Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af det nationale Institut for gigt og bevægeapparat og hudsygdomme af National Institutes of Health under award nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt den Arkansas Biosciences Institute.

1. produktionen af ekstracellulære Matrix bruger opoffrende hule fibre membraner
Forsigtig: N-methyl-2-pyrrolidon er en irriterende opløsningsmiddel og reproduktive giftstoffet. Udsættelse for NMP kan forårsage irritation af hud, øjne, næse og hals. Solvens-resistente personlige værnemidler skal anvendes, når håndtering NMP. Brug af NMP bør udføres i et stinkskab.
<ol><li>Forberedelse af polysulfone polymer løsning til hule fibre membraner
	<ol>
<li>70 g af polys...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

De processer, der er beskrevet aktiverer produktionen af bulk ECM biomaterialer in vitro- ved hjælp af hule fibre membraner støbt af en tør-jet våde spinning system giver mulighed for billig bulk produktionen af membraner samt standard celle kultur udstyr. Mens membraner fabrikeret i denne protokol er beregnet til brug i cellekultur, kan systemet beskrevet også være tilpasset til fremstilling af membraner til adskillelse formål, med pore distribution og hule fibre størrelsesdimensioner afstemmelige af va...

Implantable kirurgisk stilladser er et armatur af sår reparation, med over en million syntetisk polymer masker implanteret på verdensplan hvert år for bugvæggen reparation alene1. Men efter implantation syntetiske materialer polymerer traditionelt anvendes i fremstilling af disse stilladser har tendens til at fremprovokere en udenlandsk organ svar, resulterer i inflammation skadelige til funktionen af implantatet og ardannelse i væv2 . Yderligere, da de fremherskende syntetiske mesh materialer (dvs., polypropylen) ikke er mærkbart ombygget af kroppen, de er generelt gælder for væv hvor ardannelse kan tolereres, begrænse deres kliniske anvendelighed mod behandling af væv med højere-ordens funktion såsom muskel. Mens der er mange kirurgiske mesh produkter, der er blevet anvendt med kliniske succes, seneste producent, der minder om af syntetisk kirurgiske masker og komplikationer fra interspecies væv implantater fremhæve betydningen af maksimering af implantat biokompatibilitet, at spørge FDA til at stramme reglerne på kirurgisk mesh producenter3,4. Implantation af stilladser afledt af patienternes egne væv reducerer denne immunrespons, men kan resultere i betydelige donor-site sygelighed5. Ekstracellulær matrix (ECM) stilladser fremstillet in vitro- er et muligt alternativ, som decellularized ECM stilladser udstiller fremragende biokompatibilitet, især i tilfælde af autolog ECM implantater6.
På grund af de begrænsede mængder af patient væv til at høste til autolog implantation og risikoen for at hæmme funktion på webstedet donor, evnen til at producere ECM scaffolds in vitro- fra kulturen af human cellelinjer eller, hvis det er muligt, en patient egne celler er et attraktivt alternativ. De primære udfordringer i fremstilling af betydelige mængder af ECM i vitro er binding af disse vanskeligt at fange molekyler. I tidligere arbejde, vi har bevist, at ECM kan være fremstillet ved dyrkning af ECM-secernerende fibroblaster i opoffrende polymere skum, der er opløst efter perioden kultur til udbytte ECM, som kan være decellularized for implantation7, 8,9,10. ECM fremstillet i skum tendens til at vedtage den interne arkitektur af skum, hule fibre membraner (HFMs) blev undersøgt som en opoffrende stillads til produktion af tråde af ECM. Beskrevet heri er metoder opgave for lab skala fremstilling af cellemembraner kultur kvalitet hule fibre og udvinding af bulk ekstracellulære matrix fibre fra den samme efter en periode med fibroblast kultur. Denne statiske kultur tilgang er let adoptere af laboratorier som indeholder standard pattedyr celle kultur udstyr. ECM produceret af denne tilgang kunne anvendes mod en række kliniske applikationer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Manipuleret stilladser afledt af ekstracellulære matrix (ECM) har drevet betydelig interesse i medicin for deres potentiale i fremskynde sår lukning og healing. Udvinding af ekstracellulære matrix fra fibrogenic celle kulturer i vitro har potentiale for generation af ECM fra menneskelige- og potentielt patient-specifikke cellelinjer, minimere forekomsten af xenogene epitoper, som har hindret den kliniske succes af nogle eksisterende ECM produkter. En betydelig udfordring i in vitro- produktion af ECM egnet til implantation er at ECM produktion af cellekultur er typisk relativt lavt udbytte. I dette arbejde, er protokoller beskrevet til produktion af ECM af celler kulturperler inden for hellige hule fiber membran stilladser. Hule fibre membraner er kulturperler med fibroblast cellelinjer i en konventionel celle medium og opløst efter cellekultur at give kontinuerlig tråde af ECM. De resulterende ECM fibre fremstillet af denne metode kan decellularized og frysetørret, gør dem egnet til opbevaring og implantation.

Vellykket produktion af ekstracellulære matrix fra opoffrende stilladser er betinget af passende stillads fabrikation, cellekultur og opløsningsmidler skyl procedurer. Fabrikation af hule fibre membraner udføres ved hjælp af en tør-jet våd-spinning system samlet fra kommercielt tilgængelige komponenter (figur 1) som bruger ekstrudering af polymer løsning gennem annulus af et kommercielt tilgængelige stål spindedyse (indre diameter = 0,8 mm, ydre dia...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Målet med denne protokol er produktion af hele ekstracellulære matrix fibre indskyde nemlig sår reparation, som er egnet til præklinisk evaluering som en del af en regenerativ stillads implantat. Disse fibre er produceret af kulturen i fibroblaster på hule fibre membraner og udvindes ved opløsning af membraner.

Produktion af ekstracellulære Matrix fibre via hellige hule Fiber membran cellekultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Denne protokol giver mulighed for produktion af filamenter af bulk ekstracellulære matrix fra dyrkede cellelinjer, der giver mulighed for forskning i celle matrix interaktioner, samt forskning i potentialet i dette biomateriale til sårreparation. Disse syntetiske fibre kan undgå fremmedlegeme respons rettet mod syntetiske materialer, mens du stadig trække fra den rige repertoire af tekstil fabrikation teknikker til at skabe en bred vifte af vævede implantables. At demonstrere proceduren vil være Cassandra Reed, en kandidatstuderende fra mit laboratorium.Før såning af cellerne, autoklave de hule fibermembraner ved 121 grader Celsius i 30 minutter, efterfulgt af behandling med 50 milliliter kvæg plasma fibronectin i PBS ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i en time. I slutningen af inkubationen, bruge sterile mikro saks til at skære fibrene til seks centimeter eller mindre, og bruge en en milliliter sprøjte udstyret med en 21 gauge nål til frø en gange 10 til den femte fibroblast celler direkte ind i lumina af de hule fibermembraner. Placer seks seedede fibre i en seks tommer diameter Petriskål, og kort inkubere de seedede fibre på 37 grader Celsius i 5% kuldioxid.Efter fem minutter, overføre fibrene fra inkubatoren i en ny seks centimeter petriskål, der indeholder fibroblast kultur medium suppleret med L-ascorbinsyre, L-ascorbinsyre 2 fosfat, og omdanne vækstfaktor beta 1 i op til tre uger i cellekultur inkubator. Ved inkubationens afslutning anvendes der en kraftbefængt, hvor de dyrkede fibre overføres til individuelle scintillationshætteglas, og hvert hætteglas tilsættes for at tillade tilsætning af op til fem milliliter N-Methyl-2-pyrrolidon ned ad siden af hætteglassene. Brug derefter en serologisk pipette til langsomt at aspirere N-Methyl-2-pyrrolidon fra hver fiber, og overføre fibrene til nye scintillation hætteglas til en anden nedsænkning i frisk N-Methyl-2-pyrrolidon.Efter den tredje nedsænkning, skyl den resulterende ekstracellulære matrix tråde tre gange i deioniseret vand på samme måde, og placere en tre-tommer-lang, en-tommer bred 1/23rd-inch-tykt stykke silikone gummi med en central otte-by-fire millimeter rektangulær skimmel på en standard tre-af-en tommer glas mikroskop dias. Efter autoclaving, lå hver ekstracellulære matrix fiber side om side i otte-by-fire millimeter silikone skimmel, indtil der ikke er nogen synlig åbent rum. Placer formen i en 50 milliliter konisk rør, og fryse fibrene ved negative 80 grader Celsius indtil helt frosset.For decellularisering, inkubere formen i 1% natrium dodecyli sulfat i 24 timer ved stuetemperatur på en rocker med blid omrøring. Den næste dag skylles den ekstracellulære matrix med tre skiver PBS pr. vask, og fyld formen med frisklavede DNAs/RNAs fordøjelsesbuffer for en seks timers inkubation ved fire grader Celsius. Ved afslutningen af fordøjelsen aspirere fordøjelsen opløsning og skyl formen tre gange i sterile PBS som påvist.Efter den tredje vask inkuberes stilladserne i 10% Penicillin-Streptomycin i PBS ved fire grader Celsius natten før frysning i et 50 milliliter konisk rør ved negative 80 grader Celsius i ca. en time. Når masken er helt frosset, lyophilize den decellulære ekstracellulære mesh natten over, eller indtil helt tør, og overføre lyophilized stilladser til en steril beholder i en bio sikkerhed hætte og opbevares på fire grader Celsius indtil brug. Her vises et tværgående tværsnit af en polysulfon hul fibermembran fremstillet ved hjælp af denne protokol, udviser ydre og indre lag af finger-lignende porer karakteristisk for en asymmetrisk membran.Efter fibroblast celle såning og kultur, N-Methyl-2-pyrrolidon skylning som påvist, gennemskinnelige tråde af ekstracellulære matrix er produceret. Den ekstracellulære matrix producerer celler forbliver levedygtige inde i hule fibermembraner i hele tre uger kultur periode. Den ekstraherede matrix har et gennemskinneligt udseende, når hydreret, udviser en off-white farve og fibrøst udseende med en grov langsgående tilpasning på mesh samling og lyophilization.Det mest kritiske skridt er opløsningsprocessen af de dyrkede hule fibermembraner i N-Methyl-2-pyrrolidonopløsningsopløsningsmidlet for at udtrække den ekstracellulære matrix. Materialet, der produceres ved denne metode, kan anvendes til fremstilling af vævsudviklede implantater til undersøgelse af reparation af væv i prækliniske undersøgelser. N-Methyl-2-pyrrolidon, der anvendes i denne protokol, er et hud- og øjenirriterende, og derfor anbefales det, at du håndterer kemikaliet ved hjælp af nitrilhandsker, beskyttelsesbriller, en laboratoriekittel og håndterer det i en røghætte.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri overvågning af celler og ekstracellulær matrix ved hjælp af Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epithelial cellerepopulationskilde og Udarbejdelse af Gnaver ekstracellulær matrix Stilladser for Renal Tissue Udvikling

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hul fiber Bioreaktorer for<em&gt; In vivo</em&gt; -lignende Pattedyr Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Fremstilling af ekstracellulært matrixprotein fibre til Brillouin Spektroskopi

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogeler fra Pulmonal ekstracellulære matrix for 3D cellekultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrikation af ekstracellulære matrix-afledte Skum og Mikrobærere som Tissue-specifikke cellekultur og Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Opdigte en nyre Cortex ekstracellulære Matrix-afledte Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreasvæv-afledte ekstracellulære matrix Bioink til udskrivning 3D celle-lastet pancreas væv konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En menneskelig 3D ekstracellulær matrix-Adipocyte kultur model for at studere matrix-celle metaboliske Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...