Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

وأيده البحث عنها في هذا المنشور بالمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وموسكولوسكيليتال وأمراض الجلد من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم R15AR064481، جائزة "مؤسسة العلوم الوطنية" (CMMI-1404716)، فضلا عن معهد العلوم البيولوجية ولاية أركنسو.

1-إنتاج مصفوفة خارج الخلية باستخدام أغشية الألياف المجوفة قرباني
تنبيه: N-الميثيل-2-بولي هو مذيب مزعجة وأنها سامة للإنجاب. قد يسبب التعرض لكرت تهيج الجلد والعينين، والأنف والحنجرة. وينبغي استخدام المقاوم للمذيبات من معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع كرت. ينبغي أن يجري استخ...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

تمكين العمليات الوارد وصفها إنتاج السائبة ECM الحيوية في المختبر باستخدام أغشية الألياف المجوفة يلقي بغزل رطب الجاف-جت نظام يسمح بإنتاج كميات كبيرة غير مكلفة الأغشية، فضلا عن معدات الثقافة خلية قياسية. بينما يعتزم استخدامها في خلية ثقافة الأغشية ملفقة في هذا البروتوكول، كما يمكن تكي?...

السقالات الجراحية القابلة للغرس تكون لاعبا أساسيا لإصلاح الجرح، مع ما يزيد على 1 مليون تنسجم البوليمر الاصطناعية مزروع في جميع أنحاء العالم كل سنة لإصلاح جدار البطن وحدها1. ومع ذلك، بعد زرع البوليمرات الاصطناعية المواد المستخدمة تقليديا في تلفيق هذه السقالات تميل إلى إثارة استجابة هيئة خارجية، أدى إلى التهاب ضارة إلى الدالة للزرع وتندب من أنسجة2 . علاوة على ذلك، كما لا يتم تشكيلها مواد مش الاصطناعية السائدة (أي، بولي بروبلين) ملحوظ من الهيئة، فتنطبق عموما على الأنسجة حيث يمكن التغاضي تندب، يحد من فائدتها السريرية تجاه المعاملة الأنسجة مع الدالة أعلى ترتيب مثل العضلات. بينما هناك العديد من المنتجات مش الجراحية التي طبقت بنجاح السريرية، الشركة المصنعة مؤخرا تشير إلى الاصطناعية الجراحية تنسجم والمضاعفات الناتجة عن عملية زرع الأنسجة فيما تبرز أهمية بلوغ الحد الأقصى لزرع توافق مع الحياة، مما دفع إدارة الأغذية والعقاقير لتشديد اللوائح المتعلقة بالعمليات الجراحية مش المصنعين3،4. غرس السقالات المستمدة من الأنسجة المرضى الخاصة يقلل من هذه الاستجابة المناعية، ولكن يمكن أن ينتج الاعتلال موقع المانحة الكبيرة5. المصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالات أنتجت في المختبر بديل ممكن، كما يحمل ديسيلولاريزيد ECM السقالات ممتازة توافق مع الحياة، لا سيما في حالة ECM ذاتي يزرع6.
بسبب محدودية توافر أنسجة المريض الحصاد لزرع ذاتي وخطر إعاقة وظيفة في موقع الجهات المانحة، القدرة على إنتاج المحتوى السقالات في المختبر من ثقافة خطوط الخلايا البشرية، أو إذا كان ذلك ممكناً، مريض الخلايا الخاصة بديل جذاب. التحديات الرئيسية في صنع كميات كبيرة من إدارة المحتوى في المؤسسة في المختبر هو عزل هذه الجزيئات صعبة الالتقاط. وقد أثبتنا في الأعمال السابقة، أن إدارة المحتوى في المؤسسة يمكن أن تنتج من استزراع الخلايا الليفية إفراز ECM في الرغاوي البوليمرية الذبيحة التي يتم حله بعد فترة الثقافة إلى ECM الغلة التي يمكن ديسيلولاريزيد لغرس7، 89،،10. كما أصدرت إدارة المحتوى في المؤسسة في الرغاوي تميل إلى اعتماد البنية الداخلية الرغاوي، استكشفت أغشية الألياف المجوفة (هفمس) سقالة الذبيحة لإنتاج مؤشرات الترابط لإدارة المحتوى في المؤسسة. المبينة في هذا التقرير أساليب مهمة لقياس معمل تصنيع أغشية الخلية ثقافة نوعية الألياف الجوفاء واستخراج الألياف المصفوفة خارج الخلية الجزء الأكبر من نفسه بعد فترة من الثقافة تنتجها الخلايا الليفية. هذا النهج ثقافة ثابتة سهولة تبني المختبرات تحتوي على معدات الثقافة خلية الثدييات القياسية. يمكن تطبيق إدارة المحتوى في المؤسسة التي تنتجها هذه النهج تجاه مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

تصميم السقالات المستمدة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) قد مدفوعة مصلحة كبيرة في الطب لإمكاناتها في التعجيل بالجرح بالإغلاق والشفاء. استخراج المصفوفة خارج الخلية من التليف خلية الثقافات في المختبر قدرة كامنة لجيل من إدارة المحتوى في المؤسسة من خطوط الخلايا البشرية-ويحتمل أن تكون خاصة بالمريض والتقليل من الوجود [ابيتوبس] إكسينوجينيك الذي أعاق في السريرية نجاح بعض المنتجات الموجودة في إدارة المحتوى في المؤسسة. تحديا كبيرا في الإنتاج في المختبر لإدارة المحتوى في المؤسسة مناسبة لغرس أن إنتاج المحتوى بثقافة الخلية عادة ذات القوة المنخفضة نسبيا. في هذا العمل، ويرد وصف بروتوكولات لإنتاج المحتوى بالخلايا المزروعة داخل ألياف جوفاء الذبيحة غشاء السقالات. أغشية الألياف المجوفة مثقف مع خطوط الخلايا تنتجها الخلايا الليفية في وسط خلية تقليدية وحلت بعد زراعة الخلايا تسفر عن المواضيع مستمر من إدارة المحتوى في المؤسسة. الألياف الناتجة عن إدارة المحتوى في المؤسسة المنتجة بهذا الأسلوب يمكن أن يكون ديسيلولاريزيد والمجففة بالتبريد، جعلها مناسبة للتخزين وغرس.

النجاح في إنتاج المصفوفة خارج الخلية من السقالات الذبيحة مرهون بتلفيق سقالة ملائمة وخلية ثقافة وإجراءات الشطف المذيبات. تصنيع الأغشية الألياف الجوفاء التي تتم باستخدام نظام الغزل الرطب الجاف-جت تجميعها من المكونات المتوفرة تجارياً (الشكل 1) الذي يستخدم ...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

والهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج الألياف مصفوفة كاملة من خارج الخلية المستهدفة لإصلاح الجرح التي مناسبة للتقييم السريري كجزء من زرع السقالة التجدد. هذه الألياف التي تنتجها ثقافة الليفية في أغشية الألياف الجوفاء والمستخرجة بواسطة انحلال الأغشية.

إنتاج ألياف المصفوفة خارج الخلية عبر الألياف المجوفة الذبيحة غشاء الخلية والثقافة

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

يسمح هذا البروتوكول بإنتاج خيوط من مصفوفة خارج الخلية من خطوط الخلايا المستزرعة ، مما يسمح بإجراء أبحاث في تفاعلات مصفوفة الخلايا ، وكذلك البحث في إمكانات هذه المواد الحيوية لإصلاح الجروح. هذه الألياف الاصطناعية يمكن تجنب استجابة الجسم الأجنبية الموجهة ضد المواد الاصطناعية، في حين لا يزال الرسم من ذخيرة غنية من تقنيات تصنيع المنسوجات لخلق مجموعة واسعة من الزرع المنسوجة. (إنّها ستُظهر الإجراء ستكون (كاساندرا ريد طالبة دراسات عليا من مختبريقبل بذر الخلايا، وأتمتة أغشية الألياف المجوفة في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تليها العلاج مع 50 ملليلتر من الليفي البلازما البقري في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، استخدم مقصًا صغيرًا معقمة لقطع الألياف إلى ستة سنتيمترات أو أقل ، واستخدم حقنة ملليلتر واحدة مجهزة بإبرة قياس 21 لذرة مرة واحدة 10 إلى الخلايا الليفية الخامسة مباشرة إلى لومينا أغشية الألياف المجوفة. ضع ستة ألياف مبذرة في طبق بيتري قطره ستة بوصات، وحضن الألياف المصنفة لفترة وجيزة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد خمس دقائق، نقل الألياف من الحاضنة إلى طبق جديد من ستة سنتيمترات بيتري يحتوي على ثقافة الخلايا الليفية المتوسطة تكملها حمض L-الاسكوربيك، L-الأسكوربيك حمض 2 الفوسفات، وتحويل عامل النمو بيتا 1 لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، استخدم ملقط يا نقل الألياف المستزرعة إلى قارورة التلألؤ الفردية، وإمالة كل قارورة للسماح بإضافة ما يصل إلى خمسة ملليلتر من N-Methyl-2-pyrrolidone أسفل جانب القنينات. ثم استخدام ماصة المصلية لpirate ببطء N-ميثيل-2-pyrrolidone من كل الألياف، ونقل الألياف إلى قارورة تلة جديدة للغمر الثاني في الطازجة N-الميثيل-2-بيروليدون.بعد الغمر الثالث ، شطف المصفوفة خارج الخلية الناتجة عن المواضيع ثلاث مرات في المياه الأيونية بطريقة مماثلة ، ووضع ثلاثة بوصة طويلة ، بوصة واحدة واسعة 1 / 23rd بوصة سميكة قطعة من المطاط السيليكون مع قالب مستطيل مركزي ثمانية في أربعة ملليمترات على معيار ثلاثة في واحد بوصة شريحة المجهر الزجاجي بوصة. بعد autoclaving، وضع كل مصفوفة خارج الخلية الألياف جنبا إلى جنب في قالب السيليكون ثمانية في أربعة ملليمتر حتى لا يكون هناك مساحة مفتوحة مرئية. وضع القالب في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وتجميد الألياف في درجة مئوية سلبية 80 حتى المجمدة تماما.لفك الخلايا، احتضان القالب في 1٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة على الروك مع التحريض لطيف. في اليوم التالي ، شطف المصفوفة المستخرجة خارج الخلية مع ثلاثة يغسل في ثلاثة ملليلتر من PBS لكل غسل ، وملء القالب مع DNAs الطازجة المعدة / RNAs الهضم العازل لمدة ست ساعات حضانة في أربع درجات مئوية. في نهاية عملية الهضم، الطامح حل الهضم وشطف القالب ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني عقيم كما هو موضح.بعد الغسيل الثالث، احتضان السقالات في 10٪ بنسيلين-ستريبتوميسين في PBS في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل أن يتجمد في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر في درجة مئوية سالبة 80 لمدة ساعة واحدة. عندما تكون الشبكة قد جمدت تماما، lyophilize شبكة خارج الخلية decellularized بين عشية وضحاها، أو حتى تجف تماما، ونقل السقالات مزيل التحلل إلى وعاء معقمة داخل غطاء محرك السيارة السلامة الحيوية وتخزينها في أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. هنا يظهر مقطع عرضي من غشاء الألياف المجوفة polysulfone ملفقة باستخدام هذا البروتوكول، وعرض الطبقات الخارجية والداخلية من المسام مثل الإصبع مميزة من غشاء غير متماثل.بعد بذر الخلايا الليفية والثقافة، يتم إنتاج N-Methyl-2-pyrrolidone الشطف كما هو موضح، والخيوط شفافة من مصفوفة خارج الخلية. المصفوفة خارج الخلية إنتاج الخلايا لا تزال قابلة للحياة داخل الأغشية الألياف المجوفة طوال فترة ثقافة ثلاثة أسابيع كاملة. المصفوفة المستخرجة لها مظهر شفاف عند ترطيبها ، وتظهر لونًا أبيضًا ومظهرًا ليفيًا مع محاذاة طولية إجمالية عند تجميع الشبكة وتجميل الأطفال.الخطوة الأكثر أهمية هي عملية حل أغشية الألياف المجوفة المستزرعة في مذيبات N-Methyl-2-pyrrolidone من أجل استخراج المصفوفة خارج الخلية. يمكن استخدام المواد التي تنتجها هذه الطريقة لاصطياد الأنسجة هندسيا يزرع للتحقيق في إصلاح الأنسجة في الدراسات قبل السريرية. N-ميثيل-2-pyrrolidone المستخدمة في هذا البروتوكول هو مصدر تهيج الجلد والعين، وبالتالي فمن المستحسن أن التعامل مع هذه المادة الكيميائية باستخدام قفازات النتريل، نظارات واقية، معطف مختبر، والتعامل معها داخل غطاء الدخان.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

الظهارية إعادة تعمير خلية وإعداد القوارض خارج الخلية مصفوفة السقالات للتنمية نسيج الكلى

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

المفاعلات الحيوية الألياف المجوفة ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تشبه الثدييات زراعة الأنسجة

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

إعداد ألياف البروتين خارج الخلية مصفوفة لBrillouin الطيفي

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...