Name: long-term sensory conflict in freely behaving mice
Uploaded: 2019-02-20T13:00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice at JoVE.com

Agradecemos Patrice Jegouzo los dispositivos principales y nombre desarrollo y producción. También agradecemos a P. Calvo, A. Mialot y Idoux E. por su ayuda en el desarrollo de las versiones anteriores del dispositivo y el protocolo VVM.
Este trabajo fue financiado por el Centre Nacional des Etudes Spatiales, el CNRS y la Universidad París Descartes. J. C. y M. B. reciben apoyo de la ANR-13-CESA-0005-02 francés. F. F. B. y M. B. reciben apoyo de la ANR-15-CE32-0007 francés.

Animales todos los procedimientos siguieron las regulaciones animales de la Universidad Descartes de París.
1. montaje de dispositivo
Nota: El dispositivo utilizado en este protocolo es una estructura de casco-como fijada en cráneos de ratones por medio de un nombre implantado.
<ol><li>Utilizando una impresora 3D y blanco opaco poli (ácido láctico) (PLA) plástico, impresión utilizando los archivos de diseño y especificación aquí (véase Tabla de materiales) para el dispositivo y el nombre. Nota: Las dimensiones del dispositivo se muestran en figura 1 y las dimensiones del nombre que se muestra en la figura 2.</li>
	<li>Un dispositivo con bandas como sham deben ser probados (figura 2A11). Para obtener el modelo rayas, usando esmalte de uñas negro, dibujar rayas verticales grandes de 3 mm en la superficie externa del dispositivo. La condición de impostor no requiere ninguna modificación en el dispositivo de impresión.</li>
</ol>2. nombre cirugía de implantación
Todos los materiales utilizados en el presente Protocolo se detallan en la lista de materiales en la información complementaria. Pasos 2.7-2.9 uso en biomateriales en la implantación del kit (véase Tabla de materiales). Garantizar el uso de instrumentos estériles y arreglar la cirugía y la recuperación en diferentes zonas. Una vez dominado, el procedimiento de implantación dura aproximadamente 30 minutos.
<ol><li>Para la analgesia, 30 min antes del comienzo de la cirugía, por vía subcutánea inyectar buprenorfina (0,05 mg/kg) y devolver el animal en su jaula casera. Nota: Efectos analgésicos de buprenorfina duran aproximadamente 12 h, durante mucho tiempo después del final del procedimiento. En nuestra experiencia, ratones no muestran signos de angustia relacionada con esta intervención, pero una posterior dosis de 0,05 mg/kg de buprenorfina se recomienda 24 h después de la cirugía.</li>
	<li>Anestesiar al animal en una cámara con gas de isoflurano de 2,5% - 3%. Esperar 3 minutos y compruebe si el ratón es anestesiado correctamente mediante la observación de la respiración y la falta de movimiento dentro de la cámara. Pase el ratón a un cono de nariz en una mesa quirúrgica con una almohadilla térmica y pellizcando interdigital, verificar que existe ningún reflejo de retirada y baja el isoflurano al 1,5%.</li>
	<li>Afeitarse la cabeza del ratón use una afeitadora eléctrica. Para obtener un ambiente estéril, frotar la zona depilada con solución de yodo y luego con alcohol al 70%. Repita este procedimiento dos veces más.</li>
	<li>Inyección de clorhidrato de lidocaína (2%, 2 mg/kg) debajo de la piel de la cabeza para anestesia local y esperar 5 minutos para los efectos de comenzar. Para evitar daños oculares debido a la sequedad, cubre los ojos del ratón con el ungüento veterinario oftálmico tópico.</li>
	<li>Con un par de fórceps romos, agarrar la piel en la parte posterior de la cabeza y con un par de tijeras embotadas (o bisturí), hacer una incisión longitudinal de aproximadamente 1.5 cm para exponer el cráneo.</li>
	<li>Con la ayuda de un bisturí, rayar el periostio. Tenga cuidado de no rayar demasiado, ya que la fijación de la nombre puede verse comprometida si el cráneo comienza a sangrar un poco.</li>
	<li>Aplique una gota del activador del verde en el centro del cráneo. Esto mejorará la fijación del cemento por aumento de permeabilidad ósea.</li>
	<li>Preparar el cemento: mezcla una cuchara de (suministrada en el kit de implantación) de polímero con cinco gotas de monómero y una gota de catalizador. Con la ayuda de un pincel, aplique una cantidad generosa de la mezcla de cemento entre los hitos de cráneo lambda y bregma;</li>
	<li>Rápidamente Coloque el nombre en el cemento con un movimiento birlando pasando de lambda a bregma. Después de que se ha dado el nombre, volver a aplicar más cemento alrededor de la parte inferior para asegurar que el nombre correctamente se pega al cráneo. Para garantizar la correcta fijación, asegúrese de que el cemento se aplica abundantemente y que se seca antes de continuar al siguiente paso. Nota: Con este procedimiento de fijación, el nombre no sale y no permiten pruebas a largo plazo, repetidas; en nuestras manos, eliminación de nombre es < 10%.</li>
	<li>Preparar la mezcla de la resina mediante la aplicación de una relación de polvo a líquido que permite una suave consistencia de la mezcla. Aplique la resina donde se aplicó el cemento como en el nombre para proteger su superficie.</li>
	<li>Esperar 3 minutos para la resina seca y cerrar la piel en la parte posterior de las orejas con sutura de monofilamento. Con un algodón, aplicar diluido (10% - 20%) solución de yodo en la zona operada. Nota: Asegúrese de que la piel no se atascan a la resina.</li>
	<li>Apague la anestesia y colocar al animal bajo una cálida luz roja para evitar la hipotermia. Coloque el alimento humedecido e hidrogel u otra fuente de agua en gel en el piso de la jaula. No descuide el ratón hasta que recupere la conciencia. Tan pronto como el animal se recupera totalmente del procedimiento (generalmente, 30 min a 1 h después), colocar en una jaula con grupos de tres o cuatro para estimular las interacciones sociales.</li>
</ol>3. fijación del dispositivo
<ol><li>48 h después de la cirugía, fije el aparato a la medida de cabeza en el nombre.<ol>
<li>Usando un par de tornillos de 1,2 mm y un destornillador (hex 1.3 mm), alinee los orificios en el dispositivo de rayas con los agujeros en el nombre, coloque los tornillos y fijarlos. Para solucionar la farsa, gire el dispositivo hacia abajo y, con la parte posterior (figura 1A) del dispositivo frente a la dirección rostral, alinee los orificios en el dispositivo con los agujeros en el nombre. Nota: Se recomienda hacer este paso por dos operadores, uno sostiene el ratón con una restricción de ratón con una sola mano, mientras que el otro asegurar el dispositivo para el nombre. Si la fijación se realiza por un solo operador, el dispositivo se puede colocar cuando el ratón está bajo anestesia de gas.</li>
		<li>Compruebe que el dispositivo está bien asegurado y no puede extraerse por el animal y que el dispositivo no aplica presión directamente sobre la nariz del ratón, que podría potencialmente causar dolor, dificultad para respirar, o lesiones de la piel. Nota: También es importante asegurar el dispositivo simétricamente se inserta en la cara de ratón, para que los ojos están cubiertos totalmente por el dispositivo principal. Compruebe que el animal no muestra signos de dolor anormal o señal de socorro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deje el dispositivo en el ratón durante 14 días.</li>
</ol>4. animal cuidado y vigilancia
<ol><li>Una vez en sus jaulas, ratones presenta ciertas anomalías en el comportamiento. Al principio, el animal puede permanecer postrado y trate de remover el dispositivo con sus patas delanteras, pero esto debe parar después de la primera hora. Durante las próximas horas siguientes, el animal generalmente muestra dificultades orientando a sí mismo dentro de la jaula y llegar a agua y alimento. Por lo tanto, durante las 48 h después de la implantación, seguimiento de los ratones y proporcionan fácil acceso a agua y alimento, colocando directamente en el piso de la jaula, por ejemplo.</li>
	<li>Seguimiento de los pesos de los ratones durante la duración del protocolo. Pesan los ratones después de la implantación y otra vez cada 24 h. atención especial debe prestarse a los animales usando el dispositivo de rayas, como normalmente experimentan pérdida de peso corporal (1-2 g) durante las primeras 48 h, pero empezar a engordar otra vez a un ritmo normal siguiente ese período inicial (ver figura 2B11).</li>
	<li>Después de 2 días, se espera que los ratones retomar sus facultades regulares. Dependiendo del sistema utilizado en instalaciones, el dispositivo podría ser evitar el acceso a la comida y el agua. Asegúrese de que el animal está en la facilidad mientras que comer y beber o adaptar en consecuencia el sistema de dispensación. Nota: No se modifica el rango de movimientos de la cabeza producido por los animales después de unos días con el dispositivo en el dispositivo (ver figura 211) (es decir., la gama de movimientos de la cabeza produce restos similares a los movimientos naturales de la cabeza).</li>
	<li>Para asegurar bienestar de ratones, garantizar la vigilancia diaria y aplicar la escala cualitativa (tabla 1) del bienestar a lo largo de la duración del protocolo.</li>
	<li>Eliminar un ratón del protocolo actual si se aplican una o más de los siguientes criterios:<ol>
<li>Ratones que tienen un total puntuación superior a 4 puntos en la escala cualitativa antes mencionado deben ser excluidos inmediatamente del experimento (ver tabla 1). Independientemente de la puntuación, si el ratón no recupera su peso inicial después de 6 días, el procedimiento debe ser detenido.</li>
		<li>El dispositivo no se fija correctamente en el nombre si, por ejemplo, el nombre tiembla cuando se toca o algo comienza a salir. Esto causa el nombre a la cabeza del ratón y por lo tanto interrumpe el aprendizaje, que explica por qué son necesarias encuestas diarias.</li>
		<li>Cuando un ratón ha su nombre arrancó durante cualquier parte del protocolo. Debido a la sangría de cráneo asociados a este destacamento, la cirugía de reimplantación tiene una tasa de éxito baja y no merece la pena intentar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. extracción del dispositivo
<ol><li>Después del período de aprendizaje (en el presente Protocolo 14 días), retire el dispositivo siguiendo las mismas instrucciones que para su fijación (sección 3). Tan pronto como se retira el dispositivo, prueba de los ratones con experimentos tales como pruebas de video-oculography, o, por ejemplo, en vitro electrofisiología como se describió anteriormente11. Nota: tan pronto como se saca el dispositivo, ratones están expuestos hacia el medio ambiente estándar, sin obstáculos visuales. Por lo tanto, realizar experimentos que tienen como objetivo probar los efectos de aprendizaje de este dispositivo directamente después de su retiro.</li>
</ol>6. video-oculography sesiones
Nota: Video-oculography experimentos se realizan para registrar los movimientos del ojo generado mientras el animal se gira en la oscuridad (reflejo vestibulo-ocular, VOR) o girando entorno al animal mientras el animal está todavía (reflejo de optokinetic, OKR). Cada ratón fue probado por tanto esos reflejos antes y después del Protocolo de adaptación. Para más detalles sobre la configuración de video-oculography, ver informes previamente publicados12,13. Para habituar a los ratones a la grabación contenida las condiciones, el día antes del comienzo de la grabación, coloque el animal en el tubo en el centro de la placa giratoria para 10 minutos sin realizar ninguna prueba.
<ol><li>Asegure el ratón en el plato por cabeza-fijación con la ayuda de tornillos insertados en el nombre. Coloque un domo pantalla que rodea al animal y apagar todas las luces en la habitación excepto el proyector optoquinéticas. Nota: Grabaciones de Video-oculography requieren el animal que aún y con sus ojos abiertos. Interrumpir la sesión de grabación y el animal vuelve a su jaula en caso de que el ratón no voluntariamente mantener sus ojos abiertos, poner o si la apariencia del ojo se deteriora durante la sesión de grabación. Otro intento se puede hacer después de un período de descanso de al menos 12h.</li>
	<li>Iniciar la estimulación de campo completo OKR (proyección del patrón del punto blanco) y grabar a varias velocidades diferentes en las direcciones de las agujas del reloj las agujas del reloj y contador. Tan pronto como las grabaciones son más, quite la cúpula.</li>
	<li>Para poder grabar el VOR en tono oscuro, aplique una gota de pilocarpina 2% a la de ojos14. Espere al menos 5 minutos para que actúe y retírelo suavemente con un hisopo de algodón. La pilocarpina mantendrá a la pupila estrecha con un tamaño constante a lo largo de las mediciones, permitiendo la adecuada cuantificación de los movimientos en la oscuridad.</li>
	<li>Apague todas las luces en la habitación y añadir una caja encima de la bandeja giratoria para mantener el animal en tono oscuro. Iniciar el VOR horizontal sinusoidales angulares rotaciones alrededor de un eje vertical con diferentes frecuencias y velocidades diferentes.</li>
	<li>Una vez terminada la sesión de grabación, regresa el ratón a una jaula bien iluminada con una lámpara infrarroja. El calor será prevenir la hipotermia causada por los efectos de vasodilatador secundario de pilocarpina en el cuerpo del ratón. Nota: Debido al animal está restringido, las sesiones de grabación no pueden durar más de 90 minutos. Cuando se necesitan sesiones de prueba adicional, que el resto de animales durante 24 horas entre sesiones.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blazquez, P. M., Hirata, Y., Highstein, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vestibulo-ocular+reflex+as+a+model+system+for+motor+learning:+what+is+the+role+of+the+cerebellum.">The vestibulo-ocular reflex as a model system for motor learning: what is the role of the cerebellum.</a> Cerebellum. 3 (3), 188-192 (2004).</li><li>Berthoz, A., Jones, G. M., Begue, A. 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Los autores no declaran conflictos de interés.

La perturbación sensorial a largo plazo descrita aquí consiste en un desajuste visuo-vestibular producido en ratones comportarse libremente. Para implantar el dispositivo que usan ratones durante 14 días, se realiza una cirugía sencilla y breve con el equipo quirúrgico disponible comercialmente. Ratones se recuperan en menos de 1 h de este procedimiento de implantación de nombre y no asocia signos de angustia de él. Posteriormente, en el ejemplo de aplicación del presente Protocolo, VOR y OKR se miden utilizando la técnica de video-oculography. Sin embargo, este protocolo de aprendizaje a largo plazo inducido por el dispositivo podría utilizarse en una variedad de experimentos in vitro electrofisiología1imagen neuronal y varios ensayos conductuales. La lógica detrás del desarrollo de esta técnica fue inspirada por la metodología basada en el prisma utilizada en seres humanos y monos. Esta técnica, sin embargo, se diferencia porque se deteriora en lugar de visión se modifica. Por lo tanto, constituye (en su forma actual) un caso extremo de desajuste visuo-vestibular. Los autores creen que la información técnica puede ser útil para diseñar una prisma-como la versión del dispositivo o desarrollando específicos restringiendo función dispositivos16.
De una luz (0,9 g) poli (ácido láctico) plástico, el dispositivo principal fue diseñado para caber la cabeza de un ratón adulto joven, lo que permite protección del hocico y dejando bastante espacio lateral para permitir que el novio animal. La parte frontal de este dispositivo expone el extremo del hocico para permitir la alimentación y conductas de la preparación. El dispositivo es un poco opaco, por lo que el animal carece de la visión precisa de los alrededores pero sigue recibiendo estimulación de luminancia. Las implantaciones de rayas y sham son probadas para asegurar que los efectos medidos son debidos principalmente al visuo-vestibular desajuste causado por la señal visual de alto contraste durante los movimientos autogenerados del aparato con bandas y no por propioceptiva modificación (es decir, el peso del dispositivo aplicado en mouse´s cabeza y cuello).
Experimentalmente, los ratones que usaron el dispositivo rayas demostrado un significativo VOR obtener disminución de 50% después del período de aprendizaje; sin embargo, puede haber una variabilidad interindividual para valores de ganancia absoluta. Farsa los ratones mostraron no VOR importante tener alteraciones, demostrando así que la reducción de la VOR es causada por el conflicto sensorial y no por deficiencia motora. Además, ratones jóvenes (< P26) demostró VOR y OKR obtienen valores inferiores a animales mayores17. Por esa razón, edad animal debe tenerse en cuenta al planificar el experimento. Finalmente, los criterios de exclusión mencionados ratones (sección 4.5) están un paso crucial que debe seguirse para garantizar bienestar, así como establecer resultados fiables.
Una de las ventajas de este protocolo es a la vez que ahorra a experimentadores durante el período de aprendizaje, en comparación con otros tipos de protocolos de adaptación VOR/OKR. Hasta ahora, ha sido estudiada adaptación VOR en ratones mediante la fijación de la cabeza y entrenamiento el animal en una giratoria placa giratoria6,8,18,19, que es desperdiciador de tiempo, especialmente cuando muchos de los animales deben ser entrenado. El protocolo presentado permite la formación de varios animales a la vez y ahorra tiempo. Además, en estos experimentos clásicos los entrenamientos son por lo general limitados a 1 h al día, dejando largos periodos de desaprendizaje supuestos causantes de adaptación al ser iterada alternancia de aprendizaje/desaprendizaje con diferentes dinámicas20. Aquí, la fijación de la cabeza del dispositivo permite aprendizaje ininterrumpido. Otra ventaja es que dado que el período de aprendizaje se genera en una situación libre comportamiento cabeza-libre, los ratones son capaces de aprender a través de una serie de movimientos naturales de la cabeza que activamente se generan. En los protocolos clásicos, el animal es fijo de cabeza mientras se gira pasivamente en el plato para que el aprendizaje se produce a un determinado estímulo (una frecuencia, una velocidad)21 que reflejan la gama natural de movimientos de la cabeza. Es importante tener en cuenta que el sistema vestibular codifica diferentemente movimientos cuando se generan activamente por el sujeto o cuando externamente aplicado10; así, los mecanismos celulares en ambas situaciones pueden variar también.
En general, la metodología descrita es adecuada para estudios combinados/in vivo/in vitro sobre adaptaciones sensoriales a largo plazo que ocurren después de un conflicto visual o visuo-vestibular desajuste en comportarse libremente ratones. Conflictos sensoriales son una causa reconocida de enfermedad de movimiento, que es un campo que ha suscitado recientemente el uso de ratones22,23. Recientemente se demostró que la adaptación de ganancia causada por el uso de este dispositivo ofrece protección contra la enfermedad de movimiento cuando se exponen ratones a un estímulo provocador15. Por lo tanto, este protocolo podría utilizarse para identificar los mecanismos celulares subyacentes adaptación a un conflicto sensorial, así como para desarrollar tratamientos contra mareo.

Conflictos sensoriales como los visuales, están presentes en la vida diaria, por ejemplo, cuando uno lleva gafas o durante una vida entera (desarrollo crecimiento, cambios en la agudeza sensorial, etcetera.). Debido a una mirada circuito bien-descrita de la anatomía, controlados fácilmente entradas sensoriales, salidas motor cuantificables y cuantificación precisa métodos1, reflejos de estabilización se han utilizado como modelos de aprendizaje en muchas especies de motor. En los seres humanos y monos, se estudia la adaptación de (VOR) refleja vestibulo-ocular mediante el uso de prismas que el sujeto lleva varios días2,3,4,5. Dado que el modelo de roedor permite la combinación de los experimentos conductuales y celulares, hemos desarrollado un nuevo método para crear a largo plazo conflicto sensorial en comportarse libremente ratones con un casco-como el dispositivo. Inspirado por la metodología empleada en los seres humanos y monos, el protocolo genera un desequilibrio entre las entradas vestibulares y visuales (es decir, visuo-vestibular desajuste, VVM) que conduce a una disminución en la ganancia VOR.
Protocolos clásicos desencadenando una adaptación de ganancia por VOR en roedores consisten en el animal de cabeza fija en una placa giratoria de rotación girando el campo visual en fase. Este paradigma crea un conflicto visuo-vestibular, que hace el VOR contraproducente. Protocolos de adaptación a largo plazo consisten en una iteración de este procedimiento en el transcurso de varios días consecutivos6,7,8. Como resultado, cuando un grupo grande de animales necesita ser probado, metodología clásica requiere de una gran cantidad de tiempo. Además, debido a que el animal es cabeza fijada, el aprendizaje se limita principalmente a una discreta frecuencia/velocidad y consisten en entrenamientos discontinuos interrumpidos por intervalos de diferenciarlo de duración variable6. Finalmente, protocolos clásicos utilizan aprendizaje pasivo, como la estimulación vestibular no es generada activamente por movimientos voluntarios del animal, una situación que mucho procesamiento vestibular9,10.
Las mencionadas limitaciones experimentales son superadas por la metodología innovadora presentada. El acercamiento quirúrgico requerido es sencillo y los materiales utilizados son fácilmente disponibles comercialmente. La única parte que se basa en material más costoso es la cuantificación del comportamiento; sin embargo, los fundamentos del protocolo pueden utilizarse para cualquier experimento de en vitro las investigaciones a otros estudios de comportamiento de aprendizaje. En general, generando un deterioro visual temporal y un conflicto visuo-vestibular durante varios días, esta metodología puede fácilmente transponerse a cualquier estudio que trate con perturbación sensorial o aprendizaje motor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">3D printer</td>
			<td style="width:123px;">Ulimaker, USA</td>
			<td style="width:188px;">S5</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14079-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catalyst V</td>
			<td>Sun Medical, Japan</td>
			<td>LX22</td>
			<td>Parkell bio-materials, Kit n&#176;S380</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dentalon Plus</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>37041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eyetracking system and software</td>
			<td>Iscan</td>
			<td>ETN200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Green activator</td>
			<td>Sun Medical, Japan</td>
			<td>VE-1</td>
			<td>Parkell bio-materials, Kit n&#176;S380</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Monomer</td>
			<td>Sun Medical, Japan</td>
			<td>MF-1</td>
			<td>Parkell bio-materials, Kit n&#176;S380</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ocrygel</td>
			<td>TvmLab</td>
			<td>10779</td>
			<td>Ophtalmic vet ointment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polymer L-type clear (cement)</td>
			<td>Sun Medical, Japan</td>
			<td>TT12F</td>
			<td>Parkell bio-materials, Kit n&#176;S380</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sketchup</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>3D modeling software used for the device&#39;s ready-to-print design file</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Turntable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term sensory conflict in freely behaving mice

Protocolos de conflictos sensoriales a largo plazo son un medio valioso de estudiar el aprendizaje motor. El protocolo presentado produce un persistente conflicto sensorial para los experimentos destinados al estudio de aprendizaje a largo plazo en ratones. Permanentemente usando un dispositivo fijado en la cabeza, los ratones están continuamente expuestos a un desajuste sensorial entre entradas visuales y vestibulares mientras se mueven libremente en jaulas hogar. Por lo tanto, este protocolo permite fácilmente el estudio del sistema visual y multisensoriales interacciones durante un tiempo prolongado que no sería accesible si no. Además de bajar los costos experimentales del aprendizaje sensorial, a largo plazo en comportarse naturalmente ratones, este enfoque admite la combinación de experimentos en vivo y en vitro . En el ejemplo divulgado, video-oculography se realiza para cuantificar el reflejo vestibulo-ocular (VOR) y el reflejo optokinetic (OKR) antes y después del aprendizaje. Ratones exponen a este conflicto sensorial a largo plazo entre las entradas visuales y vestibulares presentada una fuerte disminución de ganancia VOR pero mostraron pocos cambios OKR. Detallados pasos de montaje del dispositivo, cuidado de los animales, y reflejas medidas se divulgan por este medio.

Las figuras siguientes ilustran los resultados obtenidos con ratones que el protocolo de adaptación de 2 semanas usando ya sea un dispositivo de rayas o simulado. La figura 3 muestra un ejemplo de materia prima rastros vistos durante las sesiones de grabación. Como se muestra mediante la comparación de las huellas, la respuesta VOR disminuye después del protocolo VVM (figura 3A, antes vs después de rayas). El VOR de ratones sham permanecía inalterado después de la adaptación (figura 3A, antes vs después de sham). OKR de ratones usando el dispositivo rayas (figura 3B) es comparable con el período antes de iniciar el protocolo VVM y simulado de ratones. Figura 4 muestra un ejemplo de la cuantificación de las ganancias medias de VOR a una frecuencia fija de 0,5 Hz y a 40 grados por segundo, antes y después del protocolo VVM, para dispositivos de rayas y simulados. Hay una disminución fuerte ganancia después de ratones llevaban el dispositivo rayas, mientras que los ratones sham no tuvo cambios de ganancia significativo. Se han informado efectos de disminución de la VOR a diferentes velocidades y frecuencias por Carcaud et al11 y Idoux et al15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig1.jpg"> Figura 1 : Dispositivo de cabeza con dimensiones, en milímetros. Vistas: Espalda (A) lado (B), inferior (C) y (D) aéreo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig2.jpg"> Figura 2 : Nombre que se representa con las dimensiones, en milímetros. En la cirugía de implantación, este ligera (0,2 g) nombre plástico poli (ácido láctico) permite la fijación del dispositivo de adaptación para el ratón y la fijación de la cabeza del animal sobre el plato durante las sesiones de video-oculography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig3v2.jpg"> Figura 3 : Huellas crudos ejemplo de movimientos del ojo durante estímulos VOR y OKR. (A, izquierda) Izquierda: VOR realizada a 0,5 Hz a 40 ° /s y estimulación de optokinetic (B, derecha) a una velocidad constante de 10 ° /s (línea negra), en sentido horario, antes (líneas verdes) y después de usar (amarillo) el dispositivo simulado o rayas (morado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig4v2.jpg"> Figura 4 : Ejemplo significa VOR y OKR obtener valores después de la adaptación al dispositivo ya sea rayado o sham. Ganancias se trazaron según tiempo (días) para el rayado (n = 10) y simulada (n = 6) dispositivos en estímulos de 40 ° /s y 0,5 Hz para el VOR (izquierda) y 10 ° /s agujas para el OKR (derecha). En la escala de tiempo, "antes" día representa el día inmediatamente anterior a la adaptación y "día 0" representa el día cuando se quita el dispositivo. Barras de error representan la desviación estándar, *** p < 0.001, no significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Puntos</td>
			<td>Alteraciones de peso corporal</td>
			<td>Apariencia física</td>
			<td>Comportamiento</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>ninguno o aumento de peso</td>
			<td>estándar</td>
			<td>no hay signos de locomoción normal y</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>pérdida de peso < 10%</td>
			<td>no hay preparación de cuerpo</td>
			<td>problemas orientación locomoción o jaula</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>pérdida de peso entre 10-20%</td>
			<td>deshidratación</td>
			<td>--</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>pérdida de peso > 20%</td>
			<td>heridas</td>
			<td>ticks nerviosos (por ejemplo, rascarse, morderse)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: escala cualitativa para la evaluación del bienestar. Figuran los parámetros cualitativos que deben ser evaluados durante la duración del protocolo. La suma peso alteraciones, apariencia física y decenas de comportamiento no deben ser superiores a cuatro puntos.
Archivo suplementario 1. Device.STL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/Device.stl" target="_blank">por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 2. Headpost.STL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/Headpost.stl" target="_blank">por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

A largo plazo conflicto sensorial en comportarse libremente ratones

El protocolo presentado produce un persistente conflicto sensorial para los experimentos destinados al estudio de aprendizaje a largo plazo. Con el uso de un dispositivo fijo permanentemente sobre sus cabezas, ratones están continuamente expuestos a un desajuste sensorial entre entradas visuales y vestibulares mientras se mueven libremente en jaulas de la casa.

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

El objetivo general de este protocolo es producir un conflicto sensorial persistente para el estudio del aprendizaje a largo plazo en ratones que se comportan libremente. Al reducir el costo experimental y el tiempo del aprendizaje sensorial, este enfoque se adapta a la combinación de experimentos in vivo e in vitro. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un ratón sedado, utilice un par de fórceps contundentes para agarrar la piel en la parte posterior de la cabeza y use tijeras para hacer una incisión longitudinal de un cm y medio para exponer el cráneo.Rasque suavemente el periosteo con un bisturí y aplique una gota de activador verde en el centro del cráneo para aumentar la permeabilidad ósea. A continuación, mezcle una cucharada de polímero del kit de implantación con cinco gotas de monómero y una gota de catalizador y cepille una generosa cantidad de mezcla de cemento entre los puntos de referencia del cráneo de lambda y bregma. Usando un movimiento de deslizamiento de lambda a bregma, coloque rápidamente el poste de la cabeza en el cemento y vuelva a aplicar cemento adicional alrededor de la parte inferior del poste para asegurarse de que el poste de la cabeza se pegue firmemente al cráneo.Mientras el cemento se seca, mezclar el polvo de resina con líquido de resina a una consistencia suave y aplicar la mezcla de resina resultante al cemento seco y alrededor del poste de la cabeza. Después de dejar que la resina se seque durante tres minutos, utilice una sutura Vicryl 4-0 para cerrar la piel en la parte posterior de las orejas y use un hisopo de algodón para aplicar una solución de 10 a 20% de yodo a la incisión. A continuación, coloque el animal bajo una luz roja con monitoreo hasta la recuperación completa.Cuarenta y ocho horas después de la cirugía alinear los agujeros en el dispositivo a rayas con los orificios en el poste de la cabeza y utilizar un destornillador hexagonal de 1,3 mm y dos tornillos de 1,2 mm para fijar el dispositivo a la señal de la cabeza. Recomendamos fijar el dispositivo en el poste de la cabeza con la ayuda de un segundo operador para evitar el riesgo de arrancar el poste de la cabeza o herir al animal con el destornillador. Para fijar la condición falsa, gire el dispositivo al revés y con la parte posterior del dispositivo mirando hacia la dirección rostral alinee los agujeros del dispositivo con los orificios en el poste.Confirme que el dispositivo está bien asegurado y no puede ser retirado por el animal y que el dispositivo no aplica presión directamente sobre la nariz, lo que podría causar dolor, dificultades respiratorias o lesiones en la piel. Como los ratones pueden presentar algunas anomalías conductuales durante las primeras 48 horas de uso del dispositivo, monitoree a los animales de cerca durante este tiempo y proporcione un fácil acceso a los alimentos y al agua hasta que los animales se aclimatan. Pesar los ratones inmediatamente después de la implantación y de nuevo cada 24 horas después hasta el final del experimento, dando especial atención a los ratones que llevan el dispositivo a rayas.Para registrar la respuesta sensorial de los animales adaptados al dispositivo, fije el primer ratón en el plato giratorio con los tornillos insertados en el poste de la cabeza y coloque una cúpula de pantalla alrededor del animal. Apague todas las luces de la habitación, excepto el proyector optocinético, e inicie la grabación de estimulación de campo completo con reflejo optocinético a varias velocidades diferentes en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj. Tan pronto como terminen las grabaciones, retire la cúpula y encienda las luces.Para registrar el reflejo vestibulo-ocular en la oscuridad de tono, aplicar una gota de 2%pilocarpina en los ojos del animal y esperar al menos cinco minutos antes de retirar suavemente la pomada con un hisopo de algodón. Apague todas las luces de nuevo y coloque una caja sobre el tocadiscos para mantener al animal en tono oscuro. Antes de iniciar la prueba horizontal de reflejos vestibulo-oculares utilizando rotaciones angulares sinusoidales alrededor de un eje vertical con diferentes frecuencias y/o velocidades diferentes.Una vez finalizada la segunda sesión de grabación, devuelva el ratón a su jaula bajo una lámpara infrarroja con monitoreo hasta que el animal esté completamente recuperado de los efectos vasodilatadores secundarios de la pilocarpina. Después de dos semanas usando una farsa o un dispositivo a rayas, las respuestas reflejo vestibulo-oculares de los ratones falsos permanecen inalteradas después de la adaptación, mientras que los animales adaptados a dispositivos a rayas demuestran una respuesta reflejo drásticamente comprometida. La cuantificación de las ganancias medias de reflejo vestibulo-ocular a una frecuencia fija de 0,5 hercios y a 40 grados por segundo antes y después del protocolo de desajuste visual-vestibular revela una fuerte disminución de la ganancia en los ratones que llevaban el dispositivo a rayas, mientras que los ratones falsos no presentaban cambios significativos en la ganancia.Sin embargo, el reflejo optocinético de los ratones que llevan el dispositivo a rayas es comparable al observado durante el período anterior al protocolo visual-vestibular y al demostrado por los animales falsos. Asegúrese de monitorear los ratones diariamente y asegurarse de que el dispositivo está correctamente posicionado en los ratones y que no impide sus rutinas. Siguiendo este procedimiento se puede realizar electrofisiología in vitro o imágenes neuronales para identificar mecanismos de adaptación sellar o ensayos conductuales para el estudio de diferentes resultados de reflejos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Electrodo de fabricación e implantación de Aplysia californica Para grabaciones multi-canal neural y muscular en los animales intactos, libremente Comportarse

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Investigación

Neurociencias

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Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Grabaciones simultáneas a largo plazo en dos etapas de procesamiento neuronal en Behaving abejas

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