中に細菌を複雑な免疫を開発しました。表皮および腸の9,13主要な臓器を維持し、免疫力をサポートします。表皮と線虫の筋肉のバンドでは哺乳類と人間6軟部組織の構造に似ています。これらの特性により、線虫、アエロモナス感...

ヒトの病原体、アエロモナスは、胃腸炎や創傷感染、敗血症、尿路感染症1,2を引き起こす臨床的に示されています。最も関連する疾患は、4 つの細菌種に関連する報告されている:アエロモナス ポリエステルアエロモナスより、アエロモナス サルモニシダアエロモナス dhakensis 2,3,4,5.アエロモナス感染症の中で軟部組織感染症を引き起こす可能性が罹患率と死亡率の人間で。注、筋壊死軟部組織感染症6の最も深刻な形です。生存の観察、感染後線虫の筋肉壊死アエロモナスの毒性を推測する便利な方法です。
科学者は、細菌感染症を研究する多くのモデル生物を既に開発しました。従来、マウス、zebrafishes、および線虫アエロモナス6,7,8の病原性と病因を研究する動物モデルとして使用されました。すべての動物のモデルには、その ' 利点と用途。モデル生物、線虫、bacterivorous 線虫は、摂取量の細菌が foodnaturally として。線虫はその進化の過程で細菌感染に対する複雑な生得の免疫組織を開発しました。細菌感染症のストレスの下でc. の elegansは、アエロモナス6,7,9および他の病原体の病原細菌を研究する優れた感染モデルであること実証されていますのような菌10と出血性大腸菌o157: h711。ただし、アエロモナスの病原性を研究するためのモデルとして線虫を使用して方法論に焦点を当てた出版物はまだありません。
動物モデルとして線虫を用いたアエロモナス感染症を研究する 3 つの実験をご紹介: 生存、液体毒性と筋壊死のための試金。これらのメソッドは、アエロモナス種内の中で毒性を評価し、アエロモナスの病因の理解を改善する便利な方法です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="661">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:119px;">YIH DER</td>
			<td style="width:119px;">LM-570R</td>
			<td style="width:207px;">Bacteria incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:119px;">J.T.Baker</td>
			<td>MP021519455</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:119px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-05</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:119px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">MP021914405</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">agar</td>
			<td style="width:119px;">Difco</td>
			<td style="width:119px;">214530</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cholesterol</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C8503</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethanol</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">32205</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOH</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">P5958</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 cm petri plate</td>
			<td style="width:119px;">ALPHA PLUS</td>
			<td style="width:119px;">46</td>
			<td>agar plate preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plate</td>
			<td style="width:119px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td>liquid assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bacterial peptone</td>
			<td style="width:119px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:119px;">AAJ20048P2</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">yeast extract</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">92144</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">citric acid&#8226;H2O</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C1909</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tri-potassium citrate&#8226;H2O</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">104956</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FudR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">1271008</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">disodium EDTA</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">E1644</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FeSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">215422</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MnCl2&#8226;4 H2O</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">221279</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ZnSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">204986</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CuSO4&#8226;5 H2O</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C8027</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tryptone</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">16922</td>
			<td>Culture medium preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope system</td>
			<td style="width:119px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Eclipase Ti inverted&#160;</td>
			<td>microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scientific CCD Camera</td>
			<td style="width:119px;">QImaging&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Retiga-2000R Fast 1394&#160;</td>
			<td>microscope imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating virulence and pathogenesis of aeromonas infection in a caenorhabditis elegans model

ヒトの病原体アエロモナスは胃腸炎、創傷感染、敗血症、尿路感染症を引き起こす臨床的に示されています。最も人間の病気は、細菌の種に関連する報告されている:アエロモナス ポリエステルアエロモナスより、アエロモナス サルモニシダアエロモナス dhakensis。モデル生物線虫は、アエロモナスの病原細菌を研究する優れた感染モデルを提供する bacterivore です。生存、液体毒性、筋壊死アッセイなど線虫モデルを用いたアエロモナス感染症を研究する 3 つの実験を紹介します。アエロモナスの病原性を決定する 3 つの方法の結果は安定していた。A. dhakensisは、臨床感染症の原因 4 主要アエロモナス種の中で最も毒性の高いことが示されました。これらのメソッドは、アエロモナス種内の中で毒性を評価し、アエロモナス感染症の病態の理解に貢献する便利な方法に表示されます。

上記で説明したプロトコルに従うことによって 4アエロモナス系統から毒性を区別するために簡単です。図 1にc. の elegansの生存分析を示します。フエレット、高から低の順に示すように感染している線虫の生存率: A. ポリエステル、A. より、A. サルモニシダ、 A. dhakensis。毒性の間で、アエロモナス?...

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Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

線虫におけるアエロモナス感染症を研究する 3 つの実験を紹介します。これらの便利なメソッドを使用して、間とAeromonas種内の毒性を評価するために簡単です。

病原性と線虫モデルにおけるアエロモナス感染症の病態の評価

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

この方法は、細菌感染の病原性および病原性などの宿主病原体相互作用分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、アエロモナス種間およびアエロモナス種内の毒性を評価し、アエロモナス感染の病因の理解に貢献できることです。滅菌脱イオン水で約2,000グレイド成虫を洗浄し始める。チューブの底にワームを保つ洗浄を3回繰り返します。遠心分離後、ワームは上清を除去し、3.5ミリリットルの脱イオン水に保管します。次亜塩素酸ナトリウム1ミリリットルと水酸化カリウム0.5ミリリットルをチューブに加えます。その後、ワームの体をライスするために6分間チューブを振ります。卵が放出された後、10ミリリットルの脱イオン水を加えて、リシスを止めます。その後、卵を引き下げ、できるだけ多くの上清を取り除くためにチューブを遠心分離します。M9培地15ミリリットルで卵を少なくとも3回洗います。卵を3.5センチメートルの皿に移し、1泊摂氏20度でインキュベートします。この後、プレートからL1ワームとM9培地の10マイクロリットルを除去します。ワームを数え、M9培地中のL1ワームの濃度を取得します。ピペットを使用すると、0.5ミリリットルの大腸菌OP50 LBスープを取り、ENGMプレートに広げます。その後、16〜18時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。ENGMを室温まで冷却します。その後、大腸菌OP50とENGMプレートにL1ワームをインキュベートシード。彼らはL4段階に達するまで、摂氏20度でワームをインキュベート。まず、4つのアエロモナス株のそれぞれの単一コロニーを選択し、テキストプロトコルに従ってそれらを培養する。次に、細菌性ブロスのOD600吸光度を測定し、吸光度が2.0に等しくなるまで調整します。次のスポットとNGMプレートに各株から細菌のスープの30マイクロリットルを広げます。ランダムに選択し、アエロモナス株とNGMプレートに以前に調製したL4ワームを転送します。その後、アッセイが完了するまで20°Cでプレートをインキュベートします。毎日生きているワームのすべてを細菌と新しいNGMプレートに移します。最後のワームが死ぬまで、毎日生きている、死んでいる、センサーのワームの数を数える。前述のようにアエロモナス株を培養し、その吸光度を測定した後、細菌のスープを3、500gで15分間遠心する。細菌のスープをS培地で調整します。そして、96ウェルプレートの8つの井戸にS培地に細菌スープの195マイクロリットルを追加します。彼らはM9培地でENGMプレートからワームを洗い流します。次に、マイクロリットル当たり5ワームにワーム溶液の濃度を調整します。96ウェルプレートの各ウェルにワーム溶液の5マイクロリットルを追加します。シェーカーにプレートをインキュベートし、24、48、72時間で生きたワームの数を数えます。アエロモナス株を培養し、テキストプロトコルスポットに応じて吸光度を調整し、NGMプレート上に細菌のスープを広めた後。この後、50 L4ワームを各NGMプレートに移します。24時間ごとに、ワームを新鮮なNGMプレートに移します。ランダムに10のワームを選択し、スライド上のM9培地で2%アガロースゲルに移します。最後に、カバースリップをゲルに配置し、カメラを搭載した蛍光顕微鏡上の緑色蛍光タンパク質フィルターで筋肉画像をキャプチャします。このプロトコルでは、4つのアエロモナス株の毒性が評価された。アエロモナス種に感染したC.エレガンスの生存率は、A.キャビアを使用したアッセイで最も高く、A.dhakensisを使用したアッセイでは最も低かった。液体毒性アッセイでは、A.dhakensisまたはA.親水性に感染すると、C.elegansの生存率が有意に低下した。筋肉壊死アッセイでは、アエロモナス種の間で筋肉の損傷の程度が異なった。A.キャビアは筋肉の損傷を最も少ない原因とし、A.dhakensisは最も筋肉の損傷を引き起こした。このビデオで説明されている方法は、アエロモナス種間およびアエロモナス種内の毒性の多様性を区別するための便利な方法を提供します。さらに、病原体と宿主の間の相互作用を研究するための信頼できるモデルでもあります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

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Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

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