Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto nazionale dell'artrite e patologie del sistema muscoloscheletrico e malattie della pelle dei National Institutes of Health, sotto numero di premio R15AR064481, la National Science Foundation (CMMI-1404716), nonché la Arkansas Biosciences Institute.

1. produzione di matrice extracellulare utilizzando membrane a fibra cava sacrificale
Attenzione: N-metil-2-pirrolidone è un solvente irritante e tossico riproduttiva. L'esposizione a NMP può causare irritazione alla pelle, occhi, naso e gola. Resistente ai solventi dispositivi di protezione individuale devono essere utilizzato quando si gestisce NMP. Uso di NMP deve essere eseguita all'interno di una cappa aspirante.
<ol><li>Preparazione della soluzione di polimero polisulfone per...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. 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I processi descritti consentono la produzione di massa ECM biomateriali in vitro utilizzando membrane a fibra cava espressi da un sistema a secco-jet wet spinning permettendo per produzione all'ingrosso poco costoso di membrane, nonché attrezzature di cultura cellulare standard. Mentre le membrane fabbricate in questo protocollo sono destinate per l'uso nella coltura delle cellule, il sistema descritto può anche essere adattato per la produzione di membrane per scopi di separazione, con poro distribuzione e ca...

Ponteggi chirurgici impiantabili sono un appuntamento fisso della riparazione della ferita, con oltre 1 milione polimero sintetico mesh impiantata in tutto il mondo ogni anno per la riparazione della parete addominale da solo1. Tuttavia, a seguito dell'impianto i polimeri sintetici materiali tradizionalmente utilizzati nella fabbricazione di queste impalcature tendono a provocare una reazione da corpo estraneo, con conseguente infiammazione deleterio per la funzione dell'impianto e cicatrizzazione del tessuto2 . Inoltre, come i materiali predominanti mesh sintetico (cioè, polipropilene) non sono sensibilmente ristrutturati dal corpo, essi sono generalmente applicabile ai tessuti dove può essere tollerata la cicatrizzazione, limitando la loro utilità clinica verso il trattamento di tessuti con funzione di ordine superiore quale il muscolo. Mentre ci sono molti prodotti di maglia chirurgica che sono stati applicati con successo clinico, produttore risale ricorda sintetica chirurgico maglie e complicazioni dagli innesti di tessuto interspecie evidenziano l'importanza di ottimizzazione dell'impianto biocompatibilità, spingendo la FDA per stringere i regolamenti sulla chirurgica maglia produttore3,4. L'impianto di scaffold derivate dai tessuti dei pazienti riduce la risposta immunitaria, ma può provocare significative del donatore-luogo morbosità5. Matrice extracellulare (ECM) impalcature prodotte in vitro sono una possibile alternativa, come decellularizzati ECM ponteggi esibiscono eccellente biocompatibilità, particolarmente nel caso di trapianto autologo ECM impianti6.
A causa della limitata disponibilità di tessuto del paziente per la raccolta per l'impianto autologo ed il rischio di ostacolare la funzione al luogo erogatore, la capacità di produrre ECM ponteggi in vitro dalla coltura di linee cellulari umane o, se possibile, di un paziente possedere le cellule è un'alternativa attraente. Le sfide principali nella produzione di notevoli quantità di ECM in vitro è il sequestro di queste molecole di difficile acquisizione. Nel precedente lavoro, abbiamo dimostrato che ECM può essere prodotta coltivando fibroblasti ECM-secernente in schiume polimeriche sacrificale che sono dissolti dopo il periodo di coltura di ECM di rendimento che può essere decellularized per l'impianto7, 8,9,10. Come ECM prodotta schiume tendono ad adottare l'architettura interna delle schiume, membrane a fibra cava (HFMs) sono state esplorate come impalcatura sacrificale per la produzione di fili di ECM. Descritto nel presente documento sono metodi compiti per laboratorio scala produzione di membrane a fibra cava qualità cultura delle cellule e l'estrazione delle fibre della matrice extracellulare di massa dallo stesso dopo un periodo di coltura del fibroblasto. Questo approccio di coltura statica è facilmente adottabile da laboratori contenenti attrezzature per cultura standard su cellule di mammifero. ECM prodotto da questo approccio potrebbe essere applicato verso una varietà di applicazioni cliniche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Scaffold ingegnerizzati derivato dalla matrice extracellulare (ECM) hanno guidato significativo interesse in medicina per il loro potenziale nel velocizzare ferita la chiusura e la guarigione. Estrazione della matrice extracellulare da fibrogenica cell culture in vitro ha il potenziale per la generazione di ECM da linee cellulari umane - e potenzialmente paziente-specifici, riducendo al minimo la presenza di epitopi xenogeniche che ha ostacolato la clinica successo di alcuni prodotti ECM esistenti. Una sfida significativa nella produzione in vitro di ECM adatto per l'impianto è che la produzione di ECM mediante coltura cellulare è in genere di rendimento relativamente basso. In questo lavoro vengono descritti i protocolli per la produzione di ECM dalle cellule coltivate all'interno di impalcature di membrana a fibra cava sacrificale. Membrane a fibra cava sono coltivate con linee cellulari di fibroblasti in un mezzo di cella convenzionale e dissolto dopo coltura cellulare per produrre fili continui di ECM. Le fibre risultanti ECM prodotte da questo metodo possono essere decellularized e liofilizzate, rendendolo adatto per lo stoccaggio e l'impianto.

Successo della produzione di matrice extracellulare di impalcature sacrificale è subordinato a impalcatura appropriata fabbricazione, coltura cellulare e procedure di solvente risciacquo. Fabbricazione delle membrane a fibra cava viene eseguita utilizzando un sistema di bagnato-filatura a secco-jet assemblato con componenti disponibili in commercio (Figura 1) che utilizza estrusione di soluzione polimerica attraverso l'intercapedine di un acciaio disponibile...

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Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

L'obiettivo del presente protocollo è la produzione delle fibre di intera tabella extracellulare mirati per la riparazione della ferita che sono adatti per la valutazione preclinica come parte di un impianto di impalcatura rigenerativa. Queste fibre sono prodotte dalla cultura dei fibroblasti su membrane a fibra cava ed estratte dalla dissoluzione delle membrane.

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Questo protocollo consente la produzione di filamenti di matrice extracellulare sfusa da linee cellulari coltivate, consentendo la ricerca sulle interazioni della matrice cellulare, nonché la ricerca sul potenziale di questo biomateriale per la riparazione delle ferite. Queste fibre sintetiche possono evitare la risposta del corpo estraneo diretta contro i materiali sintetici, pur attingendo al ricco repertorio di tecniche di fabbricazione tessile per creare una vasta gamma di impiantabili intrecciati. A dimostrare la procedura sarà Cassandra Reed, una studentessa laureata del mio laboratorio.Prima di seminare le cellule, autoclavare le membrane in fibra cava a 121 gradi Celsius per 30 minuti, seguita da un trattamento con 50 millilitri di fibronectina plasmatica bovina in PBS a 37 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica per un'ora. Alla fine dell'incubazione, utilizzare micro forbici sterili per tagliare le fibre a sei centimetri o meno e utilizzare una siringa millilitro dotata di un ago calibro 21 per seminare una volta 10 alla quinta cellule fibroblatrici direttamente nell'apparecchio delle membrane in fibra cava. Mettere sei fibre sementi in una piastra di Petri di sei pollici di diametro e incubare brevemente le fibre sementi a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.Dopo cinque minuti, trasferire le fibre dall'incubatore in una nuova piastra di Petri di sei centimetri contenente mezzo di coltura di fibroblasti integrato con acido L-ascorbico, acido L-ascorbico 2 fosfato e trasformare il fattore di crescita beta 1 per un massimo di tre settimane nell'incubatore di coltura cellulare. Alla fine dell'incubazione, utilizzare le forceps o trasferire le fibre coltivate in singoli flaconcini a scintillazione e inclinare ogni flaconcino per consentire l'aggiunta di un massimo di cinque millilitri di N-Metil-2-pirrolidone lungo il lato dei flaconcini. Quindi utilizzare una pipetta sierologica per aspirare lentamente l'N-metil-2-pirrolidone da ogni fibra e trasferire le fibre in nuove fiale a scintillazione per una seconda immersione in N-metil-2-pirrolidone fresco.Dopo la terza immersione, sciacquare i fili della matrice extracellulare risultanti tre volte in acqua deionizzata in modo simile e posizionare un pezzo di gomma siliconica lungo tre pollici e largo un pollice di 1/23 di pollice con uno stampo rettangolare centrale di otto per quattro millimetri su uno scivolo standard al microscopio in vetro da tre pollici per uno. Dopo l'autoclave, posare ogni fibra a matrice extracellulare fianco a fianco nello stampo in silicone da otto per quattro millimetri fino a quando non c'è spazio aperto visibile. Posizionare lo stampo in un tubo conico da 50 millilitri e congelare le fibre a -80 gradi Celsius fino a completa congelamento.Per la decellularizzazione, incubare lo stampo in solfato di dodecil di sodio all'1% per 24 ore a temperatura ambiente su un rocker con delicata agitazione. Il giorno successivo, sciacquare la matrice extracellulare estratta con tre lavaggi in tre millilitri di PBS per lavaggio e riempire lo stampo con tampone di digestione DNA / RNA appena preparato per un'incubazione di sei ore a quattro gradi Celsius. Al termine della digestione, aspirare la soluzione di digestione e risciacquare lo stampo tre volte in PBS sterile come dimostrato.Dopo il terzo lavaggio, incubare le impalcature in 10%Penicillina-Streptomicina in PBS a quattro gradi Celsius durante la notte prima di congelare in un tubo conico da 50 millilitri a -80 gradi Celsius per circa un'ora. Quando la rete è completamente congelata, liofilizzare la rete extracellulare decellularizzata durante la notte, o fino a completa asciugatura, e trasferire le impalcature liofilizzate in un contenitore sterile all'interno di una cappa di sicurezza bio e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso. Qui viene mostrata una sezione trasversale di una membrana in fibra cava di polisolfone fabbricata utilizzando questo protocollo, che mostra strati esterni ed interni di pori simili a dita caratteristici di una membrana asimmetrica.Dopo la semina e la coltura delle cellule fibroblatrici, il risciacquo N-metil-2-pirrolidone come dimostrato, vengono prodotti fili traslucidi di matrice extracellulare. Le cellule che producono matrici extracellulari rimangono vitali all'interno delle membrane in fibra cava per l'intero periodo di coltura di tre settimane. La matrice estratta ha un aspetto traslucido quando idratata, esibendo un colore bianco etto e un aspetto fibroso con un allineamento longitudinale lordo sull'assemblaggio della rete e sulla litofilizzazione.Il passo più critico è il processo di dissoluzione delle membrane in fibra cava coltivate nel solvente N-Metil-2-pirrolidone al fine di estrarre la matrice extracellulare. Il materiale prodotto con questo metodo può essere utilizzato per fabbricare impianti di ingegneria tissutale per studiare la riparazione dei tessuti in studi preclitici. L'N-Metil-2-pirrolidone utilizzato in questo protocollo è irritante per la pelle e gli occhi, e quindi si consiglia di maneggiare la sostanza chimica usando guanti in nitrile, occhiali, un camice da laboratorio e gestirla all'interno di un cappuccio dei fumi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Ricerca

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