I complessi peptidici MHC non stimolati non attivano le cellule T ma possono migliorare le risposte delle cellule T al peptide agonista MHC. Questo protocollo descrive un sistema sperimentale per studiare il co-agonismo durante l'attivazione umana delle cellule T CD8. Esprimiamo le molecole di MHC come complessi a catena singola con catena pesante legata covalentemente, beta-2-microglobulina e peptide.
Ciò consente di introdurre mutazioni nelle molecole di MHC che presentano peptidi predeterminati. Questo protocollo utilizza un clone ctn umano, uno specifico per un epitopo del virus dell'epatite B. Comprendere il meccanismo del co-agonismo durante le risposte delle cellule T contro l'epatite può contribuire allo sviluppo di immunotropi contro questa infezione virale.
I metodi presentati possono essere utilizzati nella ricerca e in altri aspetti fondamentali dell'attivazione delle cellule T nei sistemi cellulari T umani con nota specificità peptidica MHC. Questo protocollo utilizza molecole umane MHC a catena singola di classe I, costituite da sequenza del segnale, peptide di interesse, linker, collegamento umano beta-2-microglobulina e catena pesante MHC. Il peptide E1A3 dell'epatite B è usato come peptide agonista.
Il bavaglio dell'HIV è usato come peptide non stimolante. Le molecole umane MHC a catena singola sono espresse in una linea cellulare di criceto contenente repressore di tetraciclina. L'MHC a catena singola agonista è espresso utilizzando plasmide tetraciclina-inducibile, con conseguente livelli di espressione molto bassi in assenza di tetraciclina e alti livelli di espressione in presenza di tetraciclina.
Le cellule CHO che esprimono bassi livelli di peptide agonista MHC sono trasfette con peptide non stimolante MHC espresso in modo costitutivo. L'uso di questo sistema sperimentale consente di confrontare le risposte delle cellule T al peptide agonista MHC in presenza o assenza di peptide non stimolante MHC. Per iniziare questa procedura, coltivare le cellule CHO in un pallone T-75, come delineato nel protocollo di testo.
Il giorno prima dell'esperimento di attivazione delle cellule T, lavare le cellule nel pallone con PBS. Aggiungere una soluzione contenente il 05% di tripside e il 2%EDTA in PBS e incubare per cinque o dieci minuti a temperatura ambiente. Utilizzando un microscopio a luce, osservare le cellule per assicurarsi che si siano staccate.
Quindi aggiungere F12 completo al pallone per interrompere la tripsinizzazione. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare a 400G per cinque minuti e rimuovere il supernatante pipettando o decantando.
Sospendere di nuovo il pellet cellulare in cinque millilitri di F12 completo. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare a 200.000 cellule per millilitro in CF12. Aggiungere da 50 a 60 nanogrammi per millilitro di tetraciclina ai campioni solo agonisti per indurre elevate quantità di espressione agonista di pMHC di classe I come controllo positivo.
Successivamente, mescolare le celle CHO mediante vortice o pipettazione. Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare ad ogni pozza di una piastra a U-bottom da 96 po'. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
Il giorno prima dell'esperimento, centrifugare le cellule CTLS a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e sospenderle di nuovo a una densità di un milione di cellule per millilitro in mezzi cellulari T umani completi senza citochine o PHA. Incubare i CTC durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Il giorno dopo, centrifuga le cellule T a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 2 millilitri di supporti completi senza siero. Usa un emocitometro per contare le cellule T e regolarne la densità a un milione di cellule vive per millilitro in mezzi cellulari T umani completi.
Aggiungere anticorpo CD107a anti-umano a una diluizione da uno a 100 e Brefeldin A con una diluizione da uno a 1000. Quindi, recuperare la piastra da 96 elementi contenente le celle CHO. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, aspirare il supporto dalle celle CHO.
Aggiungere 200 microlitri della sospensione a celle T ad ogni pozzo. Co-coltura delle cellule T con cellule CHO a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per tre o quattro ore. Alla fine della co-coltura, centrifuga la piastra di 96 pozzi a 400 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Rimuovere il supernatante aspirando o sfogliando. Aggiungere quindi 2,5 microlitri di anticorpi CD3 e 2,5 microlitri di anticorpi CD8 in 50 microlitri del 5%BSA in PBS a ciascun pozzo, per la colorazione dell'antigene della superficie cellulare e mescolare mediante pipettazione. Incubare i campioni al buio e sul ghiaccio per 30 minuti.
Successivamente, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio ad ogni pozzo per lavare i campioni. Centrifugare i campioni a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il supernatante aspirando o sfogliando.
Impostare un kit di fissaggio/permeabilizzazione e aggiungere 100 microlitri di soluzione di fissaggio/permeabilizzazione ad ogni pozzo e pipetta da mescolare. Incubare sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi, centrifugare la piastra a 400 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante e aggiungere 200 microlitri di 1X perm/tampone di lavaggio ad ogni pozzo. Ripetere questo processo dalla centrifugazione aggiungendo una volta il buffer perm/wash. Successivamente, sospendere di nuovo le cellule in 50 microlitri di tampone perm/lavaggio contenente anti-interferone-gamma ad una concentrazione di 3 microgrammi per millilitro.
Incubare sul ghiaccio al buio per 30 minuti. Aggiungere quindi 150 microlitri di 1X per m/tampone di lavaggio. Centrifuga a 400G, quattro gradi Celsius, per cinque minuti.
Rimuovere il supernatante e aggiungere 200 microlitri di 1X perm/tampone di lavaggio. Centrifugare nuovamente la piastra a 400 volte G, quattro gradi Celsius, per cinque minuti, e rimuovere il supernatante aspirando o sfarfallando. Sospendere di nuovo il campione in 200 microlitri di tampone di lavaggio e procedere con l'analisi citometrica.
Un giorno prima dell'esperimento, mescolare le cellule CHO con vortici o pipettaggio. Quindi aggiungere un millilitro della sospensione cellulare a ogni pozzo di una piastra da 12 pozzetto. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
Il giorno dell'esperimento, utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule CHO dal fondo di ogni pozzo. Trasferire l'un millilitro di supporto contenente le celle da ogni pozzo ai tubi FACS. Centrifuga a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Sospendere di nuovo in 100 microlitri di anticorpi anti-HLA diluiti nel tampone di lavaggio. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio a ciascun campione CHO.
Centrifugare a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti, e scartare il supernatante. Sospendere di nuovo ogni campione in 3 millilitri di tampone di lavaggio e procedere all'analisi della citometria a flusso. In questo studio, viene presentato uno strumento robusto per lo studio dell'interazione molecolare durante l'attivazione positiva delle cellule T CD8 umane.
Viene generato un sistema xenogenico ingegnerizzato che presenta bassi livelli di pMHC agonista in presenza o assenza di pMHC co-agonista. Questi APC ingegnerizzati vengono quindi utilizzati per stimolare un clone di cellule T positivo cd8 umano specifico per E183. Le cellule CHO non trasfette e le cellule CHO che esprimono il complesso Gag-MHC a catena singola non stimolatore non inducono l'attivazione.
L'espressione di alti livelli del complesso a catena singola agonista E183-MHC, che è il controllo positivo, è vista per indurre una produzione interferone-gamma molto efficiente e la degranulazione, dimostrando che il costrutto E183 a catena singola può essere riconosciuto da uno specifico TCR per attivare le funzioni dell'effettore cellulare T. L'espressione di bassi livelli di complesso A catena singola E183-MHC induce livelli inferiori di produzione e degranulazione interferone-gamma, che è stata migliorata dalla presenza di un complesso Gag-MHC non stimolante. Si noti che percentuali molto elevate di cellule CD107a+T sono osservate anche in risposta a bassi livelli di pMHC antigenico, che è coerente con studi precedenti.
Tuttavia, la presenza di un complesso Gag-MHC non stimolante aumenta cd107a MFI. Durante questa procedura, è fondamentale controllare l'espressione MHC peptidica agonista per garantire una presentazione agonista uguale con o senza peptide non stimolante. È fondamentale quantificare l'espressione di MHC peptidico agonista usando anticorpi simili a TCR in ogni esperimento.
Un approccio alternativo è quello di utilizzare bistrati lipidici supportati, o perline, presentando una quantità fissa di peptide agonista MHC in presenza di peptide non stimolante MHC. Tali sistemi sperimentali dovrebbero consentire il test di più sequenze peptidiche non stimolative per il co-agonismo. La tecnologia MHC a catena singola può essere utilizzata per studiare le interazioni molecolari nell'attivazione delle cellule CD4 T, così come per studiare molecole MHC non classiche.
Questo protocollo utilizza sangue umano e cellule umane. Seguire tutte le precauzioni necessarie quando si lavora con il sangue umano per ridurre il rischio di trasmissione di malattie ematiche.
