Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het nationale Instituut van artritis en Musculoskeletal en ziekten van de huid van de National Institutes of Health award onder nummer R15AR064481, de National Science Foundation (CMMI-1404716), evenals de Arkansas Biosciences Instituut.

1. productie van extracellulaire Matrix met behulp van opofferende holle vezel membranen
Let op: N-methyl-2-pyrrolidon is een irritante oplosmiddel en reproductieve veroorzaken. Blootstelling aan NMP kan irritatie aan de huid, ogen, neus en keel veroorzaken. Oplosmiddel-resistente persoonlijke beschermingsmiddelen moet worden gebruikt bij de behandeling van NMP. Gebruik van NMP moet worden uitgevoerd in een zuurkast.
<ol><li>Voorbereiding van Polysulfon polymeeroplossing holle vezel ...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

De beschreven procédés in staat stellen de productie van de bulk ECM biomaterialen in vitro met holle vezel membranen gegoten door een systeem van de dry-jet natte spinnen waardoor voor goedkope bulk productie van membranen evenals standaard cel cultuur apparatuur. Terwijl de membranen vervaardigd in dit protocol zijn bedoeld voor gebruik in de cultuur van de cel, kan het systeem beschreven ook worden aangepast voor de productie van membranen voor scheiding doeleinden, met porie instelbare distributie en holle...

Implanteerbare chirurgische steigers zijn een bevestiging van de reparatie van de wond, met meer dan een miljoen synthetisch polymeer mazen geïmplanteerd wereldwijd jaarlijks buikwand reparatie alleen1. Echter, na implantatie de synthetische materialen polymeren van oudsher in de fabricage van deze steigers gebruikt de neiging om te provoceren een vreemd lichaam reactie, resulterend in ontsteking schade wordt berokkend aan de functie van het implantaat en littekens van weefsel2 . Verder, zoals de overheersende synthetische mesh-materiaal (dat wil zeggen, polypropyleen) zijn niet merkbaar verbouwd door het lichaam, ze zijn algemeen van toepassing op weefsels waar littekens kan worden getolereerd, beperken hun klinische nut richting de behandelingvan weefsels met hogere-orde functie zoals spier. Hoewel er vele chirurgische mesh-producten die zijn vereffend met klinische succes, herinnert recente fabrikant van synthetische chirurgische netten en complicaties van interspecies weefsel implantaten wijzen op het belang van het maximaliseren van implantaat biocompatibiliteit, waarschuwing van de FDA te scherpen verordeningen op chirurgische mesh fabrikanten3,4. Implantatie van steigers uit patiënten eigen weefsels verkregen vermindert deze immuunrespons, maar kan leiden tot belangrijke donor-site morbiditeit5. Extracellulaire matrix (ECM) steigers, geproduceerd in vitro zijn een mogelijk alternatief, zoals decellularized ECM steigers exposeren uitstekende biocompatibiliteit, met name in het geval van autologe ECM implantaten6.
Vanwege de beperkte beschikbaarheid van weefsel van de patiënt om te oogsten voor autologe implantatie en het risico van het belemmeren van de functie op de site van de donor, het vermogen te produceren ECM steigers in vitro van de cultuur van menselijke cellijnen of, indien mogelijk, van een patiënt eigen cellen is een aantrekkelijk alternatief. De belangrijkste uitdagingen bij de vervaardiging van aanzienlijke hoeveelheden van ECM in vitro is de vastlegging van deze moleculen moeilijk-aan-vangst. In eerdere werk, hebben wij aangetoond dat ECM kan worden geproduceerd door het kweken van ECM-afscheidende fibroblasten in opofferende polymere schuimen die zijn ontbonden na de periode van de cultuur aan opbrengst ECM die kan worden decellularized voor implantatie7, 8109,,. ECM geproduceerd in schuim de neiging aan te nemen van de interne architectuur van het schuim, holle vezel membranen (HFMs) werden verkend als een offer steiger voor productie van draden voor ECM. Hierin beschreven zijn methoden belast voor lab schaal vervaardiging van cultuur kwaliteit holle vezel celmembranen en de winning van bulk extracellulaire matrix vezels uit hetzelfde na een periode van fibroblast cultuur. Deze statische cultuur aanpak is gemakkelijk adoptable door laboratoria met standaard zoogdieren cel cultuur apparatuur. ECM geproduceerd door deze aanpak kan worden toegepast naar een scala aan klinische toepassingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Gemanipuleerde steigers afgeleid van extracellulaire matrix (ECM) hebben gedreven significant belang in de geneeskunde voor hun potentieel in de bespoediging van de wond sluiting en genezing. Extractie van extracellulaire matrix van fibrogenic cel culturen in vitro heeft potentieel voor generatie van ECM van menselijke- en potentieel patiënt-specifieke cellijnen, minimaliseren van de aanwezigheid van XENOGENECELLEN epitopes die heeft belemmerd de klinische succes van sommige bestaande ECM-producten. Een belangrijke uitdaging in in vitro -productie van ECM geschikt voor implantatie is dat ECM productie door celkweek meestal voor relatief lage opbrengst. In dit werk, worden protocollen beschreven voor de productie van ECM door cellen gekweekte binnen opofferende holle vezel membraan steigers. Holle vezel membranen zijn gekweekt met fibroblast cellijnen in een conventionele cel medium en ontbonden na celkweek continue draden van ECM opleveren. De resulterende ECM vezels geproduceerd door deze methode kunnen worden decellularized en gelyofiliseerde vorm, waardoor het geschikt is voor opslag en implantatie.

Succesvolle productie van extracellulaire matrix van opofferende steigers is afhankelijk van de juiste steiger fabricage, celkweek en oplosmiddel spoelen procedures. Fabricage van de holle vezel membranen wordt uitgevoerd met behulp van een dry-jet NAT-spinnen systeem samengesteld uit commercieel beschikbare componenten (Figuur 1) die gebruik maakt van de extrusie van polymeeroplossing via de annulus van een commercieel beschikbare staal spinneret (binnendiam...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Het doel van dit protocol is productie van hele extracellulaire matrix vezels die voor reparatie van de wond wordt gericht die geschikt voor preklinische evaluatie als onderdeel van een regeneratieve steiger implantaat zijn. Deze vezels worden geproduceerd door de cultuur van fibroblasten op holle vezel membranen en geëxtraheerd door ontbinding van de membranen.

Productie van extracellulaire Matrix vezels via cultuur van de cel van de membraan van opofferende holle vezel

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Dit protocol maakt de productie van filamenten van bulk extracellulaire matrix uit gekweekte cellijnen mogelijk, waardoor onderzoek naar celmatrixinteracties mogelijk is, evenals onderzoek naar het potentieel van dit biomateriaal voor wondreparatie. Deze synthetische vezels kunnen voorkomen dat de vreemde lichaam reactie gericht tegen synthetische materialen, terwijl nog steeds putten uit het rijke repertoire van textiel fabricage technieken om een breed scala van geweven implantables te creëren. Het aantonen van de procedure zal Cassandra Reed zijn, een afgestudeerde student van mijn lab.Voordat u de cellen inzaait, worden de holle vezelmembranen gedurende 30 minuten bij 121 graden Celsius gelegerd, gevolgd door een behandeling met 50 milliliter runderplasmafibronectine in PBS bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende een uur. Gebruik aan het einde van de incubatie steriele microschaar om de vezels tot zes centimeter of minder te snijden en gebruik een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 21 meter om één keer 10 tot de vijfde fibroblastcellen rechtstreeks in de lumina van de holle vezelmembranen te zaaien. Plaats zes gezaaide vezels in een petrischaal met een diameter van zes inch en broed de ingezaaide vezels kort uit op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide.Na vijf minuten, breng de vezels uit de couveuse in een nieuwe zes centimeter Petri schotel met fibroblast cultuur medium aangevuld met L-ascorbine zuur, L-ascorbine zuur 2 fosfaat, en het transformeren van groeifactor beta 1 voor maximaal drie weken in de celcultuur incubator. Gebruik aan het einde van de incubatie de gekweekte vezels in afzonderlijke scintillatiefruiven en kantel elke flacon om de toevoeging van maximaal vijf milliliter N-Methyl-2-pyrrolidon aan de zijkant van de flacons mogelijk te maken. Gebruik vervolgens een serologische pipet om de N-Methyl-2-pyrrolidone van elke vezel langzaam aan te trekken en de vezels over te brengen in nieuwe scintillatiefoliefolie voor een tweede onderdompeling in verse N-Methyl-2-pyrrolidone.Na de derde onderdompeling, spoel de resulterende extracellulaire matrix draden drie keer in gedeïmiseerd water op een vergelijkbare manier, en plaats een drie-inch-lange, een-inch breed 1/23rd-inch-dik stuk siliconen rubber met een centrale acht-bij-vier millimeter rechthoekige mal op een standaard drie-bij-een inch glazen microscoop dia. Na autoclaving, leg elke extracellulaire matrix vezel naast elkaar in de acht-bij-vier millimeter siliconen mal totdat er geen zichtbare open ruimte. Plaats de mal in een 50 milliliter conische buis, en bevriezen de vezels op negatieve 80 graden Celsius tot volledig bevroren.Voor decellularisatie, incubeer de mal in 1%natrium dodecylsulfaat gedurende 24 uur bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar met zachte agitatie. Spoel de volgende dag de extracellulaire matrix met drie wasbeurten in drie milliliter PBS per wasbeurt en vul de mal met vers bereide RNAs/RNAs-spijsverteringsbuffer voor een incubatie van zes uur bij vier graden Celsius. Aan het einde van de spijsvertering, aspirate de spijsvertering oplossing en spoel de mal drie keer in steriele PBS zoals aangetoond.Na de derde wasbeurt, incubeer de steigers in 10%Penicilline-Streptomycine in PBS op vier graden Celsius 's nachts voor het bevriezen in een 50 milliliter conische buis bij negatieve 80 graden Celsius voor ongeveer een uur. Wanneer het gaas volledig bevroren is, lyophilize de gedecellulariseerde extracellulaire gaas 's nachts, of totdat volledig droog, en breng de lyofphilized steigers naar een steriele container binnen een bio-veiligheidskap en op te slaan op vier graden Celsius tot gebruik. Hier wordt een dwarsdoorsnede van een polysulfone holle vezelmembraan getoond dat met behulp van dit protocol is vervaardigd, met buitenste en binnenlagen van vingerachtige poriën die kenmerkend zijn voor een asymmetrisch membraan.Na fibroblast cel zaaien en cultuur, N-Methyl-2-pyrrolidone spoelen zoals aangetoond, doorschijnende draden van extracellulaire matrix worden geproduceerd. De extracellulaire matrixproducerende cellen blijven levensvatbaar in de holle vezelmembranen gedurende de gehele drie weken cultuurperiode. De geëxtraheerde matrix heeft een doorschijnend uiterlijk wanneer gehydrateerd, vertonen een off-witte kleur en vezelige uitstraling met een bruto longitudinale uitlijning op mesh assemblage en lyophilization.De meest kritieke stap is het oplosproces van de gekweekte holle vezelmembranen in het N-Methyl-2-pyrrolidone oplosmiddel om de extracellulaire matrix te extraheren. Het materiaal dat met deze methode wordt geproduceerd, kan worden gebruikt voor het fabriceren van weefselgeïnseerde implantaten voor het onderzoeken van de reparatie van weefsels in preklinische studies. De N-Methyl-2-pyrrolidone gebruikt in dit protocol is een huid en oog irriterend, en daarom is het raadzaam dat u de chemische stof te behandelen met behulp van nitril handschoenen, bril, een lab jas, en omgaan met het binnen een rookkap.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Holle vezel voor Bioreactoren<em&gt; In Vivo</em&gt; -achtige Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Bereiding van extracellulaire matrix eiwit vezels voor Brillouin Spectroscopie

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabriceren van een nier Cortex extracellulaire Matrix afkomstige Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...