Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
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Forschung berichtet in dieser Publikation wurde unterstützt vom National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett und Hauterkrankungen von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R15AR064481, der National Science Foundation (CMMI-1404716), sowie die Arkansas Biosciences Institute.

1. Produktion von extrazellulärer Matrix mit Opfergaben Hohlfaser-Membranen
Achtung: N-Methyl-2-pyrrolidon ist eine irritierende Lösungsmittel und reproduktive Schlüpfzeit. Exposition gegenüber NMP verursachen Reizungen der Haut, Augen, Nase und Rachen. Lösungsmittelbeständige persönlicher Schutzausrüstung sollte verwendet werden, beim Umgang mit NMP. Verwendung von NMP sollte innerhalb einer Dampfhaube durchgeführt werden.
<ol><li>Vorbereitung der Polymerlösung Polysulfon ...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

Die beschriebenen Prozesse ermöglichen die Produktion von Bulk ECM Biomaterialien in Vitro mit Hohlfaser-Membranen von einem trocken-Jet nass Spinnerei System für kostengünstige Massenproduktion der Membranen sowie Standardzelle Kultur Ausrüstung geworfen. Während die Membranen, die in diesem Protokoll hergestellt für den Einsatz in der Zellkultur bestimmt sind, kann das beschriebene System auch für die Herstellung von Membranen zur Trennung Zwecke mit Pore Verteilung und hohle Faser Größendimensionen a...

Implantierbare chirurgische Gerüste sind fester Bestandteil der Wunde Reparatur, mit mehr als 1 Million synthetische Polymer-Netze implantiert weltweit jedes Jahr für die Bauchdecke Reparatur allein1. Jedoch nach Implantation der synthetischen Materialien Polymere traditionell bei der Herstellung von diese Gerüste verwendet tendenziell eine Fremdkörper-Reaktion, was zu Entzündungen schädlich auf die Funktion des Implantats und Vernarbung des Gewebes2 zu provozieren . Weiter, als die vorherrschende Kunststoffnetz Materialien (z.B. Polypropylen) nicht merklich vom Körper umgebaut werden, sie gelten im Allgemeinen für Gewebe wo Narbenbildung toleriert werden kann, begrenzen ihren klinischen Nutzen in der Behandlung von Gewebe mit Funktion höherer Ordnung wie Muskel. Zwar gibt es viele chirurgische Netz-Produkte, die mit klinischen Erfolg angewendet wurden, erinnert an den letzten Hersteller von synthetischen chirurgische Netze und Komplikationen von Interspezies Gewebe Implantate die Bedeutung der Maximierung der Implantat hervorheben Biokompatibilität, woraufhin die FDA Vorschriften über chirurgische anziehen mesh Hersteller3,4. Implantation von Gerüsten, abgeleitet von Patienten Gewebe reduziert diese Immunantwort, sondern kann dazu führen, dass erhebliche Entnahmestelle Morbidität5. Extrazelluläre Matrix (ECM) Gerüste produziert in Vitro sind eine mögliche Alternative, da decellularized ECM Gerüste ausgezeichnete Biokompatibilität aufweisen insbesondere bei autologen ECM6Implantate.
Wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Patienten Gewebe für eine autologe Implantation zu ernten und das Risiko einer Funktion an der Entnahmestelle zu behindern, die Fähigkeit, ECM produzieren Gerüste in-vitro- von der Kultur des humanen Zelllinien oder, wenn möglich, ein Patient eigene Zellen ist eine attraktive Alternative. Die primären Herausforderungen bei der Herstellung von erheblichen Mengen von ECM in Vitro ist die Bindung dieser Moleküle schwierig zu erfassen. In früheren Arbeiten, haben wir bewiesen, dass ECM hergestellt werden kann, durch Kultivierung ECM-sezernierenden Fibroblasten in Opfer polymerer Schäume, die aufgelöst werden, nach der Periode der Kultur zu Ertrag ECM die decellularized kann für Implantation7, 8,9,10. Wie ECM in produziert Schäume sind in der Regel übernehmen die interne Architektur der Schäume, Hohlfaser-Membranen (HFMs) wurden als Opfer Gerüst für die Herstellung von Gewinden von ECM erkundet. Hier beschriebenen Methoden beauftragt für Labor zu skalieren, Herstellung von Zellmembranen Kultur Qualität Hohlfaser und die Gewinnung von Schüttgut extrazelluläre Matrix Fasern aus gleich nach einer Periode des Fibroblasten-Kultur. Dieser statische Kultur Ansatz ist von Labors mit standard Säugerzelle Kultur Ausrüstung leicht annehmbar. ECM, produziert durch diese Vorgehensweise konnte gegenüber einer Vielzahl von klinischen Anwendungen angewendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Veränderter Gerüste aus extrazellulären Matrix (ECM) abgeleitet haben angetriebenes erhebliches Interesse in der Medizin für ihr Potenzial in der Beschleunigung Schließung und heilende Wunde. Gewinnung von extrazellulären Matrix aus Fibrogenic Zelle Kulturen in Vitro hat Potenzial zur Erzeugung von ECM aus Menschen- und potenziell patientenspezifische Zelllinien, minimieren das Vorhandensein von xenogene Epitope, die klinische behindert hat Erfolg von einigen bestehenden ECM-Produkten. Eine große Herausforderung in der in-vitro- Produktion von ECM für eine Implantation geeignet ist, dass ECM-Produktion von Zellkultur in der Regel relativ geringe Ausbeute. In dieser Arbeit werden für die Herstellung von ECM von Zellen innerhalb Opfer Hohlfaser-Membran Gerüste kultivierten Protokolle beschrieben. Hohlfaser-Membranen sind mit Fibroblasten-Zell-Linien in einem konventionellen Zelle Medium kultiviert und aufgelöst nach Zellkultur um kontinuierliche Fäden von ECM zu erzielen. Die daraus resultierende ECM-Fasern produziert durch diese Methode können decellularized und lyophilisiert, wodurch es zur Speicherung und Implantation.

Erfolgreiche Produktion der extrazellulären Matrix aus Opfer Gerüste ist abhängig von entsprechenden Gerüst Herstellung, Zellkultur und Lösemittel spülen Verfahren. Herstellung der Hohlfaser Membranen erfolgt über eine trocken-Jet nass Spinnerei System aus handelsüblichen Bauteilen (Abbildung 1) montiert die Extrusion der Polymerlösung durch den Ringraum eines handelsüblichen Stahl verwendet Spinndüse (Innendurchmesser = 0,8 mm, Außendurchmesser =...

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Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Das Ziel dieses Protokolls ist Produktion der gesamten extrazelluläre Matrix Fasern für Wunde Reparatur gezielt die für präklinische Evaluierung im Rahmen eines Implantates, regenerative Gerüst geeignet sind. Diese Fasern hergestellt durch die Kultur der Fibroblasten auf Hohlfaser-Membranen und durch Auflösung der Membranen extrahiert.

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von Filamenten von massenhaften extrazellulären Matrix aus kultivierten Zelllinien, so dass die Erforschung von Zellmatrix-Wechselwirkungen, sowie die Erforschung des Potenzials dieses Biomaterials für die Wundreparatur. Diese synthetischen Fasern können die Fremdkörperreaktion auf synthetische Materialien vermeiden, während sie immer noch aus dem reichen Repertoire an textilen Herstellungstechniken schöpft, um eine breite Palette von gewebten Implantables zu schaffen. Demonstriert das Verfahren wird Cassandra Reed, eine Studentin aus meinem Labor.Vor der Aussaat der Zellen, Autoklav die Hohlfasermembranen bei 121 Grad Celsius für 30 Minuten, gefolgt von der Behandlung mit 50 Milliliter Rinderplasma Fibronectin in PBS bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine sterile Mikroschere, um die Fasern auf sechs Zentimeter oder weniger zu schneiden, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 21-Spur-Nadel ausgestattet ist, um ein mal 10 bis fünf literazupfende Fibroblastenzellen direkt in die Leuchtdichte der Hohlfasermembranen zu säen. Legen Sie sechs gesäte Fasern in eine Petrischale mit sechs Zoll Durchmesser und bebrüten die gesäten Fasern kurzzeitig bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.Nach fünf Minuten die Fasern aus dem Inkubator in eine neue sechs Zentimeter lange Petrischale mit Fibroblastenkulturmedium, ergänzt durch L-Ascorbinsäure, L-Ascorbinsäure 2 Phosphat, und Umwandlung des Wachstumsfaktors Beta 1 für bis zu drei Wochen im Zellkultur-Inkubator übertragen. Am Ende der Inkubation, verwenden Zangen o übertragen die kultivierten Fasern in einzelne Szintillationsfläschchen, und kippen jede Durchstechflasche, um die Zugabe von bis zu fünf Milliliter N-Methyl-2-Pyrrolidon auf der Seite der Fläschchen zu ermöglichen. Dann verwenden Sie eine serologische Pipette, um langsam das N-Methyl-2-Pyrrolidon aus jeder Faser zu saugen, und übertragen Sie die Fasern in neue Szintillationsfläschchen für ein zweites Eintauchen in frisches N-Methyl-2-Pyrrolidon.Nach dem dritten Eintauchen spülen Sie die resultierenden extrazellulären Matrixfäden dreimal in deionisiertem Wasser auf ähnliche Weise ab und legen Sie ein drei Zoll langes, ein Zoll breites, 1/23 Zoll dickes Stück Silikonkautschuk mit einer zentralen rechteckigen Form von acht mal vier Millimetern auf ein Standard-Glasmikroskop-Dia mit drei mal einem Zoll. Legen Sie nach dem Autoklavieren jede extrazelluläre Matrixfaser nebeneinander in die acht mal vier Millimeter große Silikonform, bis kein sichtbarer Freiraum vorhanden ist. Legen Sie die Form in ein 50 Milliliter konisches Rohr, und frieren Sie die Fasern bei negativen 80 Grad Celsius, bis vollständig gefroren.Zur Dezellularisierung die Form in 1% Natriumdodecylsulfat für 24 Stunden bei Raumtemperatur auf einer Wippe mit sanfter Rührung inkubieren. Am nächsten Tag spülen Sie die extrahierte extrazelluläre Matrix mit drei Wäschen in drei Millilitern PBS pro Wäsche ab und füllen Sie die Form mit frisch zubereiteten DNAs/RNAs Verdauungspuffer für eine sechsstündige Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Verdauung, aspirieren Sie die Verdauungslösung und spülen Sie die Form dreimal in sterilen PBS wie gezeigt.Nach der dritten Wäsche die Gerüste in 10% Penicillin-Streptomycin in PBS bei vier Grad Celsius über Nacht bebrüten, bevor sie in einem 50 Milliliter konischen Rohr bei negativen 80 Grad Celsius etwa eine Stunde frieren. Wenn das Netz vollständig eingefroren ist, lyophilisieren Sie das dezelluläre extrazelluläre Netz über Nacht oder bis zum völligen Trocknen, und übertragen Sie die lyophilisierten Gerüste in einen sterilen Behälter innerhalb einer Bio-Sicherheitshaube und lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zum Gebrauch. Hierwird wird ein querer Querschnitt einer mit diesem Protokoll hergestellten Polysulfon-Hohlfasermembran gezeigt, die äußere und innere Schichten fingerähnlicher Poren aufweist, die für eine asymmetrische Membran charakteristisch sind.Nach der Fibroblastenzellaussaat und -kultur werden, wie gezeigt, N-Methyl-2-Pyrrolidon-Spülung, transluzente Fäden extrazellulärer Matrix hergestellt. Die extrazellulären Matrix produzierenden Zellen bleiben innerhalb der Hohlfasermembranen während des gesamten dreiwöchigen Kulturzeitraums lebensfähig. Die extrahierte Matrix hat ein transluzentes Aussehen, wenn hydratisiert, zeigt eine off-weiße Farbe und faseriges Aussehen mit einer groben Längsausrichtung auf Netzmontage und Lyophilisierung.Der kritischste Schritt ist der Auflöseprozess der kultivierten Hohlfasermembranen im N-Methyl-2-Pyrrolidon-Lösungsmittel, um die extrazelluläre Matrix zu extrahieren. Das mit dieser Methode hergestellte Material kann zur Herstellung von gewebetechnischen Implantaten zur Untersuchung der Gewebereparatur in präklinischen Studien verwendet werden. Das N-Methyl-2-Pyrrolidon, das in diesem Protokoll verwendet wird, ist ein Haut- und Augenreizungsmittel, und daher wird empfohlen, dass Sie die Chemikalie mit Nitrilhandschuhen, Einer Brille, einem Labormantel und einem Rauchhaube behandeln.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Forschung

Biotechnik

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hohlfaser-Bioreaktoren für<em&gt; In Vivo</em&gt; -ähnlichen Mammalian Gewebekultur

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

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Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

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The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...