Name: production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture
Uploaded: 2019-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Bu yayında bildirilen araştırma Ulusal Enstitüsü artrit ve Musculoskeletal ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numaradaki R15AR064481, Ulusal Bilim Vakfı (CMMI-1404716), cilt hastalıkları tarafından desteklenen yanı sıra Arkansas Biosciences Enstitüsü.

1. hücre dışı matriks kurban Hollow Fiber membranlar kullanarak imalatı
Dikkat: N-metil-2-Pirolidon bir rahatsız edici solvent ve üreme toxicant dir. NMP maruz deri, göz, burun ve boğaz tahrişe neden olabilir. Solvent dayanıklı kişisel koruyucu ekipman NMP işlerken kullanılır. NMP kullanımı bir duman başlık içinde gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Hollow fiber membranlar polysulfone Polimer çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>Polysulfone Pellet 70 g tartmak...

<ol>
	<li>Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+argument+for+lightweight+polypropylene+mesh+in+hernia+repair.">The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair.</a> Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).</li><li>Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials/Tissue+Interactions:+Possible+Solutions+to+Overcome+Foreign+Body+Response.">Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response.</a> The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).</li><li>Simon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+failure+of+the+tissue+engineered+porcine+heart+valve+SYNERGRAFT&#174;+in+pediatric+patients.">Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT&#174; in pediatric patients.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).</li><li>Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+and+anterior+knee+problems+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+autografts.">Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts.</a> Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic &amp; Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).</li><li>Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+extracellular+matrix+scaffolds+for+tissue+engineering.">Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).</li><li>Wolchok, J. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+cell+derived+extracellular+matrix+constructs+using+sacrificial+open-cell+foams.">The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams.</a> Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).</li><li>Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+derived+extracellular+matrix+fibers+synthesized+using+sacrificial+hollow+fiber+membranes.">Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes.</a> Biomedical Materials. 13 (1), (2017).</li><li>Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+biological+scaffold+engineered+using+the+extracellular+matrix+secreted+by+skeletal+muscle+cells.">Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells.</a> Biomaterials. 49, 9-17 (2015).</li><li>Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+infusion+bioreactor+for+the+accelerated+preparation+of+decellularized+skeletal+muscle+scaffolds.">Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds.</a> Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).</li><li>Murad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collagen+synthesis+by+ascorbic+acid.">Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype.">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li><li>Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progresses+in+polymeric+hollow+fiber+membrane+preparation,+characterization+and+applications.">Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications.</a> Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).</li><li>Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).</li></ol>

Açıklanan işlemleri bir kuru-jet ıslak eğirme sisteminde membranlar hem standart hücre kültür malzemesi ucuz toplu üretimi için artığını hollow fiber membranlar kullanarak toplu ECM Biyomalzeme vitro üretimini sağlar. Bu protokol için fabrikasyon membran hücre kültüründe kullanmak içindir iken, açıklanan sistem ayrıca membran ayırma amacıyla, gözenek boyutu dağıtım ve içi boş lif boyutları değişen tarafından ayarlanabilir ile üretim için adapte edilebilir spinneret boyutlar...

İmplante edilebilir cerrahi iskele bir fikstür yara onarım, dünya çapında her yıl karın duvarı tamir yalnız1için implante bir milyonu aşkın sentetik Polimer kafesler ile vardır. Ancak, sentetik malzemeler polimerler, geleneksel olarak bu iskele imalatı kullanılan implantasyon ardından implant işlevi için zararlı iltihap sonucu ve skar dokusu2 bir yabancı cisim tepki uyandirmak eğilimindedir . Baskın sentetik kafes malzemeleri (Yani, Polipropilen) kayda değer vücut tarafından yenilenmiş değil gibi daha fazla, onlar nerede skarlasma tolere, dokulara genellikle tabidir klinik kullanışlılığı tedavisinde doğru sınırlama kas gibi üst düzey işlev kurcalayarak. Klinik başarı ile uygulanan birçok cerrahi mesh ürün olmakla birlikte, son üretici kafesler ve türler arası doku implantları komplikasyonlar implant en üst düzeye çıkarma önemini vurgulamak sentetik cerrahi hatırlıyor biyouyumluluk, cerrahi düzenlemelerini sıkılaştırmak için FDA isteyen Üreticiler3,4kafes. Hastaların kendi dokulardan türetilmiş iskele implantasyonu bu bağışıklık yanıtı azaltır, ancak önemli donör-site morbidite5' te neden olabilir. Hücre dışı matriks (ECM) üretilen iskele vitro decellularized ECM iskele mükemmel biyouyumluluk, sergilemek gibi mümkün olan bir alternatif, özellikle otolog ECM durumunda6implantlar var.
Otolog implantasyonu hasat için hasta doku sınırlı kullanılabilirlik ve donör sitesinde işlevini engelleyen riski nedeniyle, ECM üretmek için yetenek vitro insan hücre hatları ile kültür iskele veya mümkünse bir hastanın kendi hücreleri cazip bir alternatif olduğunu. Bu yakalama zor moleküller haciz ECM vitro önemli miktarda üretiminde birincil sorunları var. Önceki çalışmalarda, ECM ECM-salgılayan fibroblastlar implantasyon7, için decellularized verim ECM kültür döneminden sonra çözünmüş kurban polimerik köpükler içinde kültür tarafından üretilen göstermiştir 8,9,10. ECM üretilen köpükler Köpükler iç mimarisini kabul eğilimindedir, hollow fiber membranlar (HFMs) konuları ve ECM üretimi için kurban bir iskele olarak keşfedilmeyi. Laboratuvar ölçekli için hücre kültür kalite hollow fiber zarları ve toplu hücre dışı matriks elyaf çekme--dan aynı döneminden sonra fibroblast kültürünün imalatı burada açıklanan yöntemleri görevli vardır. Bu statik kültür standart memeli hücre kültür donanımları içeren laboratuvarları tarafından kolayca adoptable yaklaşımdır. Bu yaklaşım tarafından üretilen ECM çeşitli klinik uygulamaları doğru uygulanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/32 inch thick silicone rubber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>B01LXJULOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-004</td>
			<td>With attached white urea cap and cork foil liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch by 1 inch microscopy slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4C refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FRGG2304D</td>
			<td>Any commercial 4C refrigerator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E646</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bore vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Plasma Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Comes as 1 mg of lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator w/ CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-208</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Warm in water bath at 37&#176;C for 30 minutes prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dope vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>89785K867</td>
			<td>6 ft 316 steel tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1160</td>
			<td>Dilute to 70% for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four 1/4-inch to 1&#34; reducing unions</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1610-6-4</td>
			<td>One reducing union for each inlet and outlet of each vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer/lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>117 (A65312906)</td>
			<td>Any lyophilizer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89106-752</td>
			<td>Any weigh boat will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow fiber membrane immersion bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Fiber Membrane Spinneret</td>
			<td>AEI</td>
			<td>http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html</td>
			<td>Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM) - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>VWR/Alfa Aesar</td>
			<td>AA12315-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 Freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UXF40086A</td>
			<td>Any commercial -80C freezer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas cylinders (two)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-2-pyrrolidone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1141</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>428302</td>
			<td>Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>Alternative brands may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>52315K24</td>
			<td>Alternative brands may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat skeletal muscle fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1460N28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take-up motor</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>B071GTTSV3</td>
			<td>200 RPM DC Motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>VWR/Amresco</td>
			<td>97063-756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two needle valves</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td>SS-1RS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of extracellular matrix fibers via sacrificial hollow fiber membrane cell culture

Hücre dışı matriks (ECM) türetilmiş mühendislik iskele kapanması ve şifa yara hızlandırdığını onların potansiyel için ilaç tahrik önemli ilgim yok. Hücre dışı matriks çekme--dan fibrogenic hücre kültürleri vitro ECM üretimi klinik engel xenogeneic epitopları varlığı en aza indirme insan - ve potansiyel olarak hasta özel hücre satırlarından için potansiyeli Bazı varolan ECM ürünler başarısı. ECM implantasyon için uygun vitro üretiminde önemli bir meydan okuma ECM üretim hücre kültürü tarafından genellikle nispeten düşük verim olmasıdır. Bu çalışmada, hücreleri kurban hollow fiber membran iskele içinde kültürlü tarafından ECM üretimi için iletişim kuralları anlatılmaktadır. Hollow fiber membranlar geleneksel cep orta fibroblast hücre hatları ile kültürlü ve ECM sürekli konuları vermeye hücre kültürü sonra çözünmüş. Bu yöntemle üretilen elde edilen ECM elyaf decellularized ve liyofilize, depolama ve implantasyon için uygun işleme.

Hücre dışı matriks kurban iskele üzerinden başarılı üretim uygun iskele imalatı, hücre kültürü ve solvent durulama yordamlar şartlı olduğunu. Hollow fiber membranlar imalatı ekstrüzyon Polimer çözüm piyasada bulunan bir çelik halka aracılığıyla kullanan ticari olarak mevcut bileşenleri (Şekil 1) monte bir kuru-jet ıslak eğirme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir spinneret (iç çap = 0.8 mm, dış çap = 1,6 mm) hollow fibe...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture at JoVE.com

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Bu iletişim kuralı bir rejeneratif iskele implant parçası olarak preklinik değerlendirme için uygun olan yara onarım için hedeflenen tüm hücre dışı matriks elyaf üretim hedeftir. Bu iplikler fibroblastlar hollow fiber membranlar üzerinde kültür tarafından üretilen ve membranlar dağılması tarafından ayıklanır.

Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Bu protokol kültürlü hücre hatlarından dökme ekstrasellüler matris filamentler üretimi için izin verir, hücre matris etkileşimleri içine araştırma için izin, yanı sıra yara onarımı için bu biyomalzemenin potansiyeli içine araştırma. Bu sentetik lifler sentetik malzemelere karşı yöneltilen yabancı cisim tepkisini önleyebilir, tekstil üretim tekniklerinin zengin repertoiresinden çizim yaparken çok çeşitli dokuma implante edilebilirler oluşturabilir. Prosedürü gösteren Cassandra Reed, benim laboratuarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.Hücreleri tohumlamadan önce, içi boş lif zarlarını 30 dakika boyunca 121 derecede otoklavlayın, ardından PBS'de 50 mililitre büyükbaş plazma fibronektin ile bir saat boyunca %5 karbondioksitte 37 santigrat derece. Kuluçka sonunda, altı santimetre veya daha az lifleri kesmek için steril mikro makas kullanın, ve bir mililitre şırınga bir kez tohum için 21 gauge iğne ile donatılmış kullanın 10 beşinci fibroblast hücreleri doğrudan içi boş lif zarlarının lumina içine. Altı inç çapında Petri çanak içine altı tohumlu lifler yerleştirin ve kısaca% 5 karbondioksit 37 santigrat derece tohumlu lifler inkübün.Beş dakika sonra, l-askorbik asit ile takviye fibroblast kültür orta içeren yeni bir altı santimetre Petri çanak içine kuvöz lifleri aktarın, L-askorbik asit 2 fosfat, ve hücre kültürü kuluçka üç hafta için büyüme faktörü beta 1 dönüştürme. Kuluçka sonunda, forceps o bireysel scintillation şişeleri içine kültürlü lifleri aktarmak ve her şişe tilt beş mililitre N-Metil-2-pyrrolidone kadar ilave şişelerin yan aşağı izin vermek. Sonra yavaş yavaş her lif N-Metil-2-pyrrolidone aspire için bir serolojik pipet kullanın, ve taze N-Methyl-2-pyrrolidone ikinci bir daldırma için yeni scintillation şişeleri içine lifleri aktarın.Üçüncü daldırma sonra, benzer bir şekilde deiyonize suda ortaya çıkan ekstrasellüler matris iplikleri üç kez durulayın ve standart bir üç-by-one inç cam mikroskop slayt üzerine merkezi sekiz-by-dört milimetre dikdörtgen kalıp ile silikon kauçuk üç inç uzunluğunda, bir inç genişliğinde 1/23rd-inç kalınlığında parça yerleştirin. Otoklavlama dan sonra, görünür açık alan olana kadar sekiz ila dört milimetrelik silikon kalıbın ait her bir ekstrasellüler matriks lifini yan yana yatırın. 50 mililitrelik konik tüp içine kalıp yerleştirin ve tamamen dondurulmuş kadar negatif 80 santigrat derece lifleri dondurun.Decellularization için, nazik ajitasyon ile bir rocker oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 1 sodyum dodecyl sülfat kalıp kuluçka. Ertesi gün, yıkama başına PBS üç mililitre üç yıkar ile çıkarılan ekstrasellüler matris durulayın ve dört derece santigrat altı saatlik kuluçka için taze hazırlanmış DNA / RNA sindirim tampon ile kalıp doldurun. Sindirim sonunda, sindirim çözeltisi aspire ve steril PBS olarak gösterdiği gibi üç kez kalıp durulayın.Üçüncü yıkamadan sonra, yaklaşık bir saat boyunca negatif 80 santigrat derecede 50 mililitrelik konik tüp donma önce dört derece Santigrat bir gecede PBS% 10 Penisilin-Streptomisin iskeleler inkübün. Mesh tamamen donduğunda, bir gecede hücre dışı ağ lıfilat, ya da tamamen kuruyana kadar, ve bir biyo güvenlik başlığı içinde steril bir konteyner için lyophilized iskeleler aktarın ve kullanıma kadar dört derece santigrat de saklamak. Burada bu protokol kullanılarak imal edilen bir polisülfon içi fiber membranın enine kesiti gösterilmektedir, asimetrik membran karakteristik parmak benzeri gözenekleri dış ve iç katmanları sergileyen.Fibroblast hücre fidesi ve kültüründen sonra, gösterildiği gibi N-Metil-2-pyrrolidone durulama, hücre dışı matriks yarı saydam iplikler üretilir. Hücre dışı matriks üreten hücreler tüm üç haftalık kültür dönemi boyunca içi boş lif zarları içinde canlı kalır. Çıkarılan matris sulu bir yarı saydam bir görünüme sahiptir, örgü montaj ve lyophilization üzerine brüt uzunlamasına hizalama ile bir off-beyaz renk ve lifli bir görünüm sergileyen.En kritik adım, hücre dışı matriks çıkarmak için N-Metil-2-pyrrolidone çözücü kültürlü içi boş lif zarlarının eritme işlemidir. Bu yöntemle üretilen malzeme, klinik öncesi çalışmalarda dokuların onarımını araştırmak için doku mühendisliği implantlarının imalatında kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan N-Metil-2-pyrrolidone bir deri ve göz tahriş edici, ve bu nedenle nitril eldiven, gözlük, bir laboratuvar ceket kullanarak kimyasal ele önerilir, ve bir duman başlık içinde ele.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

için içi boş fiber Biyoreaktörler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Benzeri Memeli Doku Kültürü

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin Spektroskopisi için Ekstraselüler Matriks Proteini Elyaf Hazırlama

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...