Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי של דלקת מפרקים, השלד והשרירים ומחלות עור של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R15AR064481, הקרן הלאומית למדע (CMMI-1404716), כמו גם מכון החיים ארקנסו.

1. ייצור של מטריצה חוץ-תאית באמצעות ממברנות ההקרבה הולופייבר
התראה: N-מתיל-2-pyrrolidone הוא הממס מעצבן ו toxicant הרבייה. חשיפה NMP עלול לגרום גירוי העור, העיניים, האף והגרון. ציוד מגן אישי עמידים הממס אמור לשמש בעת טיפול NMP. השימוש NMP צריכה להתבצע בתוך ברדס fume.
<ol><li>הכנה של פתרון פולי?...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

התהליכים המתוארים מאפשרים הייצור של צובר ECM biomaterials במבחנה באמצעות ממברנות הולופייבר להטיל על-ידי מערכת ספינינג רטוב יבש-סילון ומאפשר לייצור זול בצובר של ממברנות, כמו גם ציוד תרבות תא סטנדרטי. בעוד הקרומים מפוברק פרוטוקול זה מיועדות לשימוש בתרבית תאים, המערכת המתוארת ניתן להתאים גם ל?...

פיגומים כירורגי מושתלת הם אביזר של תיקון הפצע, עם למעלה ממיליון רשתות שינוי של פולימר סינטטי מושתל ברחבי העולם בכל שנה על דופן הבטן תיקון לבד1. עם זאת, בעקבות ההשתלה פולימרים חומרים סינתטיים באופן מסורתי בשימוש פבריקציה נוספת של פיגומים אלה נוטים לעורר תגובה גוף זר, והתוצאה היא דלקת ברישול לפונקציה של השתל, הצטלקות של רקמת2 . עוד יותר, כמו החומרים השולט סינתטי רשת (קרי, פוליפרופילן) הם לא ניכרת שופצה על ידי הגוף, הם חלים באופן כללי על רקמות בו צלקות יכול להיות נסבל, הגבלת התועלת הקלינית שלהם כלפי הטיפול רקמות עם מיומנויות תפקוד כגון שרירים. אמנם יש הרבה מוצרים כירורגי אשר הוחלו בהצלחה קליני, יצרן האחרונים נזכר של סינתטיים כירורגי רשתות וסיבוכים של רקמות בין זנים שתלים להדגיש את החשיבות של הגדלת שתל הביו, הצגת ה-FDA לחדק תקנות על ניתוח mesh יצרני3,4. השרשה של פיגומים שמקורם ברקמות של המטופלים מפחיתה את התגובה החיסונית, אך יכול לגרום תחלואה משמעותית תורם-אתר5. מטריצה חוץ-תאית (ECM) פיגומים המיוצר במבחנה הם חלופה אפשרית, כמוצג פיגומים ECM decellularized הביו מעולה, במיוחד במקרה של ECM עצמיים שתלים6.
בגלל המוגבל של הרקמה החולה כדי לקצור להשתלה עצמיים הסיכון של הפגיעה פונקציה באתר התורם, היכולת לייצר ECM פיגומים במבחנה מתוך התרבות של שורות תאים אנושיים, או, במידת האפשר, של החולה התאים עצמו הוא חלופה אטרקטיבית. האתגרים העיקריים בייצור של כמויות ניכרות של ECM במבחנה הוא פחמיות של מולקולות אלה קשה ללכידת. בעבודה הקודמת, הראו כי ה-ECM יכול להיות מיוצר על ידי culturing מפריש ECM fibroblasts ב קצף פולימריים ההקרבה זה הם התפרקה לאחר תקופת תרבות כדי ECM התשואה אשר יכול להיות decellularized עבור ההשתלה7, 89,,10. ECM מיוצר קצף נוטים לאמץ את הארכיטקטורה הפנימית של קצף, הולופייבר ממברנות (HFMs) היו חקר בדומה לפיגום ההקרבה לייצור חוטי ECM. כפי שיתואר בהמשך אתה שיטות המוטל על מעבדה קנה המידה של הייצור של תאים תרבות איכות הולופייבר ממברנות ומתקני הפקת בצובר מטריצה חוץ-תאית סיבים מאותו לאחר תקופה של פיברובלסט תרבות. גישה זו תרבות סטטית היא ברצון לאימוץ על ידי מעבדות המכיל ציוד תרבות רגיל בתרבית של תאים. יכול להיות מיושם ECM המיוצר על ידי גישה זו כלפי מגוון רחב של יישומים קליניים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

פיגומים מהונדסים נגזר מטריצה חוץ-תאית (ECM) יש עניין משמעותי מונע ברפואה על הפוטנציאל שלהם ב לזירוז פצע הסגר וריפוי. מיצוי של מטריצה חוץ-תאית fibrogenic תא תרבויות במבחנה יש פוטנציאל לדור של ה-ECM של שורות תאים אנושיים - ואת פוטנציאל ספציפי לחולה, מזעור הנוכחות של epitopes xenogeneic אשר יש הפריע במישור הקליני הצלחה של מוצרים קיימים כמה ECM. אתגר משמעותי בייצור במבחנה של ECM מתאימים להשתלה הוא ECM הייצור על ידי תרבית תאים הוא בדרך כלל של תשואה נמוכה יחסית. בעבודה זאת, מתוארים פרוטוקולי לייצור של ECM על ידי תאים בתרבית בתוך הולופייבר ההקרבה ממברנה פיגומים. הולופייבר ממברנות תרבותי עם שורות תאים פיברובלסט במדיום תא קונבנציונאלי, התפרקה לאחר תרבית תאים להניב הליכי משנה רציף של ECM. הסיבים ECM וכתוצאה מכך המיוצר על ידי שיטה זו יכולה להיות decellularized, lyophilized, טיוח זה מתאים לאחסון, השרשה.

הפקה מוצלחת של מטריצה חוץ-תאית של פיגומים ההקרבה נמדדת לפי לגרדום המתאים פבריקציה נוספת, תרבית תאים ושגרות שטיפה הממס. ייצור כמות הולופייבר מתבצעת באמצעות הזרקת יבש רטוב-ספינינג מערכת התכנסו from רכיבים זמינים מסחרית (איור 1) אשר משתמשת ההבלטה של פולימר פתר...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

פרוטוקול זה מאפשר ייצור של תריסים של מטריצה חוץ תאית בתפזורת מקווי תאים מתורבתים, המאפשר מחקר לתוך אינטראקציות מטריצת התא, כמו גם מחקר לתוך הפוטנציאל של ביו-חומר זה לתיקון פצע. סיבים סינתטיים אלה יכולים למנוע את תגובת הגוף הזר מכוונת נגד חומרים סינתטיים, תוך עדיין ציור מן הרפרטואר העשיר של טכניקות ייצור טקסטיל כדי ליצור מגוון רחב של מושתלים ארוגים. הדגימה של ההליך תהיה קסנדרה ריד, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.לפני זריעת התאים, autoclave את קרום סיבים חלול ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ואחריו טיפול עם 50 מיליליטר של פלזמה בקר fibronectin ב PBS ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, השתמש במספריים מיקרו סטריליים כדי לחתוך את הסיבים לשישה סנטימטרים או פחות, ולהשתמש מזרק מיליליטר אחד מצויד מחט מד 21 לזרוע פעם אחת 10 לתאי fibroblast החמישי ישירות לתוך הלומינה של קרום סיבים חלול. מניחים שישה סיבים זרעים לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 אינץ', בקצרה דגירה סיבים זרעים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני.לאחר חמש דקות, להעביר את הסיבים מהאינקובטור לתוך צלחת פטרי שישה סנטימטר חדש המכיל בינוני תרבות fibroblast בתוספת חומצה L-אסקורבית, חומצה L-אסקורבית 2 פוספט, והפיכת בטא גורם גדילה 1 עד שלושה שבועות בממבה תרבות התא. בסוף הדגירה, השתמש במטס o להעביר את הסיבים התרבותיים לתוך בקבוקונים בודדים scintillation, ולהטות כל בקבוקון כדי לאפשר תוספת של עד חמישה מיליליטר של N-מתיל-2-pyrrolidone בצד של הבקבוקונים. לאחר מכן השתמש פיפטה סרולוגית לאט לשאוף את N-מתיל-2-pyrrolidone מכל סיב, ולהעביר את הסיבים לתוך בקבוקונים scintillation חדש עבור טבילה שנייה טרי N-מתיל-2-pyrrolidone.לאחר הטבילה השלישית, שטפו את חוטי המטריצה החוץ-תאיים שנוצרים שלוש פעמים במים שעברו דה-מיון באופן דומה, והמקמו פיסת גומי מלבנית בגודל 3 אינץ', ברוחב 1/23 אינץ' עם תבנית מלבנית מרכזית של שמונה על ארבעה מילימטרים על גבי שקופית מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטית של 3 על 1 אינץ'. לאחר הפעלה אוטומטית, הניחו כל סיבי מטריצה חוץ-תאיים זה לצד זה בתבנית הסיליקון של שמונה על ארבעה מילימטרים עד שלא יהיה שטח פתוח נראה לעין. מניחים את התבנית לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולהקפיא את הסיבים ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד קפוא לחלוטין.לדקלולריזציה, הדגירה את התבנית ב 1% נתרן dodecyl סולפט במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר על נדנדה עם תסיסה עדינה. למחרת, לשטוף את מטריצה חוץ תאית שחולצו עם שלוש שטיפות בשלושה מיליליטר של PBS לכל לשטוף, ולמלא את התבנית עם חיץ עיכול DNAs / RNAs מוכן טרי עבור דגירה של שש שעות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף העיכול, שאפו את פתרון העיכול ושטוף את התבנית שלוש פעמים ב- PBS סטרילי כפי שהוכח.לאחר הכביסה השלישית, הדגירה את הפיגומים ב 10%פניצילין-סטרפטומיצין ב PBS בארבע מעלות צלזיוס לילה לפני הקפאה בצינור חרוט 50 מיליליטר ב שלילי 80 מעלות צלזיוס במשך כשעה. כאשר רשת המים קפאה לחלוטין, ליופילים את רשת החוץ-תאית המבודדת בן לילה, או עד לייבוש מלא, ומעבירים את הפיגומים הליופיליים למיכל סטרילי בתוך מכסה המנוע של בטיחות ביולוגית ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. כאן מוצג חתך רוחבי של קרום סיבים חלול פוליסולפון מפוברק באמצעות פרוטוקול זה, המציג שכבות החיצוניות והפנימיות של נקבוביות דמויי אצבע האופייניות לממברנה אסימטרית.לאחר זריעת תאים fibroblast ותרבות, N-מתיל-2-pyrrolidone שטיפה כמו הוכח, חוטים שקופים של מטריצה חוץ תאית מיוצרים. המטריצה החוץ-תאית המייצרת תאים נשארת בת קיימא בתוך קרום הסיבים החלול לאורך כל תקופת התרבות של שלושת השבועות. מטריצה שחולצו יש מראה שקוף כאשר hydrated, המציג צבע לבן מחוץ ומראה סיבי עם יישור אורך ברוטו על הרכבה רשת lyophilization.הצעד הקריטי ביותר הוא תהליך המסת קרום הסיבים החלול המתורב בממס N-מתיל-2-pyrrolidone על מנת לחלץ את מטריצה חוץ תאית. החומר המיוצר בשיטה זו יכול לשמש לייצור שתלים מהונדסים רקמות לחקירת תיקון רקמות במחקרים פרה-קליניים. N-מתיל-2-pyrrolidone המשמש בפרוטוקול זה הוא מעצבן עור ועין, ולכן מומלץ לטפל בכימיקל באמצעות כפפות ניטריל, משקפי מגן, חלוק מעבדה, ולטפל בו בתוך מכסה המנוע אדים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

ריאקטורים סיבים חלולים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; תרבות הרקמות היונקת-כמו

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...