Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of Arthritis och muskuloskeletala systemet och hudsjukdomar av det nationella Institutes of Health award nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt Arkansas Biosciences Institute.

1. produktion av extracellulärmatrix med uppoffrande ihålig Fiber membran
FÖRSIKTIGHET: N-metyl-2-pyrrolidon är en irriterande lösningsmedel och reproduktiv för människor. Exponering för NMP kan orsaka irritation på hud, ögon, näsa och hals. Lösningsmedel-resistenta personlig skyddsutrustning ska användas vid hantering av NMP. Användning av NMP bör utföras i dragskåp.
<ol><li>Beredning av polysulfon polymer lösning för ihålig fiber membran
	<ol>
<li>Väge...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

De processer som beskrivs möjliggör produktion av bulk ECM biomaterial i vitro med ihålig fiber membran kastades av en torr-jet våta spinning-system som möjliggör billiga huvuddelen produktion av membran samt standard cell kultur utrustning. Medan de membran som är fabricerade i detta protokoll är avsedda för användning i cellkultur, kan det beskrivna systemet även anpassas för produktion av membran för separation, med por storlek distribution och ihålig fiber mått avstämbara av varierande spinnd...

Implanterbara kirurgiska ställningar är en fixtur av såret reparation, med över en miljon syntetisk polymer maskor implanteras i världen varje år för bukväggen reparation ensam1. Men efter implantation syntetmaterial polymererna traditionellt används vid tillverkning av dessa ställningar tenderar att provocera en främmande kropp som svar resulterar i inflammation skadliga till funktionen av implantatet och ärrbildning i vävnad2 . Ytterligare, eftersom de dominerande syntetiska nät material (dvs polypropen) inte är märkbart remodeled av kroppen, de är allmänt tillämpliga på vävnader där ärrbildning kan tolereras, vilket begränsar deras kliniska nyttan mot behandling av vävnader med högre ordningens funktion såsom muskel. Medan det finns många kirurgiska mesh-produkter som har tillämpats med klinisk framgång, senaste tillverkaren påminner om av syntetiska kirurgiska maskor och komplikationer från SAR vävnad implantat betona vikten av att maximera implantat biokompatibilitet, föranledde FDA att skärpa bestämmelserna om kirurgiska mesh tillverkare3,4. Implantation av ställningar som härrör från patienternas egna vävnader minskar detta immunsvar, men kan resultera i betydande givare-site sjuklighet5. Extracellulär matrix (ECM) ställningar som producerats in vitro- är ett möjligt alternativ, som cell-lösa ECM ställningar uppvisar utmärkt biokompatibilitet, särskilt när det gäller autolog ECM implantat6.
På grund av den begränsade tillgången av patientens vävnad att skörda för autolog implantation och risken för hindrar funktionen på webbplatsen givare, förmågan att producera ECM ställningar i vitro från kulturen av mänskliga cellinjer eller, om möjligt, en patients egna celler är ett attraktivt alternativ. De viktigaste utmaningarna för tillverkning av betydande mängder av ECM i vitro är beslagtagande av dessa svårt-att-capture molekyler. I tidigare arbete, vi har visat att ECM kan produceras av odlingsskålar ECM-utsöndrar fibroblaster i uppoffrande polymera skum som löses efter perioden kultur till kapacitet ECM som kan vara decellularized för implantation7, 8,9,10. Som ECM som produceras i skum tenderar att anta interna arkitekturen av skum, ihålig fiber membran (HFMs) undersöktes som en uppoffrande byggnadsställning för produktion av trådar av ECM. Beskrivs häri metoder i uppdrag att för lab skala tillverkning av cellmembranen kultur kvalitet ihålig fiber och utvinning av bulk extracellulärmatrix fibrer från samma efter en period av fibroblast kultur. Denna statiska kultur strategi är lätt adoptable av laboratorier som innehåller standard däggdjursceller kultur utrustning. ECM produceras av detta synsätt skulle kunna tillämpas mot en mängd kliniska tillämpningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Bakåtkompilerade ställningar härrör från extracellulär matrix (ECM) har driven betydande intresse i medicin för sin potential påskynda sår stängning och helande. Utvinning av extracellulär matrix från fibrogenic cell kulturer i vitro har potential för generering av ECM från mänskliga- och potentiellt patientspecifika cellinjer, minimera förekomsten av xenogena epitoper som har hindrat den kliniska framgången för vissa befintliga ECM-produkter. En stor utmaning i in vitro- produktion av ECM lämpliga för implantation är att ECM produktion av cellodling är vanligtvis relativt låg avkastning. I detta arbete beskrivs protokoll för produktion av ECM av celler odlade inom uppoffrande ihålig fiber membran ställningar. Ihålig fiber membran är odlade med fibroblast cellinjer i konventionella cell medium och upplöstes efter cellkultur att ge kontinuerlig trådar av ECM. Den resulterande ECM-fibrer som framställs med denna metod kan cell-lösa och frystorkade, gör den lämplig för lagring och implantation.

Framgångsrik produktion av extracellulärmatrix från uppoffrande ställningar är avhängigt lämpliga byggnadsställning fabrication, cellkultur och lösningsmedel skölj procedurer. Tillverkning av ihåliga fiber membranen utförs med hjälp av en torr-jet våt-spinning system monteras från kommersiellt tillgängliga komponenter (figur 1) som använder extrudering av polymer lösning genom annulus av en kommersiellt tillgänglig stål spinndysor (innerdi...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Målet med detta protokoll är produktionen av hela extracellulära matrix fibrer måltavlan för såret reparation som är lämpliga för preklinisk utvärdering som en del av en regenerativ byggnadsställning implantatet. Dessa fibrer är producerad av kulturen av fibroblaster på ihålig fiber membran och utvinns av upplösningen av membranen.

Produktion av extracellulärmatrix fibrer via uppoffrande ihålig Fiber membran cellkultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Detta protokoll möjliggör produktion av filament av bulk extracellulära matris från odlade cellinjer, vilket möjliggör forskning om cellmatris interaktioner, samt forskning om potentialen i detta biomaterial för sår reparation. Dessa syntetiska fibrer kan undvika den utländska kroppen svar riktat mot syntetiska material, medan fortfarande dra från den rika repertoar av textil tillverkning tekniker för att skapa ett brett spektrum av vävda implantables. Demonstrerar proceduren blir Cassandra Reed, en doktorand från mitt labb.Innan sådd cellerna, autoklav den ihåliga fibermembran vid 121 grader Celsius i 30 minuter, följt av behandling med 50 milliliter av bovint plasma fibronectin i PBS vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i en timme. I slutet av inkubationen, använd steril mikro sax för att skära fibrerna till sex centimeter eller mindre, och använda en en milliliter spruta utrustad med en 21 gauge nål för att utsäde en gång 10 till den femte fibroblast celler direkt i lumina av de ihåliga fibermembran. Placera sex seedade fibrer i en sex tums diameter Petriskål, och kort inkubera de seedade fibrerna på 37 grader Celsius i 5%koldioxid.Efter fem minuter, överföra fibrerna från inkubatorn till en ny sex centimeter Petri skålen innehåller fibroblast odling medium kompletteras med L-askorbinsyra, L-askorbinsyra 2 fosfat, och omvandla tillväxtfaktor beta 1 i upp till tre veckor i cellkulturen inkubatorn. I slutet av inkubationen, använd forceps o överföra de odlade fibrerna i enskilda scintillations injektionsflaska, och luta varje injektionsflaska för att möjliggöra tillsats av upp till fem milliliter av N-Metyl-2-pyrrolidon ner sidan av injektionsflaskan. Använd sedan en serologisk pipett för att långsamt aspirera N-Metyl-2-pyrrolidon från varje fiber, och överföra fibrerna till nya scintillationsflaska för en andra nedsänkning i färsk N-Metyl-2-pyrrolidon.Efter den tredje nedsänkning, skölj den resulterande extracellulära matris trådar tre gånger i avjoniserat vatten på ett liknande sätt, och placera en tre-tum-lång, en tum bred 1/23rd-inch-tjock bit silikon gummi med en central åtta-av-fyra millimeter rektangulär mögel på en standard tre-för-en tums glas mikroskop glida. Efter autoklavering, lägg varje extracellulär matris fiber sida vid sida i åtta-av-fyra millimeter silikon mögel tills det inte finns någon synlig öppet utrymme. Placera formen i en 50 milliliter koniska röret, och frysa fibrerna på negativa 80 grader Celsius tills helt fryst.För decellularisering, inkubera formen i 1%natrium dodecyl sulfat i 24 timmar vid rumstemperatur på en rocker med mild agitation. Nästa dag, skölj den extraherade extracellulära matrisen med tre tvättar i tre milliliter PBS per tvätt, och fyll formen med nyberedda DNAs / RNAs matsmältningsbuffert för en sex timmars inkubation vid fyra grader Celsius. I slutet av matsmältningen, aspirera matsmältningslösningen och skölja formen tre gånger i steril PBS som visat.Efter den tredje tvätten, inkubera byggnadsställningarna i 10%Penicillin-Streptomycin i PBS vid fyra grader Celsius över natten innan frysning i en 50 milliliter konisk rör vid negativa 80 grader Celsius i ungefär en timme. När nätet har helt fryst, lyophilize decellularized extracellulära nätet över natten, eller tills helt torr, och överföra lyophilized byggnadsställningar till en steril behållare inom en bio säkerhet huva och förvara i fyra grader Celsius tills användning. Här en tvärgående tvärsnitt av en polysulfon ihåliga fibermembranet fabriceras med hjälp av detta protokoll visas, uppvisar yttre och inre lager av finger-liknande porer kännetecknande för en asymmetrisk membran.Efter fibroblast cell sådd och kultur, N-Methyl-2-pyrrolidon sköljning som visat, genomskinliga trådar av extracellulär matris produceras. Den extracellulära matris producerar celler förblir livskraftiga inuti de ihåliga fibrer membranen under hela tre veckor kulturperioden. Den extraherade matrisen har ett genomskinligt utseende när hydratiserade, uppvisar en benvit färg och fibrösa utseende med en grov longitudinella anpassningen vid mesh montering och lyophilization.Det mest kritiska steget är upplösningsprocessen av de odlade ihåliga fibermembranen i lösningsmedlet N-Metyl-2-pyrrolidon för att kunna extrahera den extracellulära matrisen. Det material som produceras med denna metod kan användas för att fabricera vävnadskonstruerade implantat för undersökning av reparation av vävnader i prekliniska studier. N-Methyl-2-pyrrolidon som används i detta protokoll är en hud och ögonirriterande, och därför rekommenderas att du hanterar kemikalien med nitrilhandskar, skyddsglasögon, en labbrock, och hantera den inom en rökhuva.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Beröringsfri, Label-free övervakning av celler och extracellulär matris med Raman-spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitelceller Återplantering och framställning av gnagare Extracellular Matrix Byggnadsställningar för njurvävnad utveckling

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hålfiber Bioreaktorer för<em&gt; In Vivo</em&gt; -liknande Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionella epitelvävnader Embedded inom extracellulär matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Beredning av extracellulära matrixproteinfibrer för Brillouin spektroskopi

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Avstämbar Hydrogeler från Lung Extracellulär Matrix för 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Tillverkning av extracellulär matrix-härledda Skum och Mikrobärare som Vävnadsspecifik Cellodling och Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabricera en njure Cortex extracellulära Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasvävnad-härledda extracellulära matrix Bioink för utskrift 3D cell-lastat Pankreasvävnad konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En mänsklig 3D extracellulär matrix-Adipocyte kultur modell för att studera Matrix-cell metabola överhörning

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...