Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av nasjonalt Institutt for Arthritis Musculoskeletal og hudsykdommer av National Institutes of Health prisen nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt Arkansas biovitenskap Instituttet.

1. produksjon av ekstracellulær Matrix bruker oppofrende hul Fiber membraner
FORSIKTIG: N-metyl-2-pyrrolidone er en irriterende løsemiddel og reproduktiv toxicant. Eksponering for NMP kan forårsake irritasjon til hud, øyne, nese og hals. Væske-resistent personlig verneutstyr benyttes ved håndtering NMP. Bruk av NMP skal utføres innen avtrekksvifte.
<ol><li>Utarbeidelse av polysulfone polymer løsning for hul fiber membraner
	<ol>
<li>Veie 70 g av polysulfone pellets (...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

Prosessene beskrives gjør at produksjonen av bulk ECM biologisk materiale i vitro med hul fiber membraner kastet av en tørr-jet våt spinning system slik at billige bulk produksjon av membraner som standard celle kultur utstyr. Selv membraner fabrikkert i denne protokollen er ment for bruk i cellekultur, kan systemet beskrevet også tilpasses for produksjon av membraner for separasjon formål, med pore størrelse distribusjon og hule fiber tunable av varierende spinneret dimensjoner, polymer brukes, dop og bar...

Implanterbare kirurgisk stillasene er et innslag av såret reparasjon, med over en million Syntetisk polymer nett implantert over hele verden hvert år for bukveggen reparasjon alene1. Imidlertid etter implantasjon syntetiske materialer polymerer tradisjonelt brukt i produksjon av disse stillaser pleier å provosere en fremmed kropp svar, noe som resulterer i betennelse skadelige for funksjonen til implantatet og arrdannelse av vev2 . Videre, som det dominerende syntetiske mesh materialet (dvs. polypropylen) ikke er merkbart remodeled av kroppen, de er generelt gjelder vev hvor arr kan tolereres, begrense klinisk nytten mot behandling av vev med høyere orden funksjoner som muskel. Mens det er mange kirurgiske maske produkter som har vært brukt med klinisk suksess, minnes siste produsenten av syntetiske kirurgiske masker og komplikasjoner fra Inter vev implantater markere betydningen av maksimere implantat biocompatibility, spørre FDA å stramme forskrift om kirurgiske maske produsenter3,4. Implantering av stillaser avledet fra pasientens eget vev reduserer denne immunrespons, men kan resultere i betydelige donor-områdes sykelighet5. Ekstracellulær matrix (EFM) stillaser produsert i vitro er et mulig alternativ, som decellularized ECM stillaser viser utmerket biocompatibility, spesielt når det gjelder autologous ECM implantater6.
På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av pasienten vev å høste for autologous implantasjon og risikoen for hindrer funksjonen på donor-område, evnen til å produsere ECM stillaser i vitro fra kulturen i humane cellelinjer eller, hvis mulig, en pasient egne celler er et attraktivt alternativ. De største utfordringene i produksjon av betydelige mengder ECM i vitro er lagring av disse vanskelig å fange molekyler. I tidligere arbeid, har vi vist at ECM kan produseres av dyrking ECM-sekresjon fibroblaster i oppofrende polymere skum som oppløses etter kultur perioden til avkastning ECM som kan være decellularized for implantasjon7, 8,9,10. ECM produsert i skum tendens til å vedta den interne arkitekturen i skum, hul fiber membraner (HFMs) ble utforsket som en oppofrende stillaset for produksjon av tråder av ECM. Beskrevet her er metoder oppgave for lab skala produksjon av celle kultur kvalitet hul fiber membraner og utvinning av bulk ekstracellulær matrix fiber fra samme etter en periode av fibroblast kultur. Denne statiske kultur er lett adoptable laboratorier som inneholder standard pattedyr celle kultur utstyr. ECM produsert av denne tilnærmingen kan brukes mot en rekke kliniske applikasjoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Foretatt stillaser avledet fra ekstracellulær matrix (EFM) har drevet interesse i medisin for sitt potensial i påskynde sår nedleggelse og helbredelse. Utvinning av ekstracellulær matrix fra fibrogenic celle kulturer i vitro har potensial for generering av ECM fra human- og potensielt pasient-spesifikke cellelinjer, minimere tilstedeværelsen av xenogeneic epitopes som har hindret klinisk suksessen til noen eksisterende ECM-produkter. En betydelig utfordring i vitro produksjon av ECM egnet for implantasjon er at ECM produksjon av cellekultur er vanligvis av relativt lav avkastning. I dette arbeidet, er protokoller beskrevet for produksjon av ECM av cellene kulturperler innen oppofrende hul fiber membran stillaser. Hul fiber membraner er kultivert med fibroblast linjer i et vanlig celle medium og oppløses etter cellekultur å gi kontinuerlig tråder av ECM. Den resulterende ECM fibrene produsert av denne metoden kan decellularized og lyofiliserte, gjengi det egnet for lagring og implantasjon.

Vellykket produksjon av ekstracellulær matrix fra oppofrende stillasene er betinget av aktuelle stillaset fabrikasjon, cellekultur og løsemiddel skyll prosedyrer. Fabrikasjon av hul fiber membraner utføres med en tørr-jet våt-spinning system samlet fra kommersielt tilgjengelige komponenter (figur 1) som bruker ekstrudering polymer løsning gjennom ringrommet i en kommersielt tilgjengelig stål spinneret (indre diameter = 0,8 mm ytre diameter = 1,6 mm) ti...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Målet med denne protokollen er produksjon av hele ekstracellulær matrix fiber mål for såret reparasjon som passer for prekliniske vurdering som en del av en regenererende stillaset implantat. Disse fibrene er produsert av kulturen i fibroblaster på hul fiber membraner og utdraget av oppløsningen av membraner.

Produksjon av ekstracellulær Matrix fiber via oppofrende hul Fiber membran cellekultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Denne protokollen gjør det mulig for produksjon av filamenter av bulk ekstracellulær matrise fra kultiverte cellelinjer, slik at for forskning på celle matrise interaksjoner, samt forskning på potensialet i dette biomaterialet for sår reparasjon. Disse syntetiske fibrene kan unngå fremmedlegemerespons rettet mot syntetiske materialer, mens de fortsatt trekker fra det rike repertoaret av tekstilfabrikasjonsteknikker for å skape et bredt spekter av vevde implantasjoner. Å demonstrere prosedyren vil være Cassandra Reed, en utdannet student fra laboratoriet mitt.Før såing cellene, autoklav de hule fibermembranene ved 121 grader Celsius i 30 minutter, etterfulgt av behandling med 50 milliliter storfe plasmafibronectin i PBS ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i en time. På slutten av inkubasjonen, bruk steril mikrosaks til å kutte fibrene til seks centimeter eller mindre, og bruk en en milliliter sprøyte utstyrt med en 21 gauge nål for å frø en ganger 10 til de femte fibroblastcellene direkte inn i lumina av de hule fibermembranene. Plasser seks seedede fibre i en seks tommers diameter Petriskål, og inkuber de seedede fibrene ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid.Etter fem minutter, overføre fibrene fra inkubatoren til en ny seks centimeter Petri skål som inneholder fibroblast kultur medium supplert med L-askorbinsyre, L-askorbinsyre 2 fosfat, og transformere vekstfaktor beta 1 i opptil tre uker i cellekulturinkubatoren. På slutten av inkubasjonen, bruk tang o overføre kultiverte fibre til individuelle scintillation hetteglass, og vipp hvert hetteglass for å tillate tilsetning av opptil fem milliliter N-Methyl-2-pyrrolidon ned på siden av hetteglassene. Bruk deretter en serologisk pipette til å sakte aspirere N-Methyl-2-pyrrolidon fra hver fiber, og overføre fibrene til nye scintillation hetteglass for en andre nedsenking i fersk N-Methyl-2-pyrrolidon.Etter den tredje nedsenkingen, skyll de resulterende ekstracellulære matrisetrådene tre ganger i deionisert vann på samme måte, og legg en tre-tommers lang, en-tommers bred 1/23rd-tommers tykk stykke silikongummi med en sentral åtte-av-fire millimeter rektangulær form på en standard tre-til-en-tommers glassmikroskopsklie. Etter autoklavering legger hver ekstracellulær matrisefiber side om side i silikonformen på åtte og fire millimeter til det ikke er synlig åpen plass. Legg formen i et 50 milliliter konisk rør, og frys fibrene ved negative 80 grader Celsius til den er helt frosset.For decellularisering, inkuber formen i 1% natrium dodecylsulfat i 24 timer ved romtemperatur på en rocker med mild agitasjon. Neste dag, skyll den ekstracellulære matrisen med tre vasker i tre milliliter PBS per vask, og fyll formen med nyberedte DNAer / RNAs fordøyelsesbuffer i en seks timers inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av fordøyelsen, aspirere fordøyelsesløsningen og skyll formen tre ganger i steril PBS som vist.Etter den tredje vasken inkuberstiller stillasene i 10% Penicillin-Streptomycin i PBS ved fire grader Celsius over natten før frysing i et 50 milliliter konisk rør ved negativ 80 grader Celsius i omtrent en time. Når nettet er helt frosset, lyofilisere decellularized ekstracellulære mesh over natten, eller til helt tørr, og overføre lyofiliserte stillas til en steril beholder i en bio sikkerhetshette og lagre på fire grader Celsius til bruk. Her vises et tverrgående tverrsnitt av en polysulfon hul fibermembran fabrikkert ved hjelp av denne protokollen, som viser ytre og indre lag av fingerlignende porer som er karakteristiske for en asymmetrisk membran.Etter fibroblast cellesåing og kultur produseres N-Metyl-2-pyrrolidon skylling som demonstrert, gjennomskinnelige tråder av ekstracellulær matrise. Den ekstracellulære matrisen som produserer celler forblir levedyktige inne i de hule fibermembranene gjennom hele tre ukers kulturperiode. Den ekstraherte matrisen har et gjennomsiktig utseende når den er hydrert, og viser en off-white farge og fibrøs utseende med en grov langsgående justering på mesh montering og lyofilisering.Det mest kritiske trinnet er oppløsende prosess av de kultiverte hule fibermembranene i N-Methyl-2-pyrrolidon løsemiddel for å trekke ut den ekstracellulære matrisen. Materialet produsert av denne metoden kan brukes til å fremstille vev konstruert implantater for å undersøke reparasjon av vev i prekliniske studier. N-Methyl-2-pyrrolidon som brukes i denne protokollen er en hud- og øyeirriterende, og derfor anbefales det at du håndterer kjemikaliet ved hjelp av nitrilhansker, briller, en labfrakk og håndterer det i en røykhette.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitelcelle repopulation og klargjøring av gnagere Ekstracellulær Matrix Stillas for Nedsatt Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreaktorer for<em&gt; I Vivo</em&gt; -lignende Pattedyr Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensjonal epitelvev innebygd i ekstracellulær matriks

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Utarbeidelse av ekstracellulær matrix protein fiber for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Fleksibel Hydrogeler fra Lunge ekstracellulær matriks for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrikasjon av ekstracellulære matrise-avledet Skum og Mikrocarriers som Tissue-spesifikke cellekultur og Delivery plattformer

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabrikere en nyre Cortex ekstracellulær Matrix-avledet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Bukspyttkjertelen tissue-avledet ekstracellulære Matrix Bioink for utskrift 3D Cell-Laden bukspyttkjertelen vev konstruksjoner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...