Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

يشكر المؤلفون أعضاء المختبر من المحققين الرئيسيين شمال غرب التالية: درينان ريان، دال جيمس سورمير، يفجينيا كوزوروفيتسكيي، وأنيس المقاول. بتأييد هذا العمل لنا الوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) (منح DA035942 و DA040626 إلى R.M.D.)، ومؤسسة PhRMA (زمالة M.C.A.)، و HHMI.

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area:+Functional+organization+and+behavioral+implications.">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li><li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis:+time+to+move+on.">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation.">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li><li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate.">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li><li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology.">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission.">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li><li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#945;6&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function.">&#945;4&#945;6&#946;2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li><li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices.">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenula+&amp;#34;cholinergic&amp;#34;+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes.">Habenula &amp;#34;cholinergic&amp;#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li><li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity.">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression.">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines.">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li><li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond.">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).</li><li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice.">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).</li><li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains.">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li><li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+scanning+photochemical+microscopy:+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions.">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li><li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+and+Ca2++regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons.">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li><li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity.">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li><li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li><li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+workstation+with+concurrent,+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities.">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li><li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons.">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li><li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5 (2004).</li><li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li><li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses.">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li><li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula.">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li><li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity.">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826 (2016).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+&#945;4&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances &#945;4&#946;2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission.">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li></ol>

D.L.W. يخدم كمستشار مدفوعة "الفحص المجهري Fluorescence نانو بروكر".

اختيار أسلوب التطبيق/تسليم السلطة الفلسطينية-Nic هو الخطوة الأكثر أهمية في هذه التقنية المترجمة صور-التحفيز. أسلوبي، وتطبيق حمام ونضح المحلية، كل تقدم مزايا متميزة والقيود. الاختيار إلى حد كبير يتأثر مستوى التعبير الفنية ناتشر في الخلية نوع من الفائدة. أنها غالباً ما يفضل استخدام حمام التطبيق عندما تكون مستويات التعبير الفنية العالية، كما يسمح التطبيق حمام لتركيز تحقيق موحدة المحيطة بالخلية مسجل، تيسير تفسير البيانات. تطبيق حمام أيضا يلغي الحاجة إلى ماصة نضح ثانية في الأنسجة، مما يجعل من الأسهل العملية برمتها. ومع ذلك، المركبات تطبيق حمام مكلفة التكاليف أكثر كل تجربة.
عادة، استكشاف الأخطاء وإصلاحها ينطوي على محاولة لفهم لماذا هو تنشيط ناشر لا ينظر التحلل فلاش التالية. عند العمل مع نوع خلية التي لم تدرس سابقا مع السلطة الفلسطينية-Nic، المحقق ينبغي أداء التطبيق نفخة المحلي لمنظمة العمل ضد الجوع أو النيكوتين تحديد ما إذا كانت مستقبلات كافية وظيفيا عن5. وينبغي أن يتم للتحقق من أن النظام قادر على الكشف عن استجابات التحلل الضوئي، تجارب التحكم في الخلايا العصبية هابينولا الآنسي التي تعبر عن كميات كبيرة من مستقبلات30. في هذا المجال الدماغ، والسلطة الفلسطينية-Nic حمام التطبيق الممكن، وهو الأفضل لإجراء التجارب على التحقق من صحة. إلا بعد إجراء هذه التجارب التحقق من الصحة يجب أن واحد الانتقال إلى نوع خلية تدرس. إذا كان قد تم التحقق من صحة النظام التجريبي والردود تبقى صغيرة جداً أو غير قابلة للكشف، فإنه قد يكون هناك مبرر لزيادة تركيز السلطة الفلسطينية-Nic، وزيادة كثافة فلاش أو مدة النبضة، إضافة المغير ناشر اللوستيريك إيجابية لتعزيز ناشر النشاط6، أو مزيج من هذه.
في بعض الأحيان، الردود أونكاجينج كبيرة جداً، مع تنشيط ناشر كبير أدى إلى الجهد غير المباشرة بوابات نا+ قناة التنشيط والتيارات إلى الداخل أونكلامبيد سبب المشبك الفضاء الفقراء. يمكن القضاء على هذه التحف التي تماما تحجب التيارات ناشر إلى الداخل واستحالة تفسير البيانات، بإدراج QX-314 (2 مم) في ماصة التسجيل. قد أيضا القضاء بالحد من تركيز السلطة الفلسطينية-Nic أو بتخفيض كثافة فلاش أو مدة النبضة. في جميع التجارب التي صور الضوء المرئي-التحفيز، يجب توخي الحذر عند اختيار مواقع التحفيز لتجنب التحفيز/التحلل غير مقصودة لأعلى أو أسفل المستوى البؤري المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، وعندما ينطبق، قوة الليزر يجب دائماً أن تيتراتيد استخراج الاستجابات الفسيولوجية. من المهم خصوصا أن تكون على علم فوتوستيموليشن محور ع عند العمل مع يغاندس محبوس، يغاندس التي يتم تنشيطها أعلى/أسفل بقعة التنسيق قد لا يزال منتشر والتفاعل مع النظام البيولوجي (أي مستقبلات، ) في إطار الدراسة.
السلطة الفلسطينية-Nic الليزر فلاش التحلل الضوئي قد لا تكون مناسبة لجميع المحققين، كما توجد قيود عديدة. الأول هو التكلفة العالية نسبيا لهيكل مناسب. عند العمل مع شرائح المخ سليمة، أونكاجينج قرب الهياكل الصغيرة-قطر مثل dendrites يتطلب نظام تصور متطورة مثل مجهر 2-فوتون. وبصرف النظر عن التكلفة العالية Ti:sapphire، الانضباطي الليزر نبضات الأشعة تحت الحمراء للمنفذ 2-فوتون مجهرية، نظام مزدوج-جلفانومتر قادر على المواقع بشكل مستقل اثنين من أشعة الليزر كذلك يزيد من تكلفة النظام. يمكن تخفيض تكاليف النظام الكلي باستخدام نظام الصنع إذا كان المحقق لديه ما يكفي من الخبرة والوقت لبناء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، والمحافظة على هذا نظام. القيد ثاني غالباً ما ينطوي على التعبير الفنية ناشر منخفضة، مما يمكن التخفيف جزئيا عن طريق اتخاذ الخطوات كما هو مذكور أعلاه، ولكن هذا قد لا تضمن النجاح. عادة، إذا كان أحد لا يمكن قياس التيارات يجند تفعيلها بعد نفخة-تطبيق يضع، السلطة الفلسطينية-Nic فلاش التحلل تحت المشبك الجهد قد لا تعطي نتائج مقبولة. القيد ثالث ينطوي الجوهرية الأسفار للسلطة الفلسطينية-Nic nic. السلطة الفلسطينية تمتص الضوء ~ 405 نانومتر وتنبعث في مجموعة مماثلة كالبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) أو أليكسا 4885. عندما تتجاوز تركيزات السلطة الفلسطينية-Nic ~ 1 مم، هذه الخاصية الأسفار يمكن جعلها صعبة في نفس الوقت تصور الهياكل العصبية. للتخفيف من هذا، المهم أن تكون قادرة على السيطرة على تدفق السلطة الفلسطينية-Nic من ماصة التروية بسهولة. بشكل دوري، أوقف تدفق السلطة الفلسطينية-Nic للسماح لجزيئات الفلورسنت لنزع فتيل بعيداً. وهذا يسمح بإعادة التصوير من العصبية للتحقق من موقف بقعة من شعاع أونكاجينج. القيد الرابع محتملة أن أذكر ينطوي على استخدام 405 نانومتر الضوء للتحلل الضوئي. أطوال موجية أقصر مثل 405 نانومتر أكثر عرضه للتشتت في الأنسجة المعقدة مثل شريحة الدماغ. وهكذا، في كثافة فلاش معين والمدة، أونكاجينج استجابة ستريك وحركية تسوس قد الأثران تتأثر بعمق التركيز أونكاجينج داخل الشريحة. استنتاجات بشأن الجوانب البيولوجية nAChRs ينبغي أن تراعي هذا تحذير هام.
واستخدمت هذه التقنية فلاش التحلل الضوئي الليزر مترجمة مؤخرا للكشف عن تفاصيل جديدة حول ناشر علم الأعصاب. على سبيل المثال، يعزز التعرض المزمن النيكوتين بيريسوماتيك والدالة ناتشر الجذعية في الخلايا العصبية هابينولا الآنسي5. كما كان يستخدم للمساعدة في توضيح، للمرة الأولى، أن منطقة تيجمينتال البطني غلوتامات الخلايا العصبية تعبر عن ناتشرس الوظيفية في بيريسوماتيك ومقصورات الخلايا الجذعية6. وهناك العديد من إمكانات المستقبل يستخدم هذا الأسلوب والنهج الذي يمكن أن تطبق على أنواع العصبية الرئيسية الأخرى أن من المعروف أن ناتشرس صريحة، مثل الخلايا العصبية الهرمية القشرية31 أو إينتيرنيورونس في قشرة الدماغ32، المخطط33 ، وقرن آمون19. يمكن أيضا الجمع بين هذه التقنية الجينات الصيدلة و/أو ناتشر تحرير34 ترجمة مستقبلات محددة الأنواع الفرعية للأقسام العصبية المختلفة. هذا النهج يمكن تكييفها بسهولة للمركبات الأخرى قفص الكومارين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تلك التي وضعت بالتوازي مع السلطة الفلسطينية-Nic5. أخيرا، السلطة الفلسطينية-Nic فلاش التحلل يوم ستستخدم في حيوان مستيقظا يتصرف لدراسة العمل للنيكوتين في نماذج الرواية الصيدلة السلوكية.

إشارات اتروبين ينظم العديد من عمليات الدماغ، بما في ذلك مراقبة أتينشونال وحركة مداركه، ومكافأة1،2. المخدرات التي تعزز انتقال أستيل (ACh) تستخدم لعلاج ضعف الإدراك المرتبطة بمرض الزهايمر، مما يعني ضمناً بدور هام لأنظمة اتروبين في الإدراك3. يمكن أن يؤدي تحسين فهم المستقبلات اتروبين والدوائر في الدول السليمة والمريضة إلى أفضل النهج العلاجي للعديد من الأمراض/الاضطرابات العصبية.
مستقبلات ACh النيكوتين (ناتشرس) هي عائلة من بوابات يجند أيون قنوات تدفق الاتصالات استجابة لمنظمة العمل ضد الجوع الذاتية أو الخارجية النيكوتين من منتجات التبغ. نظراً لأنهم كانوا من بين مستقبلات الناقل العصبي جداً الأولى أن يكون وصف4، ناشر علم الصيدلة والموقع في ألياف العضلات مفهومة جيدا لمستقبلات العضلات من نوع. وفي المقابل، نسبيا لا يعرف الكثير عن علم الصيدلة وتوزيع سوبسيلولار ناتشرس الأصلية في الدماغ. وتناول هذه الفجوة في المعرفة مؤخرا وضع تحقيق كيميائية رواية التي تسمح للتنشيط السريع وتقييد مكانياً من ناتشرس في أنسجة المخ أثناء التصوير بالهاتف الخلوي وتسجيل الكهربية5. هنا، يتم وصف الخطوات المنهجية الرئيسية التي تشارك في هذا النهج، مع الهدف العام المتمثل في تعزيز القدرة على الاتصال الدالة ناشر مع هيكل الخلايا العصبية.
فوتواكتيفاتابل النيكوتين (Nic السلطة الفلسطينية؛ واسم المادة الكيميائية: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-الأمينية] الكومارين-4-يل] الميثيل-النيكوتين) يمكن أن تكون فوتوليزيد مع ~ 405 نانومتر ومضات الليزر بكفاءة الإفراج عن النيكوتين5،6. قبل أونكاجينج، مستقرة في حل السلطة الفلسطينية-Nic والمعارض أي الميزات الدوائية أو الكيميائية الضوئية غير مرغوب فيه5. بعد التحلل الضوئي، ينشط النيكوتين المفرج عنهم كما هو متوقع ناتشرس ومشتقات أونكاجينج عقاقيري الخاملة5. يتم استخدام ليزر كونتينووسوافي كمصدر الضوء التحلل الضوئي مع قوة إخراج > 1 ميغاواط تقاس في العينة. عند المترجمة، تحفيز الصورة المستهدفة هو جنبا إلى جنب مع القدرة على تحديد موقع الأغشية الخلوية مع الليزر 2-فوتون الفحص المجهري (2PLSM)، واثنين من المزايا الرئيسية لهذا النهج هي الأكمل: سرعة التحلل الضوئي والدقة المكانية.
في معظم النواحي، التحلل الضوئي للسلطة الفلسطينية-Nic متفوقة على وسائل أخرى لإيصال يغاندس ناتشر المستقبلات داخل شرائح المخ. وتشمل هذه النهج حمام التطبيق7 والمخدرات المحلية التسليم عن طريق البخاخ ماصة8. بينما النهج السابق الذي يميل إلى المبالغة التأكيد على الآثار الطويلة الأجل للعقاقير التطبيقية، يمكن أن تعاني هذا النهج الأخير من تقلب في استجابة حركية بين المحاكمات وعبر الخلايا. أيا من هذه النهج البديلة يمكن التمييز على نحو كاف مستقبلات الأنشطة في مختلف المواقع الخلوية من العصبية نفسها. الإفراج عن أوبتوجينيتيكالي المنشط لمنظمة العمل ضد الجوع وقد استخدمت للتحقيق في ناتشرس الأصلية9،،من1011، ولكن لم تثبت ذلك مفيدة لرسم خرائط مواقع ناشر سوبسيلولار. وعلاوة على ذلك، اعتمدت معظم الدراسات استخدام هذا النهج على ماوس بكتيرية صبغي اصطناعي المعدلة وراثيا معربا عن ChR2 مع انتقال اتروبين الشاذ12،،من1314، 15 , 16 , 17.
السلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي غير النهج البصرية فقط لدراسة مستقبلات اتروبين. كارباتشول محبوس كان يستخدم لتعيين وظيفيا أنشطة مستقبلات ACh في الخلايا المستزرعة18 والدماغ شرائح19، ولكن لم تكن متاحة تجارياً للدراسات المقارنة أثناء تطوير السلطة الفلسطينية-nic. أ مكررا الروثينيوم (بيبيريديني)--أبلغ النيكوتين معقدة (روبي-النيكوتين) للسماح للنيكوتين أونكاجينج20، لكن التحضيرات التجارية روبي-النيكوتين أثبتت أنها أقل شأنا من السلطة الفلسطينية-Nic في مقارنة وجها لوجه دراسة5. قد يكون من المفيد تكرار مثل هذه التجارب المقارنة غير تجاري، الغاية تنقية روبي-النيكوتين، كما يمكن استيعابه مرئية مجاملة الميزات السلطة الفلسطينية-Nic للدراسات اتروبين. وأخيراً، nAChRs قد أيضا بصريا تحريف باستخدام مزيج من يغاندس صور التحويل ومستقبلات وراثيا21. وهذا النهج مكمل للسلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي في أنسجة المخ، مع القدرة/شرط الوراثية استهداف ناشر المعدلة التي ينظر إليها على أنها ميزة وعيب.
وينبغي ملاحظة العديد من المتطلبات الأساسية لهذا النهج. أولاً، يلزم أسلوب تصور مناسب لتحديد بدقة في غشاء الخلايا العصبية. تصوير مع الفحص المجهري التقليدي برنامج التحصين الموسع-الأسفار قد تكون كافية عند دراسة الخلايا المستزرعة، ولكن لتسجيل من الخلايا العصبية في الدماغ شرائح أو أنسجة سميكة الاستعدادات الأخرى، 2PLSM أو مجهرية [كنفوكل] شرط. ثانيا، مطلوب طريقة مناسبة لوضع شعاع الليزر التحلل الضوئي. ويستخدم هذا النهج رأس المزدوج-جلفانومتر المسح الضوئي مع اثنين من المرايا المستقلة س ص للمسح الضوئي النقطية التصوير شعاع ونقطة فوتواكتيفيشن باستخدام أونكاجينج الليزر شعاع22،،من2324. حلول محدودة أخرى، أكثر من الممكن، مثل (1) رأس واحد-جلفانومتر مسح أن يمسح النقطية بدلاً من ذلك التصوير شعاع وشعاع أونكاجينج، أو (2) ببساطة توجيه الحزم أونكاجينج إلى مركز مجال الرؤية مثل أن يوجه الخلية هذا الموقف للتحلل الضوئي فلاش. ثالثا، نظام مطلوب لتسجيل الكهربية المتزامنة إذا كان أحد يرغب في جمع الإشارات الفسيولوجية أثناء التجارب. يمكن تلبية الاحتياجات المذكورة أعلاه مع تقنية تصوير ضوئية-كل مناسبة، كما وصفت ذلك مؤخرا5. ويرد أدناه، بروتوكول مفصلة تصف الخطوات الرئيسية لهذا النهج.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

أستيل (ACh) يعمل من خلال المستقبلات تعدل مجموعة متنوعة من العمليات العصبية، ولكنه قد تم تحديا لربط وظيفة مستقبلات ACh مع موقع سوبسيلولار داخل الخلايا حيث يتم تنفيذ هذه الوظيفة. لدراسة سوبسيلولار موقع مستقبلات ACh النيكوتين (ناتشرس) في أنسجة الدماغ الأصلية، وضعت أسلوب بصري للإفراج عن دقة النيكوتين في مواقع منفصلة بالقرب من أغشية الخلايا العصبية خلال التسجيلات الكهربية. فرضت التصحيح الخلايا العصبية في الدماغ شرائح مليئة بصبغ إلى تصور عن مورفولوجيا أثناء الليزر 2-فوتون الفحص المجهري، والنيكوتين أونكاجينج يتم تنفيذها مع فلاش خفيفة بتركيز شعاع ليزر نانومتر 405 قرب الأغشية الخلوية واحد أو أكثر. يتم قياس الانحرافات الحالية الخلوية، وصورة عالية الدقة ثلاثية الأبعاد (3D) من الخلايا العصبية المسجلة للسماح لمصالحة ردود ناشر مع مورفولوجيا الخلوية. يسمح هذا الأسلوب لتحليل مفصل لناشر التوزيع الوظيفي في الاستعدادات الأنسجة المعقدة، واعدة لتعزيز فهم اتروبين كبيرة.

للتحلل من التحفيز، وجرعة التعرض (كثافة والوقت)، وموقع التعرض، وهندسة شعاع المتغيرات الرئيسية. النظام المذكور في هذه المادة قادر على الحزم فوتوستيموليشن مختلفة اثنين، قابل للتعديل عن طريق تحريك عدسة في الخارج من مسار الضوء فوتوستيموليشن قبل الشعاع يدخل النظام جلفانومتر. دون هذه العدسة، يملأ شعاع فوتوستيموليشن التلميذ مدخل من 60 x/NA 1.0 المياه ينخفض [60 س WD] الهدف، المنتجة قرب من-حيود محدودة، بقعة sub-ميكرومتر في المستوى البؤري داخل العينة. وهذا يرتبط مع فوتوستيموليشن الخفيفة مع شكل الساعة الرملية، تمتد أعلى وأسفل بقعة تنسيق متماثل مع المحور البصري. مع عدسة إدراجها في المسار، تركز في التلميذ مدخل العدسة الهدف ضوء الليزر فوتوستيموليشن وثم يخرج كشعاع الشبيهة بقلم رصاص. يمتد هذا الشعاع، التي من المتوقع أن تكون ~ 10 ميكرومتر في القطر هدفا س 60، موحد/عمودياً في جميع أنحاء العينة. في هذا الوضع، سوف تكون شدة الضوء في أي مكان معين داخل بقعة التحفيز ~ 1% كثافة بقعة صغيرة قرب حيود محدودة. وهكذا، أعلى الليزر القوى مطلوبة عادة عند استخدام ~ 10 ميكرون بقعة التحفيز. جميع التجارب التي ذكرت في هذا المقال، استخدمت شعاع الساعة الرملية من نوع فوتوستيموليشن.
يمكن رسم نموذج تسليم السلطة ضد الإعداد الجهد الكهربي للإدخال، وبعد قياس قوة الليزر على العينة باستخدام مقياس طاقة. استخدام هذه الدراسات 60 × الهدف WD مع مسافة عمل من 2 مم، ولكن هو لا المغمورة في المياه لقياسات الطاقة لتجنب الأضرار المحتملة لعنصر كاشف. عندما أهداف مع سرد نا > 0.95 تقاس في الهواء (بدون غمر السائل)، ويمكن أن يكون هناك انعكاس الداخلية مجموع الخسائر في عنصر عدسة الوجه الأمامي بسبب انخفاض مؤشر (الهواء). وفي هذه الحالة، لقياس قوة عينة أكثر دقة (لتصحيح لخسائر الانعكاس الداخلي الكلي)، زيادة القوة المقاسة من 1.0 نا موضوعية (1.0/0.95)2 تقاس في الهواء. ويبين الشكل 1a مؤامرة الإدخال/الإخراج نموذجي ل 405 نانومتر و 473 مرئية نانومتر الليزر التي تدمج الليزر إطلاق النظام في هذه الدراسة. نظم الليزر هذه تعتبر مثالية لمراقبة جرعة التعرض صور-التحفيز للأسباب التالية: (1) ومحسوبة مسبقاً لتوفير إنتاج الطاقة الخطية مباشرة بالنسبة للجهد الكهربي للإدخال (0-5 الخامس)، (2) أنها توفر عملية مصراع صامت (مع لا ليزر الإخراج)، و (3) لديهم السريع، sub-مرض التصلب العصبي المتعدد كثافة نبض مدة المراقبة (0.1 مللي استجابة). عند استخدام صور--تحفيز بقعة مع نظام ليزر/galvo، معايرة روتينية من البقع ماركبوينتس مهمة أساسية. الشكل 1b (اللوحة اليمنى) يوضح نظام الخروج من المعايرة (النقطة المطلوبة لحفز صور لا يؤدي التحفيز دقيقة من هذه النقطة، كما هو مبين بالموقع حرق حفرة)، مع عودة إلى الموضع الدقيق من البقعة بعد معايرة ( الشكل 1b، اللوحة اليمنى). 
السلطة الفلسطينية-Nic الفلورسنت متواضعة (الانبعاثات ذروتها في ~ 510 نانومتر)، نستعرض الإثارة الفعالة بين 350-450 نانومتر (1-فوتون الإثارة) أو 700-900 نانومتر (2-فوتون الإثارة)5. لتصور Nic السلطة الفلسطينية أثناء التطبيق المحلي، تم تطبيق السلطة الفلسطينية-Nic (1 ملم) القرب من أنسجة المخ تليها تصوير متزامنة في سياق انتقال مقطعة الضوئية أنسجة الدماغ (1) عن طريق التباين دوت والأسفار (2) المنبعثة من الإثارة (900 نانومتر) من السلطة الفلسطينية-nic. السلطة الفلسطينية-Nic 2PE الأسفار كان يمكن كشفها بسهولة أثناء خروج الضغط من ماصة تطبيق محلي (الشكل 2a). النيكوتين ومونوالكيلكومارين، 7-كاربوكسيميثيلامينو-4-ميثيل الكومارين، هي أهم المنتجات الكيميائية الضوئية من رد فعل السلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي5. استخدام نفس إعدادات/المعلمات التي تم استخدامها للسلطة الفلسطينية-Nic التصوير التصوير، تم تصويرها الأنسجة أثناء الولادة من النيكوتين (1 مم) أو 7-كاربوكسيميثيلامينو-4-ميثيل الكومارين (1 مم). تم الكشف عن لا إشارة الفلورسنت (الشكل 2a، الألواح الوسطى والدنيا)، مما يدل على خصوصية نتائج السلطة الفلسطينية-Nic. أخيرا، تم تطبيق السلطة الفلسطينية-Nic داخل أنسجة المخ وتم تصويرها السلطة الفلسطينية-Nic fluorescence الانبعاثات (الشكل 2). هذا النهج يؤكد أن السلطة الفلسطينية-Nic الحالي داخل 100-200 ميكرون من ماصة التطبيق المحلي. وتؤكد هذه البيانات معا، أن فعالية يتم تسليم السلطة الفلسطينية-Nic لانسجة الدماغ عن طريق التطبيق المحلي.
التسجيلات الكهربية مع 2PLSM المتزامن للتصور الهياكل الخلوية يتطلب المحقق لاعتبارات التوازن لكل من مكونات التجربة، وكثيراً ما يتوفر إطار زمني ضيق (~ 20 دقيقة) لصالح نموذج الحصول على البيانات من خلية مصححة. دون النظر في التصور الخلوية، أفضل ممارسة لبدء تسجيل وقت ممكن بعد اقتحام لتسجيل استقرار يميل إلى الانخفاض مع مرور الوقت. بيد عند تصوير شرطا، يجب على اعتبارات الكهربية إتاحة وقت كاف لزيادة تركيز fluorescence في الهياكل الصغيرة/البعيد. ويتمثل ذلك بدراسة تركيز صبغ ملء منحنى28، التي في بعض الأحيان مفيدة لاشتقاق عند التصوير نوع خلية جديدة. ويبين الشكل 3 العديد من الخلايا العصبية مثال تصويرها مداخن Z عن طريق 2PLSM وانهارت في إسقاط أقصى شدتها لأغراض العرض. ويبين الشكل 3 ألف صور عالية الجودة حيث مورفولوجيا الخلايا العصبية ويبدو أن تكون كاملة وهو التقليل من الضوضاء، والحطام لا تتعارض مع التفسير مورفولوجيا الخلوية. ويبين الشكل 3b صور ذات جودة أقل، نظراً لأدنى إشارة إلى خلفية نسبة والحطام كبيرة. غالباً ما يظهر هذا الحطام جيوب كروية من الأسفار مكثفة، الناشئة عن قذف من التصوير صبغ من ماصة التصحيح أثناء اقتراب الخلية. جدير بالذكر أن إدراج 100 ميكرومتر السلطة الفلسطينية-Nic في الحمام (عند تنفيذ تطبيق حمام) يميل إلى خفض نسبة الإشارة إلى الخلفية ويؤدي إلى تباين الصورة دون المستوى الأمثل. 568 فلور أليكسا أو 594 غالباً مفيدة جداً في تجارب التطبيق المحلي كصبغة باحث أو إشارة مرجعية/تطبيع 2PE تطبيع. هو الطول موجي فعالة للإثارة فوتون اثنين من هذه الأصباغ ~ 780 نانومتر27، الذي يسمح بتصور المتزامن للسلطة الفلسطينية-Nic وتحديد المكونات الخلوية. هذا الطول الموجي، ومع ذلك، لا تماما تجنب التحلل الثاني-فوتون للسلطة الفلسطينية-Nic5. 488 فلور أليكسا مفيد في السلطة الفلسطينية-Nic حمام-تطبيق التجارب؛ عندما متحمس مع شمال البحر الأبيض المتوسط إيه ناين زيرو زيرو مناسبة للطول موجي، يمكن تجنب التحلل الثاني-فوتون للسلطة الفلسطينية-Nic5 مع الحفاظ على التصور مناسبة من مقصورات الهاتف الخلوي.
ويبين الشكل 4 بيانات المثال لليزر السلطة الفلسطينية-Nic المترجمة فلاش التحلل الضوئي في الخلايا العصبية محب شرائح المخ. الشكل 4a (لوحات العلوي) يظهر مثال لصورة "مرجع"، وهو القبض على شاشة من الصورة 2PLSM الماضي اتخذت قبل تشغيل بروتوكول ماركبوينتس ، مضافين مع موقع صور--تحفيز بقعة. الشكل 4a (لوحات الصورة السفلي) يوضح طريقة عرض zoomed من الصور--التحفيز بقعة مضافين في مورفولوجيا الخلوية. ويرد الاستجابة الكهربية يرتبط الوقت المطابق للتحلل الضوئي Nic السلطة الفلسطينية في الألواح السفلي من الشكل 4a. الأعمال السابقة أظهرت أن هذه التيارات حساسة لناشر الخصوم5. يبين الشكل 4 باء بيانات تمثيلية من خلايا مختلفة حيث أجرى التحلل الضوئي بقعة واحدة في فاصل زمني أما 1 s أو 10 س. بينما يسمح فاصل s 10 وقت الاسترداد كاف لخط الأساس عقد الحالي، فاصل s 1 أقصر أدت إلى الزيادة التدريجية في عقد الحالي كما شرع البروتوكول. المتزايدة الحالية تشير إلى أن النيكوتين لم يكن ما يكفي من الوقت لنزع فتيل بعيداً عن النظام مع الفاصل الزمني 1 هرتز29. إجراء مثل هذه الاستجابة الزمنية يجب أن تكون تحليلات حيثياته على أي نوع خلية جديدة قيد الدراسة، كما قد تختلف الأعصاب ناتشرس بين أنواع الخلايا.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> رقم 1: معايرة الليزر فوتوستيموليشن- () صور--تحفيز الليزر إنتاج الطاقة. السلطة على الطائرة عينة (عن طريق علامة x 60/1.0 نا غمس المياه الهدف) تم قياس ل 405 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 473 صور--تحفيز الليزر في تحديد المخرجات المشار إليها. (ب) صور--تحفيز الليزر المعايرة. شاشة التقاط صور تظهر العلاقة المكانية بين بقعة التحفيز الصورة المقصودة وموقع المقابلة التي وقع فيها صور-التحفيز (حرق حفرة) قبل (يسار) وبعد معايرة قيد التشغيل (على اليمين) في ماركبوينتس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> رقم 2: التطبيق المحلي السلطة الفلسطينية-Nic. () "الكشف عن" السلطة الفلسطينية-Nic من محلي ماصة التطبيق. 1 ملم السلطة الفلسطينية-Nic ثانوي التحلل الضوئي أو النيكوتين كانت حله في قام تحميلها في ماصة تطبيق محلي والاستغناء على أنسجة المخ أثناء 2PLSM (900 نانومتر الإثارة) التصوير باستخدام نفس إعدادات التصوير لكل دواء. ليزر المسح دوت التباين انتقال الصورة يظهر الأنسجة/الماصة بينما تم استخدامه كاثود جاسب PMT لالتقاط الانبعاثات الأسفار. (ب) السلطة الفلسطينية-Nic (1 ملم) perfused في أنسجة المخ وتصويرها عن طريق 2PLSM كما هو الحال في () لإظهار انتشار الأفقي للسلطة الفلسطينية-Nic الأسفار مضمن باستخدام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> الشكل 3: اقتناء الليزر 2-فوتون مسح الصور مجهرية. () Z 2PLSM الأمثل-المداخن. 2PLSM Z-المكدس أقصى شدتها الإسقاطات مثالان هو مبين للخلايا العصبية محب مع dendrites حل جيد والقليل من الحطام لا التدخل. (ب) دون المستوى الأمثل 2PLSM Z-مكدسات. يتم عرض مثالين 2PLSM Z-المكدس أقصى شدتها إسقاطات لمحب الخلايا العصبية محاطة بالحطام (صبغ طردوا من الماصة أثناء نهج الخلية). هذه الصور أكثر صعوبة تفسير الصور مثل تلك المبينة في (). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> الشكل 4: الليزر فلاش التحلل من السلطة الفلسطينية-nic. () المرجع ماركبوينتس الصور والتيارات إلى الداخل أثارت من قبل السلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي. لواحد محب العصبية، تظهر الصور مرجع الخام ماركبوينتس صور--تحفيز المحاكمات في مكان واحد خلوية (المشار إليها). لاحظ أن لبعض مواقع الصور-التحفيز (الصورة أقصى اليمين في هذه السلسلة)، هيكل الجذعية في التركيز، لكن ليست سوما وتغصن الدانية. أسفل كل صورة مرجع، يتم رسم الحالي النيكوتين إلى الداخل أونكاجينج--أثارت. (ب) الحوافز بين الفواصل الزمنية للسلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي. تظهر تسجيلات أنموذج للخلايا العصبية مهب النيكوتين فيها أونكاجيد مرارا وتكرارا في نفس المكان بيريسوماتيك مع فاصل زمني بين تحفيز 1 s أو 10 س. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات النيكوتين أستيل (ناتشرس) في الماوس شرائح الدماغ بالنيكوتين أونكاجينج. أونكاجينج النيكوتين عندما يقترن مع تسجيل التصحيح المتزامن المشبك والليزر 2-فوتون الفحص المجهري، يربط وظيفة مستقبلات النيكوتين مع مورفولوجيا الخلوية، توفير فهم أعمق لعلم الأعصاب اتروبين.

التدقيق وظيفة مستقبلات النيكوتين أستيل شرائح المخ الماوس عن طريق التحلل الضوئي فلاش الليزر النيكوتين فوتواكتيفاتابل

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

هذه التقنية رافض متعددة الفوتون بالليزر المسح المجهري بالتزامن مع الليزر فلاش التحليل الضوئي لجزيء النيكوتين القابل للتكشط الضوئي. السماح بالتنشيط الدقيق لمستقبلات الكولينينية النيكوتينية. هذه التقنية تسمح لغرامة ملعقة الزمانية السيطرة على تطبيق مستقبلات النيكوتين ناهض، وتوفير أداة قوية لدراسة أنماط التعبير الوظيفي مستقبلات ونقل cholinergic متشابك أو حجم.قبل البدء في الإجراء، استخدم مُجرّد ماصة قابل للبرمجة لسحب ميكروبيبت زجاجي بقطر فتحة 20 إلى 40 ميكرومتر. سلالة ما يقرب من ملليلتر من تسجيل الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون. وإعادة تعليق ما يكفي من النيكوتين المُنشط ضوئيًا في محلول التسجيل المصفى ليسفر عن تركيز نهائي بمليمولار اثنين.قم بملء التطبيق المحلي المسحوب micropipette مع 50 ميكرولترات من الدواء القابل للانكامل الضوئية ، وتأمين الماصات في حامل ماصة محمولة على ميكرومانيبولاتور. قم بتوصيل حامل الماصات عبر طول مناسب من الأنابيب إلى نظام طرد الضغط القادر على تطبيق الضغط المنخفض المستمر. واستخدام micromanipulator للمناورة ماصة التطبيق المحلي في حل تسجيل خارج الخلية.ضع طرف الماصات قليلاً فوق عينة أنسجة دماغ الماوس، أي ما يقرب من 50 ميكرومتر من الخلية التي تهمك. وطبق لفترة وجيزة جنيه إلى جنيهين لكل بوصة مربعة من الضغط على الماصة. وينبغي أن يكون هناك حد أدنى من أي تشريد للخلية ذات الاهتمام.بعد تحقيق ثابت كامل الخلية المشبك التصحيح، بدوره على التطبيق المنخفض على جهاز طرد الضغط، وتشبع الأنسجة المحيطة بالخلية مع النيكوتين photoactivatable لمدة دقيقة إلى دقيقتين. التطبيق المحلي يقدم تعقيد إضافية إلى التجربة. لكنه يجنب المركب ويسمح باستخدام تركيزات أعلى من PA-Nic.لتطبيق حمام النيكوتين القابل للتكشط الضوئي ، قم أولاً بحل ما يكفي من الدواء المتحلل في حجم من محلول التسجيل المناسب لإعادة تدوير مستمر إلى تركيز نهائي 100 ميكرومولار. وتحميل الخليط الناتج في نظام التسريب. ثم تبدأ إعادة تدوير محلول النيكوتين القابل للتكشط الضوئي بمعدل 1.5 إلى 2 ملليمتر في الدقيقة ، باستخدام أنابيب مع الحد الأدنى من القطر الداخلي وطول العام لتقليل حجم إعادة تدوير المطلوبة.أثناء إعادة تدوير, فقاعة باستمرار الحل مع كاربوجين, والحفاظ على درجة حرارة الحمام في 32 درجة مئوية في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة. تطبيق حمام يستفيد من بساطة والتوحيد من السلطة الفلسطينية-Nic تغلغل الأنسجة. لكنه يستخدم بالضرورة أقل تركيزات الطاقة الدقيقة PA-Nic، وينفق كميات أعلى من إجمالي المركب.للتصور الحي لخليوة هابينولا المتوسطة، واستخدام الضوء المنقولة أو الأشعة تحت الحمراء التفاضلية النقيض البصريات وكاميرا الفيديو لإنشاء مستقرة، كامل الخلية تسجيل المشبك التصحيح. بعد إنشاء التكوين المرفق بالخلايا عالي المقاومة، ولكن قبل الاقتحام، قم بتبديل الإعداد والبرامج إلى وضع المسح الضوئي بالليزر. بعد اقتحام، واستخدام الليزر المسح للتحقق من أن صبغة التصوير من الفائدة هو ملء سلبي الخلايا العصبية عن طريق الانتشار.السماح للصبغة لملء المقصورات الخلوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة على الأقل قبل استخدام وظيفة المسح الحي لتصور الخلايا العصبية والمقصورة دون الخلوية من الفائدة. حدد معلمات التصوير التي تسمح بالتصور المباشر الدقيق للميزات العصبية، ومعالجة الإعدادات المناسبة للتأثير على أو تغيير عرض التصور، القرار، نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووقت الحصول على إطار الصورة حسب الضرورة. لتحسين تباين الإشارة، افتح نافذة جدول البحث وضبط إعدادات الجدول والسقف.لتحديد منطقة ذات أهمية داخل النسيج، حدد التكبير البصري 1X واستخدم عناصر التحكم بالغسل. استخدم أداة السلسلة Z لتحديد موضع بدء وإيقاف يحتوي على خلية الاهتمام. قم بتعيين حجم خطوة من ميكرومتر واحد، وحدد حجم صورة التي سوف تعطي صورة ذات دقة عالية.غالباً 1، 024 في 1، 024 بكسل لكل خط. ثم صورة متتالية للخلايا العصبية في كل طائرة Z التي تحتوي على الخلية. لمعايرة تحفيز الليزر، ابدأ مسح النظام باستخدام طاقة ليزر تصوير أكبر من الحد الأدنى، وصقل التركيز الموضوعي على طبقة الفلورية ذات العلامة الحمراء الرقيقة.حدد منطقة داخل حقل الفلوريسنس واضحة من الحطام ومغلفة بالتساوي مع علامة، وفتح الأدوات والمعايرة وقائمة المحاذاة لتحديد وظيفة galvocalibration غير مُجَرَّد. اتبع البرنامج التعليمي البقع حرق للمعايرة المكانية للزوج مرآة galvanometer الثاني، واختيار الليزر 405 نانومتر، وقوة تحفيز الليزر من 400، وفترة التحفيز من 20 مللي ثانية. لتُسفر عن ثقوب قطرها 1-5 ميكرومتر في العلامة الحمراء.حدد التحديث لتحفيز الصورة وتحديثها بعد حرق النقطة المركزية، ثم نقل مؤشر أحمر مستدير إلى الموقع الفعلي للبقعة في الوسط، واليمين، والأدنى مركز للحصول على شبكة من تسعة بقع. لاختبار المعايرة، افتح نافذة نقاط العلامة و تنشيط معلمات التحفيز للبقع المحددة يدويًا في منطقة جديدة من العينة، مع الحرص على تحميل أحدث ملف معايرة صحيح في نافذة نقاط العلامة. ثم قم بتطبيق نبض اختبار للتحقق من المعايرة الصحيحة.للصورة لفترة وجيزة وتحديد موقع منطقة دون الخلية من الفائدة، حدد المسح الحية واستخدام زيادة التكبير البصري لتصور أي هياكل صغيرة حسب الضرورة. ضع علامة نقطة واحدة نقطة التقاطع المتاخمة مباشرة لغشاء الخلية، وتعيين المعلمات phototimulation إلى واحد إلى 50 مللي ثانية مدة، وقوة ليزر واحد إلى أربعة ملليوات، وعلى الأقل محاكمة واحدة. ثم حدد تشغيل نقاط علامة لبدء بروتوكول نقاط العلامة، ومراقبة الحصول على البيانات الكهربائية فيزيولوجيا في الوقت الحقيقي.يتم الكشف بسهولة عن النيكوتين القابل للتكف عن 2PE من واحد ملليمتر PA-Nic أثناء طرد الضغط من ماصة التطبيق المحلية كما هو موضح. في حين أن تسليم المنتجات الكيميائية الضوئية الرئيسية من تفاعل التحليل الضوئي النيكوتين قابلة للتنفيس لا تولد أي إشارة الفلورسنت في نفس التركيز وقوة الإثارة والطول الموجي. إظهار خصوصية نتائج النيكوتين القابلة للتكد ٍيت.التصوير من النيكوتين القابل للتكرار الضوئية تطبيقها على أنسجة الدماغ كما هو موضح يكشف عن وجود المخدرات داخل 100 إلى 200 ميكرومتر من ماصات التطبيق المحلي. تأكيد أن النيكوتين القابل للتكشط الضوئي يمكن أن يتم تسليمه بفعالية إلى أنسجة الدماغ عن طريق التطبيق المحلي. هنا ، تظهر صور عالية الجودة التي يبدو أن مورفولوجيا الخلايا العصبية كاملة ، يتم تقليل الضوضاء ، والحطام لا تتداخل مع تفسير مورفولوجيا الخلوية.غير أن هذه الصور ذات نوعية أقل. نظرا لانخفاض نسبة الإشارة إلى الخلفية وإلى وجود حطام كبير. إقران 2 فوتون الليزر المسح المجهري من الخلايا العصبية هابينولا المتوسطة في شرائح الدماغ مع الليزر فلاش التحليل الضوئي من السلطة الفلسطينية كما هو مبين، ويسمح للتوفيق بين الاستجابات الكهربائية الفيزيولوجية مع مورفولوجيا الخلوية.يسمح التحليل الضوئي البؤري الأحادي الذي يتم تنفيذه على فترات زمنية مدتها 10 ثوانٍ بوقت كافٍ للتعافي بالنسبة للتيار الذي يحمل خط الأساس. بينما يؤدي الفاصل الزمني أقصر ثانية واحدة إلى زيادة تدريجية في الحالي عقد كما يمضي البروتوكول. مما يشير إلى أن النيكوتين ليس لديه ما يكفي من الوقت لنشر بعيدا عن النظام مع فترات أقصر.عند تصميم التجارب التي تستخدم الجزيئات القابلة للتنيف الضوئي، من المهم أن تتذكر أن تختار مؤشرات الفلورسنت وأن تبلغ الفلوروفوريس مع أطياف انبعاث الإثارة المتوافقة. PA-Nic متوافق مع الفلوروفهورات الأكثر شيوعا بسبب ذروتها قصيرة الطول الموجي للتحلل الضوئي. عند اختيار أنسب PA-Nic تقنية التطبيق، من المهم أن تنظر بعناية في التعبير الوظيفي، والنشاط الفسيولوجي لمستقبلات النيكوتين في الخلايا العصبية من الفائدة.استخدام المهرة من هذه التقنية يسمح للسيطرة الدقيقة ملعقة الزمانية من تطبيق النيكوتين، والتي تمكن من إمكانيات جديدة مثيرة لدراسة حركية المشاركة مستقبلات النيكوتين الأصلية، والتعريب دون الخلوية، وتعديل النشاط العصبي من قبل تنشيط مستقبلات النيكوتين.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

متحد البؤر التصوير الطيفي من المستقبلات النيكوتينية الموسومة Fluorescently في نوك في الفئران مع الإدارة النيكوتين المزمن

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

تطبيق أدوية المحلية لدراسة وظيفة مستقبلات أستيل النيكوتينيك في شرائح مخ الفأر

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

دراسة وظيفة المخ في الأطفال باستخدام ماجنيتونسيفالوجرافي

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

غرس المزمن من الصفيف اليكتروكورتيكوجرافيك الجامعة القشرية في مرموز المشتركة

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...