عندما يتم تعديل وظيفة بروتين معين عن طريق التلاعب الجيني، يعتبر التنسيق بين الفشل المهيج وضعف تشغيل المحرك شرطا ضروريا للعلاقة السببية بين المحدودة والتعلم الحركي. هنا نبرهن على استخدام بروتوكولات متعددة لتقييم LTD التي يمكن أن تكون مستحثة عن طريق آليات تعويضية في الحيوانات التي يتم التلاعب بها الجينات. قبل حصاد الدماغ، والبرد والأوكسجين اثنين من القارص 50 ملليلتر من ACSF على الجليد.
عندما تصل درجة حرارة الحل إلى أقل من أربع درجات مئوية ، أضف 50 ميكرولترات من مادة tetrodotoxin المليمترية إلى أحد اقواد الجليد الباردة. لحصاد الدماغ، أمسك الرأس واستخدم مقص العيون لقطع الجلد السطحي على طول خط الوسط. سحب الجلد يدويا لفضح على نطاق واسع سطح الجمجمة واستخدام مقص لقطع على طول الجمجمة أفقيا من ثقب spinocerebellar الرئيسية إلى ما هو فوق العينين والأذنين قبل قطع الجمجمة على طول خط فوق كلتا العينين.
استخدم مشرطًا لقطع الدماغ في منتصف المخ وعزل الجزء السدي من الدماغ ، بما في ذلك المخيخ ، من الجمجمة. غمر العينة في القارس الباردة الجليد من ACSF وضبط أنابيب فقاعة بحيث لا يحرك كتلة الدماغ في منقار. بعد سبع دقائق على الأقل، استخدم ملعقة لالتقاط كتلة الدماغ واستخدام قطعة من ورقة التصفية لامتصاص أي ACSF الزائدة.
جبل الجانب البطني الأنسجة أسفل على اثنين من قطعة سنتيمتر من أجار مع لاصقة طبية مناسبة. استخدام شفرة لقطع نصف الكرة الأيمن من أنسجة الدماغ بالتوازي مع الطائرة التشعب من خلايا بوركينجي ممكن. قطع وإزالة الجانب الآخر من نصف الكرة الأرضية وقطع الدماغ بين colliculi متفوقة وأدنى.
قطع الحبل الشوكي والغراء الجانب الأيمن من المخيخ المشذب مع كتلة أجار على علبة العينة قبل المبردة. ثم، إمالة علبة العينة، صب ACSF على العينة لإصلاح الأنسجة وجرف أي الغراء الزائد. لشريحة عينة الدماغ، وتوجيه العينة بحيث الجانب الظهري من المخيخ في الجبهة وصب ما يكفي من الجليد الباردة قطع ACSF تكمل مع tetrodotoxin لتغمر تماما المخيخ.
ضع أنبوب غاز في محلول القطع وابدأ الفقاعات بخليط غاز ثاني أكسيد الكربون الأكسجين. باستخدام ملاقط غرامة والمكبرات، وإزالة ماطر العنكبوتية واستئصال الدونة cerebellar. بعد إزالة جذع الدماغ وكتلة أجار، تدوير علبة 180 درجة بحيث السطح الظهري من المخيخ يواجه شفرة الحلاقة من هزاز وضبط موقع القطع الأول.
تعيين السعة هزومي إلى 5.5 والتردد إلى 85 هيرتز، والسرعة إلى ثلاثة إلى أربعة، وسمك شريحة إلى 300 ميكرومتر. كما يتم الحصول على شرائح cerebellar، واستخدام شبكة النايلون لنقل المقاطع إلى حاضنة الاكريليك في حمام الماء 26 درجة مئوية وتزج تماما العينات في ACSF أكسجين الطازجة لمدة ساعة واحدة على الأقل. لخلية كاملة التصحيح الإبلاغ المشبك، حل واحد picrotoxin micromolar في ACSF عن طريق ultasonication لمدة ثلاث دقائق قبل استنشاق غرفة تسجيل 30 درجة مئوية مع حل السم في ملليلتر اثنين في الدقيقة معدل التدفق.
بعد بضع دقائق، نقل شريحة cerebellar إلى غرفة تسجيل وإصلاح الأنسجة مع الوزن البلاتيني وخيوط النايلون. ثم املأ قطب كهربائي محفز بـ ACSF الطازجة. لتحفيز الألياف المتوازية، ضع القطب المحفز على سطح الطبقة الجزيئية حوالي 50 ميكرومتر من طبقة خلايا بوركينجي.
لتحفيز الألياف التسلق، وضع القطب المحفز في الجزء السفلي من طبقة الخلية Purkinje واستخدام microloader لملء القطب تسجيل مع ثمانية ميكرولترات من 0.45 ميكرومتر تصفية البوتاسيوم أو محلول داخلي cesium القائمة. تطبيق ضغط إيجابي ضعيف على القطب تسجيل قبل غمر القطب في ACSF. وينبغي أن تكون مقاومة القطب الكهربائي 2-4 megaohms وينبغي تصحيح إمكانات تقاطع السائل.
الاقتراب من الجسم خلية مشرقة صحية من خلية Purkinje مع القطب تسجيل ودفع سطح الخلية Purkinje قليلا. ثم التوقف عن تطبيق الضغط الإيجابي وتطبيق الضغط السلبي حتى يتم تشكيل ختم gigaohm. ثم استخدام الضغط السلبي لإنشاء تكوين الخلية كاملة، والحفاظ على إمكانات الغشاء في ناقص 70 millivolts وتطبيق نبضات ناقص ميليفولت 100 ميلي ثانية في 0.1 هرتز، والرصد المستمر للمقاومة المدخلات، ومقاومة السلسلة، وسعة الإدخال.
بالنسبة للحث على الاكتئاب على المدى الطويل ، تحفيز الطبقة الجزيئية مع نبض 0.1 مللي ثانية وتطبيق حافز نبض مزدوج لتحديد التيارات الليفية المتوازية بعد التشابك. وينبغي ملاحظة تيسير النبض المقترن والزيادة التدريجية في السعة بالنسبة للزيادة في كثافة التحفيز. لتسجيل استجابة الاختبار، قم بتطبيق نبض هرتز واحد 0.1 وضبط شدة التحفيز بحيث تكون السعة المُثارة حوالي 200 بيكوamps.
تحفيز التسلق الألياف في الجزء السفلي من طبقة الخلية Purkinje وتحديد الألياف المتوازية ما بعد متشابك التيارات التي أثارها التسلق الألياف التنشيط، وتطبيق التحفيز نبض مزدوج. وينبغي ملاحظة الاكتئاب نبض الاقتران بطريقة كل أو لا شيء في العلاقة مع زيادة في كثافة التحفيز. في هذه التجربة التمثيلية، تم استخدام الاقتران مع تحفيز واحد من الألياف الموازية وتحفيز واحد من الألياف التسلقية في ظل ظروف المشبك الحالية لإعداد الشريحة.
شكل ارتفاع معقدة التي أثارها التحفيز الملتحمة كانت مماثلة لتلك التي أثارها تحفيز الألياف التسلق وحدها مع أول spikelet حاد تليها اثنين إلى ثلاثة spikelets. لوحظ ارتفاع معقد على شكل مماثل عندما تم اتباع تحفيز واحد الألياف الموازية 50 مللي ثانية في وقت لاحق من قبل موازية ثانية متشنجة وتسلق تحفيز الألياف. في هذا الاختبار في ظل ظروف الجهد باستخدام محلول داخلي قائم على cesium ، تم اتباع تحفيز الألياف المتوازية 50 مللي ثانية في وقت لاحق من خلال تطبيق مصاحب لتحفيز الألياف الموازية الثانية وفك القطب الجسدي.
وقد استُثير تيار داخلي عند إزالة التلوث الجسدي من ناقص 70 إلى صفر ميليفولت، كما استُحضر تيار الذيل بعد إعادة الأقطاب. وأخيرا، أعطيت خمسة المحفزات الألياف المتوازية في 100 هيرتز في وقت واحد مع إزالة القطب الجسدية في ظل ظروف الجهد المشبك. مرة أخرى، تم استثارة جيل متكرر من التيارات الداخلية أثناء إزالة القطب والتيار الذيل تم تحريضه بعد إعادة استقطابها.
لتقييم العلاقة بين cerebellar LTD والتعلم الحركي في الحيوانات التي يتم التلاعب بها الجينات ، وينبغي استخدام بروتوكولات متعددة للحث LTD في ظل ظروف فسيولوجية مريحة. إذا تم تصور cerebellar LTD في الحيوانات التي يتم التلاعب بها الجينات بعد التعلم الحركي ، يمكن فحص العلاقة السببية بينهما بشكل مباشر.
