Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

이 간행물에 보고 된 연구 국립 연구소의 관절염과 Musculoskeletal 및 보너스 번호 R15AR064481, 국립 과학 재단 (CMMI-1404716)에서 국립 보건원의 피부 질환에 의해 지원 되었다 뿐만 아니라 아칸소 생물 과학 연구소입니다.

1. 희생 중공 사막은 사용 하 여 세포 외 매트릭스의 생산
주의: N-메 틸-2-pyrrolidone는 자극 용 매 및 생식 toxicant. NMP에 노출 피부, 눈, 코과 목에 자극을 일으킬 수 있습니다. NMP를 처리할 때 용 매 저항 개인 보호 장비를 사용 해야 합니다. NMP의 사용 연기 후드 내에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>중공 사막은 polysulfone 폴리머 솔루션의 준비
	<ol>
<li>Polysulfone 펠 릿의 70...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

설명 하는 프로세스의 대량 ECM 생체 재료에서 생체 외에서 중공 사막은 표준 셀 문화 장비 뿐만 아니라 세포 막의 저렴 한 대량 생산을 위한 수 있도록 드라이-제트 젖은 회전 시스템에 의해 캐스팅을 사용 하 여 생산 가능 이 프로토콜에서 조작 막 사용 하기 위한 세포 배양에서 하는 동안 설명 하는 시스템 또한 목적을 위해 분리, 기 공 크기 분포 및 빈 섬유 크기 가변 변화 하 여 막의 생산...

이식 외과 건설 기계는 상처 복구, 이식 복 벽 수리 혼자1매년 전세계 1 백만 이상의 합성 폴리머 메시의 정착 물. 그러나, 합성 물질 중합체는 전통적으로 이러한 장비의 제조에 사용 되는 주입에 따라 하는 경향이 이물질 응답, 이식의 기능에 해로운 염증의 결과로 및 조직2의 흉터를 자극합니다 . 또한, 주된 합성 메시 물자 (즉, 폴 리 프로필 렌)는 몸에 의해 분명 리 모델링 하지, 그들은 일반적으로 흉터을 어디 용납 될 수 있다, 조직에 적용 가능한 치료의 방향으로 그들의 임상 유용성을 제한 고차 함수 근육 같은 조직. 많은 외과 메쉬 제품을 임상 성공으로 적용 된 반면, 최근 제조 업체 회상 합성 수술의 극대화 임 플 란 트의 중요성을 강조 하는 메쉬 및 interspecies 조직 이식의 합병증 생체 적합성, 수술에 대 한 규제를 강화 하는 FDA 라는 메쉬 제조 업체3,4. 이식 환자 자신의 조직에서 파생 하는 장비의이 면역 반응을 감소 하지만 중요 한 기증자 사이트 사망률5에서 발생할 수 있습니다. 세포 외 기질 (ECM) 건설 기계 생산 체 외에 는 가능한 대안, decellularized ECM 건설 기계 전시 우수한 생체 적합성로 특히 헌 ECM의 경우 임 플 란 트6.
환자 조직 자가 이식에 대 한 수확의 한정 된 가용성 및 기증자 사이트에서 기능을 방해한의 위험, ECM 생산 능력을 생체 외에서 인간 세포 선의 문화에서 투어 또는, 만약에 가능 하다 면, 환자 자신의 셀 매력적인 대안 이다입니다. ECM에서 생체 외에서 의 상당한 금액의 제조에 있는 주요 과제는 이러한 어려운 캡처 분자의 격리. 이전 작품에서는, 우리는 증명 하고있다 ECM ECM 분 비 이식7, decellularized 수 있는 수익률 ECM 문화 기간 후 해산는 희생 폴리머 폼에서 섬유 아 세포를 배양 하 여 생산 될 수 있다 8,,910. ECM 생산에 폼은 폼의 내부 아키텍처를 채택 하는 경향이, 빈 섬유 막 (HFMs) ECM의 생산을 위한 희생 발판으로 탐구 했다. 여기에 설명 된는 방법 주어 실험실 규모 세포 문화 품질 빈 섬유 막과 같은 섬유 문화의 기간 뒤에에서 대량 기질 섬유의 추출의 제조에 대 한. 이 정적 문화 방식은 쉽게 채택할 수 있는 실험실 표준 포유류 세포 배양 장비를 포함 하 여입니다. ECM이 접근이 방식에 의해 생산은 다양 한 임상 응용으로 적용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

세포 외 기질 (ECM)에서 파생 된 설계 건설 기계 폐쇄 하 고 치유를 상처에 신속 하 게 그들의 잠재력에 대 한 의학에 구동된 상당한 관심을가지고. Fibrogenic 셀 문화에서 에 체 외에서 세포 외 매트릭스의 추출 임상 방해는 xenogeneic epitopes의 존재를 최소화 인간의-그리고 잠재적으로 환자 특정 셀 라인에서 ECM의 생성에 대 한 잠재력을가지고 일부 기존 ECM 제품의 성공입니다. ECM 이식 적합의 생체 외에서 생산에 중요 한 도전이 이다 ECM 생산 세포 배양에 의해 일반적으로 상대적으로 낮은 수익률의. 이 작품에서 셀 희생 빈 섬유 막 건설 기계 내에서 교양된으로 ECM의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 중공 사막은 fibroblast 세포 라인 전통적인 휴대 매체에 경작 그리고 ECM의 지속적인 스레드를 세포 배양 후 해산. 이 메서드에 의해 생성 결과 ECM 섬유 수 decellularized 고 동결 건조 된, 그것을 렌더링 하는 스토리지 및 이식에 적합.

희생 건설 기계에서 세포 외 매트릭스의 성공적인 생산은 적절 한 비 계 제조, 세포 배양, 그리고 용 린스 절차에 관 하 우발적 이다. 빈 섬유 막의 제조는 상용 철강의 환대를 통해 폴리머 솔루션의 돌출을 사용 하 여 상업적으로 사용 가능한 구성 요소 (그림 1)에서 조립 드라이-제트 젖은 회전 시스템을 사용 하 여 수행 spinneret (내부 직경 0.8 m m, 외경...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.

희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

이 프로토콜은 배양 된 세포주에서 대량 세포 외 매트릭스의 필라멘트의 생산을 허용, 세포 매트릭스 상호 작용에 대한 연구를 허용, 뿐만 아니라 상처 수리에 대한이 생체 물질의 잠재력에 대한 연구. 이러한 합성 섬유는 합성 물질에 대한 이물질 반응을 피할 수 있으며 섬유 제조 기술의 풍부한 레퍼토리에서 도출하여 다양한 직조 이식물질을 만들 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 카산드라 리드 (Cassandra Reed)가 될 것입니다.세포를 파종하기 전에 중공 섬유막을 섭씨 121도에서 30분 동안 오토클레이브한 다음 PBS에서 50밀리리터의 소 플라즈마 섬유네틴을 1시간 동안 57도의 이산화탄소로 치료합니다. 인큐베이션의 끝에서, 멸균 마이크로 가위를 사용하여 섬유를 6센티미터 이하로 자르고, 21 게이지 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기를 사용하여 10번에서 5번째 섬유아세포 세포를 속여 중공 섬유막의 루미나로 직접 시드한다. 6개의 시드 섬유를 직경 6인치 페트리 접시에 넣고, 시성 섬유를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 잠시 배양합니다.5분 후, 인큐베이터에서 섬유아세포 배양 배지를 함유한 새로운 6센티미터 페트리 접시로 섬유아세포 배양 배지를 함유한 새로운 6센티미터 페트리 접시로 옮기고, L-아스코르빅산 2 인산염으로 보충하고, 세포 배양 인큐베이터에서 최대 3주 동안 성장인자 베타 1을 변형시킨다. 인큐베이션의 끝에서, 포셉을 사용하여 배양된 섬유를 개별 신자극 유리알로 옮기고 각 유리병을 기울여 바이알의 측면 아래로 최대 5밀리리터를 첨가할 수 있도록 한다. 그런 다음 세로지학적 파이펫을 사용하여 각 섬유에서 N-Methyl-2-pyrrolidone을 천천히 흡인하고 섬유를 새로운 반짝임 바이알로 옮겨 신선한 N-Methyl-2-pyrrolidone에 두 번째 침수를 합니다.세 번째 침수 후, 결과 세포 외 매트릭스 스레드를 유사한 방식으로 탈이온 화 된 물에 세 번 헹구고 중앙 8 x 4 밀리미터 직사각형 금형을 표준 3 x 1 인치 유리 현미경 슬라이드에 3 인치 길이의 1 인치 너비 1/23 인치 두께의 실리콘 고무 조각을 놓습니다. 오토클레이브 후, 각 세포외 매트릭스 섬유를 8x 4 밀리미터 실리콘 몰드에 나란히 놓아 보이는 열린 공간이 없을 때까지 놓습니다. 금형을 50밀리리터 원내 튜브에 넣고 완전히 얼어 붙을 때까지 소음 80도에서 섬유를 동결합니다.탈세포화를 위해, 부드러운 동요와 로커에 실온에서 24 시간 동안 1 %의 나트륨 도데딜 황산염에 금형을 배양. 다음 날, 세척당 PBS 3밀리리터에 3개의 세척으로 추출된 세포외 매트릭스를 헹구고, 4도에서 6시간 동안 갓 준비된 DNA/RNA 소화 버퍼로 금형을 채웁니다. 소화가 끝나면 소화 용액을 흡인시키고 입증된 바와 같이 멸균 PBS에서 금형을 세 번 헹구는다.세 번째 세척 후, PBS에서 10%의 페니실린-연쇄절제술을 받은 후 밤새 섭씨 4도에서 비계를 배양한 후, 약 1시간 동안 마이너스 80°C.에서 50밀리리터 원뿔튜브로 동결합니다. 메쉬가 완전히 고정되면, 세포외 외 세포 메쉬를 밤새 또는 완전히 건조 할 때까지 lyophilized 스캐폴드를 전달하여 생체 안전 후드 내의 멸균 용기에 옮기고 사용할 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 여기서 이 프로토콜을 사용하여 제작된 폴리설폰 중공 섬유막의 횡면이 비대칭 멤브레인의 특징인 손가락모양의 기공의 외부 및 내부 층을 나타낸다.섬유아세포 세포 파종 및 배양 후, N-메틸-2-피롤리돈 린싱이 입증된 바와 같이 세포외 매트릭스의 반투명 실이 생성됩니다. 세포 외 매트릭스 생성 세포는 전체 3 주 배양 기간 동안 중공 섬유 막 내부에 실행 가능한 남아있다. 추출된 매트릭스는 수화시 반투명 한 외관을 가지며, 메쉬 조립 및 lyophilization에 대한 총 세로 정렬로 오프 화이트 색상과 섬유 모양의 외관을 나타낸다.가장 중요한 단계는 세포외 매트릭스를 추출하기 위해 N-메틸-2-피롤리돈 용매에서 배양 된 중공 섬유 막의 용해 과정이다. 이 방법에 의해 생성된 물질은 전임상 연구에서 조직의 수리를 조사하기 위해 조직 설계 임플란트를 제조하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 N-Methyl-2-pyrrolidone은 피부와 눈 자극제이므로 니트릴 장갑, 고글, 실험실 코트를 사용하여 화학 물질을 처리하고 연기 후드 내에서 처리하는 것이 좋습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

연구

생체공학

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

에 대한 중공의 생물 반응<em&gt; 생체</em&gt; -처럼 포유류 조직 문화

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

브릴 루앙 분광학에 대한 세포 외 기질 단백질 섬유의 제조

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...