Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Institute of Arthritis et les troubles musculo-squelettiques et les maladies de la peau de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R15AR064481, la Fondation nationale des sciences (CMMI-1404716), ainsi que la Institut de Biosciences de l’Arkansas.

1. production de matrice extracellulaire à l’aide de Membranes fibres creuses sacrificiel
Attention : Le N-méthyl-2-pyrrolidone est un solvant irritant et toxique pour la reproduction. Exposition à NMP peut causer une irritation de la peau, yeux, nez et gorge. Résistant aux solvants Equipement de protection individuelle doit être utilisé lors de la manipulation NMP. Utilisation du NMP doit être effectuée au sein d’une hotte aspirante.
<ol><li>Préparation de la solution ...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

Les procédés décrits permettent la production de masse ECM biomatériaux in vitro à l’aide de membranes fibres creuses fondues par un système de filage humide sec-jet permettant une production bon marché en vrac des membranes ainsi que du matériel de culture cellulaire standard. Alors que les membranes fabriquées dans le présent protocole sont destinées à l’usage en culture cellulaire, le système décrit peut être adapté pour la production de membranes à des fins de séparation, avec pore tail...

Les échafaudages chirurgicaux implantables sont un pilier de cicatrisation, à mailles de polymère synthétique plus 1 million implantés dans le monde entier chaque année pour la paroi abdominale réparation seul1. Cependant, après l’implantation, les polymères synthétiques utilisés traditionnellement dans la fabrication de ces échafaudages ont tendance à provoquer une réaction au corps étranger, ayant pour résultat l’inflammation délétère à la fonction de l’implant et la cicatrisation des tissus2 . En outre, comme les matériaux prédominant maille synthétique (c.-à-d., polypropylène) ne sont pas sensiblement remodelés par l’organisme, ils sont généralement applicables aux tissus où la cicatrisation peut être tolérée, limitant leur utilité clinique vers le traitement des tissus ayant des fonctions d’ordre supérieur comme le muscle. Bien qu’il existe de nombreux produits de treillis chirurgical qui ont été appliquées avec succès clinique, fabricant récent rappels de chirurgical synthétique mailles et complications des implants de tissus inter-espèces soulignent l’importance de maximiser l’implant biocompatibilité, ce qui incite à la FDA pour serrer les règlements sur la chirurgie de maillage fabricants3,4. Implantation des échafaudages provenant de tissus de patients propre réduit cette réponse immunitaire, mais peut se traduire par d’importants donateurs-site morbidité5. Matrice extracellulaire (ECM) échafaudages produites in vitro sont une alternative possible, comme les échafaudages ECM decellularise pièce excellente biocompatibilité, particulièrement dans le cas d’ECM autologue6implants.
En raison de la disponibilité limitée des tissus du patient à la récolte pour l’implantation autologue et le risque d’empêcher la fonction sur le site de donateurs, la capacité de produire des ECM échafaudages in vitro de la culture de lignées cellulaires humaines ou, si possible, un patient les cellules propres est une alternative intéressante. Les défis principaux dans la fabrication de grosses sommes d’ECM dans vitro est la séquestration de ces molécules de difficile-à-capture. Dans un travail antérieur, nous avons démontré que ECM peut être produit en cultivant les fibroblastes qui sécrètent ECM sacrificiel mousses polymères qui sont dissous après la période de culture de rendement ECM, qui peut être decellularized pour implantation7, 8,9,10. Comme ECM produites dans les mousses ont tendance à adopter l’architecture interne des mousses, membranes fibres creuses (HFMs) ont été étudiés comme un échafaudage sacrificiel pour la production de fils des ECM. Décrit ci-après sont méthodes chargés de laboratoire à l’échelle de fabrication des membranes cellulaires culture qualité fibres creuses et l’extraction des fibres de la matrice extracellulaire en vrac de la même après une période de culture de fibroblastes. Cette approche de la culture statique est facilement adoptable par les laboratoires contenant du matériel de culture des cellules de mammifères standard. ECM produite par cette approche pourrait être appliquée vers une variété d’applications cliniques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Échafaudages modifiées dérivées de la matrice extracellulaire (mec) ont entraînée directement visées par la médecine pour leur potentiel dans le déroulement des plaies fermeture et guérison. Extraction de matrice extracellulaire de fibrogène cell cultures in vitro a le potentiel de génération d’ECM de lignées cellulaires humaines - potentiellement axée sur le patient, réduisant au minimum la présence d’épitopes xénogéniques qui entrave la clinique succès de certains produits existants d’ECM. Un défi important dans in vitro production d’ECM adapté pour l’implantation, c’est que la production de ECM par culture cellulaire est généralement de rendement relativement faible. Dans cet ouvrage, les protocoles sont décrits pour la production d’ECM de cellules cultivées au sein de fibres creuses sacrificiel membrane échafaudages. Membranes fibres creuses sont cultivés avec des lignées de cellules de fibroblaste dans un milieu cellulaire conventionnel et dissous après culture de cellules pour produire des fils continus d’ECM. Les fibres de ECM résultantes produites par cette méthode peuvent être decellularise et lyophilisés, rendant appropriés pour le stockage et l’implantation.

Production réussie de la matrice extracellulaire des échafaudages sacrificiels est subordonnée à la fabrication d’échafaudages appropriés, culture cellulaire et les procédures de solvant de rinçage. Fabrication des membranes fibres creuses est réalisée en utilisant un système d’extrusion par voie humide sec-jet assemblé à partir des composants disponibles dans le commerce (Figure 1) qui utilise l’extrusion de la solution de polymère par le...

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Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Le but du présent protocole est la production de fibres de matrice extracellulaire ensemble ciblé pour la réparation de la plaie qui conviennent à l’évaluation préclinique dans le cadre d’un implant d’échafaudage régénératrice. Ces fibres sont produites par la culture de fibroblastes sur membranes fibres creuses et extraite par la dissolution des membranes.

Production des fibres de la matrice extracellulaire par Culture de cellules de Membrane fibre creuse sacrificiel

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Ce protocole permet la production de filaments de matrice extracellulaire en vrac à partir de lignées cellulaires de culture, permettant la recherche sur les interactions de matrice cellulaire, ainsi que la recherche sur le potentiel de ce biomatériau pour la réparation des plaies. Ces fibres synthétiques peuvent éviter la réponse du corps étranger dirigée contre les matériaux synthétiques, tout en puisant dans le riche répertoire des techniques de fabrication textile pour créer une large gamme d’implantables tissés. Cassandra Reed, une étudiante diplômée de mon labo, démontrera la procédure.Avant d’ensemencer les cellules, autoclave les membranes creuses de fibre à 121 degrés Celsius pendant 30 minutes, suivie d’un traitement avec 50 millilitres de fibronectine plasmatique bovine dans PBS à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant une heure. À la fin de l’incubation, utiliser des micro ciseaux stériles pour couper les fibres à six centimètres ou moins, et utiliser une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 21 pour ensemencer une fois 10 à la cinquième cellule fibroblaste directement dans le lumina des membranes de fibres creuses. Placez six fibres ensemencées dans une boîte de Pétri de six pouces de diamètre et incubez brièvement les fibres ensemencées à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 %.Après cinq minutes, transférer les fibres de l’incubateur dans un nouveau plat petri de six centimètres contenant milieu de culture fibroblaste complété par de l’acide L-ascorbique, l’acide l-ascorbique 2 phosphate, et la transformation du facteur de croissance bêta 1 pour un jusqu’à trois semaines dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, utiliser des forceps o transférer les fibres de culture dans des flacons de scintillation individuels, et incliner chaque flacon pour permettre l’ajout de jusqu’à cinq millilitres de N-Méthyl-2-pyrrolidone sur le côté des flacons. Ensuite, utilisez une pipette sérologique pour aspirer lentement le N-Méthyl-2-pyrrolidone de chaque fibre, et transférer les fibres dans de nouveaux flacons de scintillation pour une deuxième immersion en N-Méthyl-2-pyrrolidone fraîche.Après la troisième immersion, rincez les fils de matrice extracellulaires qui en résultent trois fois dans de l’eau déionisée de la même manière, et placez un moule rectangulaire de trois pouces de long et d’un pouce de large de 1/23e pouce d’épaisseur avec un moule rectangulaire central de huit par quatre millimètres sur une lame de microscope en verre standard de trois par un pouce. Après l’autoclaving, mentez chaque fibre extracellulaire de matrice côte à côte dans le moule en silicone de huit par quatre millimètres jusqu’à ce qu’il n’y ait aucun espace ouvert visible. Placez le moule dans un tube conique de 50 millilitres et congelez les fibres à 80 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce qu’elles soient complètement gelées.Pour la décellularisation, incuber le moule dans du sulfate de dodecyl à 1 % de sodium pendant 24 heures à température ambiante sur un rocker avec une légère agitation. Le lendemain, rincez la matrice extracellulaire extraite avec trois lavages en trois millilitres de PBS par lavage, et remplissez le moule d’ADN/ARN fraîchement préparés pour une incubation de six heures à quatre degrés Celsius. À la fin de la digestion, aspirer la solution de digestion et rincer le moule trois fois dans PBS stérile comme démontré.Après le troisième lavage, incuber les échafaudages à 10% pénicilline-streptomycine en PBS à quatre degrés Celsius pendant la nuit avant de geler dans un tube conique de 50 millilitres à 80 degrés Celsius négatif pendant environ une heure. Lorsque le maillage est complètement gelé, lyophiliser le maillage extracellulaire décellulaire pendant la nuit, ou jusqu’à ce qu’il soit complètement sec, et transférer les échafaudages lyophilisés dans un contenant stérile dans un capot de biosécurité et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Ici, une section transversale d’une membrane de fibre creuse polysulfone fabriquée à l’aide de ce protocole est montrée, présentant des couches externes et intérieures de pores en forme de doigt caractéristiques d’une membrane asymétrique.Après l’ensemencement et la culture des cellules fibroblastes, le rinçage n-méthyl-2-pyrrolidone tel que démontré, des fils translucides de matrice extracellulaire sont produits. Les cellules productrices de matrice extracellulaire restent viables à l’intérieur des membranes creuses de fibre tout au long de la période de culture de trois semaines entière. La matrice extraite a un aspect translucide lorsqu’elle est hydratée, présentant une couleur blanc éteint et un aspect fibreux avec un alignement longitudinal brut sur l’assemblage du maillage et la lyophilisation.L’étape la plus critique est le processus de dissolution des membranes de fibres creuses cultivés dans le solvant N-Méthyl-2-pyrrolidone afin d’extraire la matrice extracellulaire. Le matériau produit par cette méthode peut être utilisé pour fabriquer des implants d’ingénierie tissulaire pour étudier la réparation des tissus dans des études précliniques. Le N-Méthyl-2-pyrrolidone utilisé dans ce protocole est un irritant pour la peau et les yeux, et il est donc recommandé que vous manipuliez le produit chimique à l’aide de gants de nitrile, lunettes, un manteau de laboratoire, et le manipuler dans un capot de fumée.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

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Recherche

Bio-ingénierie

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