Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de artritis y lesiones músculo-esqueléticas y enfermedades de la piel de los institutos nacionales de salud bajo el número de concesión R15AR064481, la National Science Foundation (CMMI-1404716), así como Instituto de biociencias de Arkansas.

1. producción de matriz extracelular con membranas de fibra hueca sacrificio
PRECAUCIÓN: N-metil-2-pirrolidona es un solvente irritante y tóxicos reproductivos. Exposición a NMP puede causar irritación a la piel, ojos, nariz y garganta. Resistentes al solvente equipo de protección personal debe usarse cuando manejo NMP. Uso de NMP se debe realizar dentro de una campana de humos.
<ol><li>Preparación de solución de polímero de polisulfona membranas de fibra hueca
	<ol...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

Los procesos descritos permiten la producción de granel ECM biomateriales en vitro con membranas de fibra hueca de un sistema de hilado húmedo seco-jet que permite para la producción a granel barato de membranas así como el equipo de cultura de célula estándar. Mientras que las membranas fabricadas en este protocolo están diseñadas para uso en cultivo celular, el sistema descrito también puede ser adaptado para la producción de membranas para fines de separación, con poro tamaño distribución y hueco...

Andamios quirúrgicos implantables son un accesorio de la reparación de la herida, con mallas de polímeros sintéticos más 1 millón implantado en todo el mundo cada año para reparación de pared abdominal solo1. Sin embargo, tras la implantación de los polímeros sintéticos materiales tradicionalmente utilizados en la fabricación de estos andamios tiende a provocar una respuesta de cuerpo extraño, resultando en inflamación deletérea para la función del implante y cicatrización del tejido2 . Además, como los materiales predominantes de malla sintética (es decir, polipropileno) apreciable no son remodelados por el cuerpo, son generalmente aplicables a los tejidos donde se pueda tolerar una cicatriz, limitando su utilidad clínica hacia el tratamiento de tejidos con función de orden superior tales como músculo. Si bien hay muchos productos de malla quirúrgica que han sido aplicados con éxito clínico, fabricante reciente recuerda de sintético quirúrgico mallas y complicaciones de los implantes de tejido entre las especies destacan la importancia de maximizar el implante biocompatibilidad, incitando a la FDA para apretar regulaciones sobre quirúrgica malla fabricantes3,4. Implantación de andamios derivados de tejidos de pacientes reduce esta respuesta inmunitaria, pero resulta en el sitio donante importante morbilidad5. Matriz extracelular (ECM) andamios producidos en vitro son una posible alternativa, como andamios de ECM decellularized exhiben excelente biocompatibilidad, particularmente en el caso de ECM autólogo implantes6.
Debido a la limitada disponibilidad de tejido de la paciente de cosecha para implante autólogo y el riesgo de obstaculizar la función en el sitio donante, la capacidad de producir ECM andamios en vitro de la cultura de líneas celulares humanas o, si es posible, un paciente células propias es una alternativa atractiva. Los retos principales en la fabricación de cantidades sustanciales de ECM en vitro es el secuestro de estas moléculas de difícil captura. En trabajos previos, hemos demostrado que el ECM puede ser producido por cultivo de fibroblastos secretoras de ECM en sacrificio espumas poliméricas que se disuelven después del período de la cultura a ECM de rendimiento que puede ser decellularized de implantación7, 8,9,10. Como ECM producido en espumas tienden a adoptar la arquitectura interna de las espumas, las membranas fibra hueca (HFMs) fueron exploradas como andamio sacrificial para la producción de hilos de ECM. Descritos métodos encargados de laboratorio de la escala de la fabricación de membranas de fibra hueca de calidad de cultura de celulares y la extracción de fibras de la matriz extracelular de bulto de la misma tras un período de cultivo de fibroblastos. Este enfoque de cultura estática es fácilmente adoptable por los laboratorios que contienen equipos de cultura de célula mamífera estándar. ECM producida por este método podría aplicarse a una variedad de aplicaciones clínicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Andamios de ingeniería derivados de matriz extracelular (ECM) tienen conducido gran interés en medicina por su potencial de acelerar el cierre y cicatrización de la herida. Extracción de la matriz extracelular de fibrogénicos celular cultivos en vitro tiene potencial para generación de ECM de líneas celulares humanas - y potencialmente específico para cada paciente, minimizando la presencia de epitopos xenogeneicos que ha dificultado la clínica éxito de algunos productos de ECM existentes. Un reto importante en la producción en vitro de ECM adecuado para la implantación es que producción de ECM por cultivo celular suele ser de relativamente bajo rendimiento. En este trabajo, se describen los protocolos para la producción de ECM por células cultivadas en andamios de membrana de fibra hueca sacrificial. Membranas de fibra hueca son cultivadas con líneas celulares de fibroblastos en un medio celular convencional y disuelto después de cultivo celular para producir filamentos continuos de ECM. Las fibras del ECM resultantes producidas por este método pueden ser decellularized y liofilizadas, haciéndola conveniente para el almacenaje y la implantación.

Éxito de la producción de matriz extracelular de andamios sacrificio depende de fabricación de andamio apropiado, cultivo celular y los procedimientos de enjuague solvente. Fabricación de las membranas de fibra hueca se realiza utilizando un chorro de seco mojado-spinning sistema montado de componentes comercialmente disponibles (figura 1) extrusión de la solución de polímero a través del anillo de acero disponible en el mercado hilera (diámetro inte...

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Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

El objetivo de este protocolo es la producción de fibras de la matriz extracelular todo destinados a la reparación de la herida que son adecuados para la evaluación preclínica como parte de un implante de andamio regenerativa. Estas fibras se producen por la cultura de los fibroblastos en las membranas de fibra hueca y extraídas por disolución de las membranas.

Producción de fibras de la matriz extracelular mediante cultivo de células de membrana de fibra hueca sacrificio

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Este protocolo permite la producción de filamentos de matriz extracelular a granel a partir de líneas celulares cultivadas, lo que permite la investigación en interacciones de matriz celular, así como la investigación sobre el potencial de este biomaterial para la reparación de heridas. Estas fibras sintéticas pueden evitar la respuesta de cuerpo extraño dirigida contra los materiales sintéticos, sin dejar de extraer del rico repertorio de técnicas de fabricación textil para crear una amplia gama de implantes tejidos. Demostrando el procedimiento estará Cassandra Reed, una estudiante graduada de mi laboratorio.Antes de sembrar las células, autoclave las membranas de fibra hueca a 121 grados Celsius durante 30 minutos, seguido de un tratamiento con 50 mililitros de fibronectina plasmática bovina en PBS a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono durante una hora. Al final de la incubación, utilice micro tijeras estériles para cortar las fibras a seis centímetros o menos, y utilice una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 21 para sembrar una vez 10 a las quintas células de fibroblastos directamente en la lumina de las membranas de fibra hueca. Coloque seis fibras de semilla en un plato Petri de seis pulgadas de diámetro, e incuba brevemente las fibras de semillas a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono.Después de cinco minutos, transfiera las fibras de la incubadora a un nuevo plato de Petri de seis centímetros que contenga medio de cultivo de fibroblastos complementado con ácido L-ascórbico, ácido L-ascórbico 2 fosfato, y transformando el factor de crecimiento beta 1 durante hasta tres semanas en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, utilice fórceps o transfiera las fibras cultivadas a viales de centelleo individuales e incline cada vial para permitir la adición de hasta cinco mililitros de N-Metil-2-pirrolidona por el lado de los viales. A continuación, utilice una pipeta serológica para aspirar lentamente la N-metil-2-pirrolidona de cada fibra, y transfiera las fibras a nuevos viales de centelleo para una segunda inmersión en N-Metil-2-pirrolidona fresca.Después de la tercera inmersión, enjuague los hilos de matriz extracelular resultantes tres veces en agua desionizada de una manera similar, y coloque una pieza de tres pulgadas de largo, una pulgada de ancho de 1/23 pulgadas de espesor de caucho de silicona con un molde rectangular central de ocho por cuatro milímetros en un portaobjetos de vidrio estándar de tres por uno. Después del autoclaving, poner cada fibra de matriz extracelular lado a lado en el molde de silicona de ocho por cuatro milímetros hasta que no haya espacio abierto visible. Coloque el molde en un tubo cónico de 50 mililitros y congele las fibras a 80 grados Celsius negativos hasta que estén completamente congeladas.Para la descelularización, incubar el molde en 1%sulfato de dodecil sódico durante 24 horas a temperatura ambiente en un balancín con agitación suave. Al día siguiente, enjuague la matriz extractorular extracelular con tres lavados en tres mililitros de PBS por lavado, y llene el molde con Tampón de digestión de DNA/RNAs recién preparado durante una incubación de seis horas a cuatro grados centígrados. Al final de la digestión, aspirar la solución de digestión y enjuagar el moho tres veces en PBS estéril como se ha demostrado.Después del tercer lavado, incubar los andamios en 10%Penicilina-Estreptomicina en PBS a cuatro grados Celsius durante la noche antes de congelarse en un tubo cónico de 50 mililitros a 80 grados Celsius negativos durante aproximadamente una hora. Cuando la malla se haya congelado por completo, liofilice la malla extracelular descelular durante la noche, o hasta que esté completamente seca, y transfiera los andamios liofilizados a un recipiente estéril dentro de una capucha de biosecución y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta su uso. Aquí se muestra una sección transversal transversal de una membrana de fibra hueca de polisulfona fabricada con este protocolo, que exhibe capas externas e internas de poros similares a los dedos característicos de una membrana asimétrica.Después de la siembra y el cultivo de células de fibroblastos, se producen enjuagamientos de N-metil-2-pirrolidona como se demuestra, se producen hilos translúcidos de matriz extracelular. Las células productoras de matriz extracelular siguen siendo viables dentro de las membranas de fibra hueca durante todo el período de cultivo de tres semanas. La matriz extraída tiene un aspecto translúcido cuando se hidrata, mostrando un color blanquecino y aspecto fibroso con una alineación longitudinal bruta sobre el ensamblaje de malla y la liofilización.El paso más crítico es el proceso de disolución de las membranas de fibra hueca cultivadas en el disolvente N-metil-2-pirrolidona con el fin de extraer la matriz extracelular. El material producido por este método se puede utilizar para la fabricación de implantes de ingeniería de tejido para investigar la reparación de tejidos en estudios preclínicos. El N-Metil-2-pirrolidona utilizado en este protocolo es un irritante para la piel y los ojos, y por lo tanto se recomienda que maneje el producto químico utilizando guantes de nitrilo, gafas, una capa de laboratorio, y manejarlo dentro de una campana de humo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Investigación

Bioingeniería

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

La repoblación de las células epiteliales y Preparación de roedores matriz extracelular andamios para el Desarrollo del tejido renal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Biorreactores de fibra hueca para<em&gt; En Vivo</em&gt; -como Cultivo de tejidos de mamíferos

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Preparación de la matriz extracelular fibras de proteína de Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

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