Name: biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging
Uploaded: 2019-03-19T14:45:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging at JoVE.com

FIB-SEM और एएस (FIB-SEM ऑपरेटर की स्थिति) उत्कृष्टता और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) अनुसंधान केंद्र नैनो माइक्रोस्कोपी और मस्तिष्क (CNMPB) के आणविक फिजियोलॉजी के क्लस्टर द्वारा वित्त पोषित कर रहे हैं । हम C. एलिगेंस नमूने प्रदान करने के लिए थॉमस müller-reichert की प्रयोगशाला धंयवाद। हम फिल्म में भाग लेने के लिए Ulrich Weikert धंयवाद ।

<ol>
	<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>M&#246;bius, W., Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+myelin:+Structure+preservation+by+high-pressure+freezing.">Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing.</a> Brain Research. 1641, 92-100 (2016).</li><li>Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Reconstruction+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Ultrastructure.">Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure.</a> Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).</li><li>. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol">https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol</a> (2010)</li><li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focussed+Ion+Beam+Milling+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Brain+Tissue.">Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).</li><li>Eberle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+high-throughput+imaging+with+a+multibeam+scanning+electron+microscope.">High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 1-7 (2015).</li><li>Schieber, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+resin+embedding+of+multicellular+specimens+for+targeted+FIB-SEM+imaging.">Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging.</a> Methods in Cell Biology. 140, (2017).</li><li>Batt, J. A. E., Bain, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tibial+nerve+transection+-+a+standardized+model+for+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+in+mice.">Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).</li><li>M&#246;bius, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+the+Mouse+Central+Nervous+System.">Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System.</a> Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stains and Cytochemical Methods. , (1993).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).</li><li>Walther, P., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+substitution+of+high-pressure+frozen+samples:+The+visibility+of+biological+membranes+is+improved+when+the+substitution+medium+contains+water.">Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water.</a> Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).</li><li>Mcdonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+substitution+in+3+hours+or+less.">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).</li><li>Reipert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agitation+Modules:+Flexible+Means+to+Accelerate+Automated+Freeze+Substitution.">Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. , (2018).</li><li>Le&#353;er, V., Drobne, D., Pipan, &. #. 3. 8. 1. ;., Milani, M., Tatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+preparation+methods+of+biological+samples+for+FIB+milling+and+SEM+investigation.">Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation.</a> Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).</li></ol>

हितों का टकराव नहीं घोषित ।

प्रोटोकॉल एक FIB-SEM के साथ धारावाहिक ब्लॉक चेहरा इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए इष्टतम संरक्षण और इसके विपरीत वर्णन करने के लिए विकसित किया गया था । इसलिए, हम cryo-immobilization लागू करने के बाद के बाद धुंधला स्थिर प्रतिस्थापन और माइक्रोवेव की मदद से प्रसंस्करण का उपयोग करने का फैसला किया । इसलिए, इस प्रोटोकॉल है कि उच्च दबाव ठंड के लिए काफी छोटे है नमूनों तक ही सीमित है । चौड़ाई और ~ २०० μm की मोटाई में 3 से 6 मिमी के आकार सीमाओं नमूना वाहक है, जो ठीक से इस तकनीक के साथ जमे हुए किया जा सकता है कि नमूना आकार से मेल खाता है के आकार से स्थापित कर रहे हैं । यह माउस तंत्रिका नमूने के लिए प्रासंगिक है, के बाद से sciatic तंत्रिका व्यास में भी बड़ा है ०.२ mm वाहक है कि उचित ठंड सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है में फिट । इसलिए, इस तरह के टिबियल तंत्रिका या अन्य पतली तंत्रिका जैसे कि ऊरु तंत्रिका के रूप में एक छोटी तंत्रिका के सावधान विच्छेदन की सिफारिश की है । के बाद से myelin म्यान खींच करने के लिए संवेदनशील है, महान देखभाल ताजा और व्यवहार्य तंत्रिका के विच्छेदन के दौरान लिया जाना चाहिए कलाकृतियों से निपटने से बचें । सामान्यत इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी अध्ययनों के लिए केवल व्यवहार्य नमूनों का प्रयोग किया जाना चाहिए ।
माइक्रोवेव-असिस्टेड प्रोसेसिंग और मिनिमल रेज़िन एम्बेड तैयार करने और टार्गेटिंग प्रोसेस को तेज करने के लिए डिजाइन किए गए हैं । माइक्रोवेव सहायता प्रसंस्करण एक संशोधित OTO प्रोटोकॉल4 आवेदन कमरे के तापमान रासायनिक निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है । एक घर माइक्रोवेव एक ही परिणाम नहीं निकलेगा, क्योंकि वहां माइक्रोवेव के कोई समरूप वितरण नहीं है, इसके तापमान नियंत्रित नहीं है, और कोई शूंय है कि लागू किया जा सकता है । छोटे नमूने, रसायनों की बेहतर पैठ; इसलिए, सबसे अच्छा परिणाम छोटे नमूनों द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । overheating द्वारा नमूना को नुकसान से बचने के लिए, तापमान नियंत्रण और ंयूनतम आवश्यक माइक्रोवेव शक्ति के आवेदन महत्वपूर्ण हैं । माइक्रोवेव-सहायता प्रसंस्करण कदम बेंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है अगर कोई माइक्रोवेव उपलब्ध है, जो अब प्रसंस्करण समय के लिए नेतृत्व करेंगे । SEM में सीधे लक्ष्य संरचनाओं के लिए, यह नमूना के शीर्ष से संभव के रूप में ज्यादा राल को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक डेटासेट रिकॉर्डिंग के बाद, रॉ डेटा के बाद प्रसंस्करण फ़ाइल आकार को कम करने और सिग्नल से शोर अनुपात में सुधार करने के लिए आवश्यक है । आधुनिक मात्रा इमेजिंग तकनीकों डेटा की बड़ी मात्रा में उत्पादन । इसलिए, एक तेज़ और पर्याप्त तरीके से डेटा संसाधन निष्पादित करने के लिए, कार्यस्थान पर पर्याप्त RAM की आवश्यकता है । संरेखण कार्रवाई के लिए कम से दो बार अधिक RAM के रूप में डेटासेट आकार के रूप में आवश्यक है ।
इस प्रोटोकॉल का परीक्षण चूहे के साथ-साथ सी. एलिगेंसमें भी किया गया है । हॉल एट अल. 12 C. elegans की तैयारी के लिए बेंच पर उनके स्थिर प्रतिस्थापन के बाद एक समान वृद्धि कदम इस्तेमाल किया । ऐसे zebrafish के रूप में किसी भी अंय मॉडल जीव के लिए, प्रोटोकॉल के समायोजन की संभावना आवश्यक हैं । एक संभव संशोधन के लिए पानी के अलावा है कि इसके विपरीत वृद्धि18के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में फ्रीज प्रतिस्थापन कॉकटेल, की संरचना बदलने के लिए है । इसके अलावा, फ्रीज प्रतिस्थापन की अवधि के नमूने के लिए अनुकूलित किया है और काफी जल्दी फ्रीज प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल19के अनुसार छोटा किया जा सकता है । एक संभावना है कि फ्रीज प्रतिस्थापन प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए आंदोलन का अनुप्रयोग है20. स्थिर प्रतिस्थापन के बाद, आगे संशोधन संभव है, जैसे रसायनों और आज़मियम टेट्रोक्साइड21बढ़ाने के दोहराया आवेदन के रूप में । माइक्रोवेव प्रसंस्करण के दौरान, तापमान, ऊष्मायन बार, और बिजली सेटिंग्स संबंधित नमूना के लिए परिणाम का अनुकूलन करने के लिए अलग किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि ऐसी वृद्धि अन्य फ्रीज प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल और नमूने के विभिन्न प्रकार के साथ संयुक्त किया जा सकता है के रूप में हॉल12 कि एक FIB-SEM में imaged हैं या सीरियल ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्णित. इन इमेजिंग तकनीकों में एंहांस्ड कंट्रास्ट की आवश्यकता होती है, जो संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए कम महत्वपूर्ण है ।

उच्च दबाव ठंड उच्च गुणवत्ता वाले ultrastructural संरक्षण, जो एक नमूना बहुत पारंपरिक तैयारी रासायनिक निर्धारण1का उपयोग कर तरीकों से बेहतर की देशी राज्य का प्रतिनिधित्व करता है प्राप्त करने के लिए पसंद का नमूना तैयारी विधि है । इस cryo-तैयारी विधि ऐसे myelinated माउस ऊतक2 के रूप में नमूनों के लिए उपयोगी है और मॉडल जीव Caenorहैबडाइटिस एलिगेंस3के उपयोग के लिए एक सख्त आवश्यकता है । प्रतिस्थापन और राल embedding फ्रीज के बाद, इन नमूनों आमतौर पर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) या इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (एट) द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । यदि बड़ी मात्रा में FIB-SEM या धारावाहिक ब्लॉक-उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर 3 डी reconstructions के लिए चेहरा इमेजिंग का उपयोग कर imaged होना चाहिए, हमारे अनुभव में SEM द्वारा उचित इमेजिंग अक्सर विपरीत की कमी से बाधित है । FIB-SEM में, छवि आमतौर पर प्राथमिक इलेक्ट्रॉन बीम से backscattered इलेक्ट्रॉनों का पता लगाने के द्वारा दर्ज की गई है । backscattered इलेक्ट्रॉनों की उपज नमूने में भारी धातुओं की सामग्री के लिए आनुपातिक है । इसलिए, प्रोटोकॉल विशेष रूप से अतिरिक्त भारी धातु impregnation द्वारा कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए वॉल्यूम इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किए गए थे । इस तरह के तरीकों रासायनिक रूप से तय नमूनों पर आधारित है और आज़मियम टेट्रॉक्साइड का एक संयोजन लागू-thiocarbohydrazide-आज़मियम टेट्रॉक्साइड4, के रूप में knott एट अल.5द्वारा वर्णित है, धारावाहिक ब्लॉक के लिए-चेहरा और ध्यान केंद्रित आयन बीम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग । formamide और पाइरीगैलोल6 या सीसा aspartate7 के उपयोग सहित संशोधनों को सफलतापूर्वक अलग इमेजिंग तकनीकों के लिए लागू किया गया है ।
प्रोटोकॉल यहां उपलब्ध cryo-HPF द्वारा नमूनों की तैयारी को जोड़ती है और बाद माइक्रोवेव के साथ प्रतिस्थापन फ्रीज-सहायता प्रसंस्करण के लिए बढ़ाया विपरीत के लिए thiocarbohydrazide का उपयोग कर/ हम चूहों और Caenorहैबडाइटिस elegans, जो उच्च गुणवत्ता वाले ultrastructural संरक्षण के लिए उच्च दबाव ठंड की आवश्यकता होती है नमूनों का प्रतिनिधित्व में myelinated nervus टिबियल्स पर यह प्रदर्शित करता है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि कैसे, निर्जलीकरण और घुसपैठ के बाद, नमूनों के साथ संभव के रूप में छोटे राल के रूप में एंबेडेड हैं । इस ंयूनतम राल embedding8 ब्याज की संरचना के तेजी से लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है और कम समय आयन बीम के साथ ब्याज के क्षेत्र को उजागर करने के लिए आवश्यक सहित नमूना प्रसंस्करण पर खर्च कम करता है । माइक्रोस्कोप के अंदर आगे नमूना तैयार करने के कदम के बाद, इमेजिंग और नमूना की मिलिंग लगातार किया जाता है एक छवियों के ढेर प्राप्त करने के लिए । 3 डी दृश्य के लिए, छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (IMOD) डेटासेट के कुछ हिस्सों का पुनर्निर्माण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
हमारे कार्यप्रवाह का वर्णन करता है कि कैसे सबसे उपयुक्त मात्रा इमेजिंग के लिए नमूनों की विषम HPF और फ्रीज प्रतिस्थापन द्वारा सबसे अच्छा ultrastructural संरक्षण के साथ जोड़ा जा सकता है । यह कड़ाई cryo-तैयारी की आवश्यकता होती है कि नमूनों के लिए उपयोगी है । आवेदन HPF द्वारा तैयार किया जा सकता है कि छोटे नमूनों तक ही सीमित हैं । विभिन्न प्रकृति के नमूनों में, जैसे पादप सामग्री या सूक्ष्मजीवों के लिए, इस प्रोटोकोल में अनुकूलन की आवश्यकता होती है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HPM100</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Freeze Substitution</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory microwave with temperature control unit</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM ACE600 with gold target</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp 12 V/ 20 W</td>
			<td>Osram</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze substitution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>science services</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>02624-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7884-450EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass dishes, 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2189H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM stubs</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E75200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>50425-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>512-3618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive silver resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12670-EE</td>
			<td>EPO-TEK EE 129-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SmartSEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas5 A3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>http://fiji.sc/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image visualization</td>
			<td>Open source</td>
			<td>IMOD</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging

वर्णित नमूना तैयारी तकनीक एक केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FIB-SEM), जो प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है में इमेजिंग साधन के लिए सबसे उपयुक्त विपरीत के साथ ultrastructural संरक्षण की सबसे अच्छी गुणवत्ता गठबंधन करने के लिए बनाया गया है 3 डी पुनर्निर्माण और मॉडलिंग के लिए अनुक्रमिक छवियों के ढेर । उच्च दबाव ठंड (HPF) देशी संरचनात्मक संरक्षण के लिए बंद की अनुमति देता है, लेकिन बाद में स्थिर प्रतिस्थापन अक्सर पर्याप्त विपरीत प्रदान नहीं करता है, विशेष रूप से एक बड़ा नमूना है, जो उच्च गुणवत्ता के लिए आवश्यक है के लिए 3 डी SEM में इमेजिंग पुनर्निर्माण. इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, स्थिर प्रतिस्थापन के बाद, अतिरिक्त विषम कदम कमरे के तापमान पर किए जाते हैं । हालांकि इन चरणों एक माइक्रोवेव में प्रदर्शन कर रहे हैं, यह भी पारंपरिक बेंच प्रसंस्करण, जो अब ऊष्मायन बार की आवश्यकता का पालन करने के लिए संभव है । राल की ंयूनतम मात्रा में बाद embedding तेजी से और अधिक सटीक लक्ष्यीकरण और FIB-SEM अंदर तैयारी के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल के नमूनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है कि एक विश्वसनीय ultrastructural संरक्षण के लिए उच्च दबाव ठंड के द्वारा तैयारी की आवश्यकता है, लेकिन मात्रा FIB-SEM का उपयोग इमेजिंग के लिए फ्रीज प्रतिस्थापन के दौरान पर्याप्त विपरीत लाभ नहीं है । न्यूनतम राल embedding के साथ संयोजन में, इस प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले वॉल्यूम डेटा के अधिग्रहण के लिए एक कुशल कार्यप्रवाह प्रदान करता है ।

कार्यप्रवाह एक नमूने के साथ शुरू होता है (यहाँ, एक हौसले से विच्छेद माउस nervus टिबियल्स) उच्च दबाव ठंड के लिए धातु वाहक में रखा जा रहा है (चित्रा 1a). वाहक द्रव नाइट्रोजन (चित्र 1b) से प्राप्त किए जाते हैं और जमे हुए पहले रासायनिक कॉकटेल (चित्र 1c) के शीर्ष पर एक फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में रखा जाता है । 2% ओस्मियम टेट्रोक्साइड और ०.१% यूरेनल एसीटेट सहित एक लंबे फ्रीज प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल के बाद, नमूनों को कमरे के तापमान पर वाहकों से हटा दिया जाता है (चित्रा 1 डी) । इसके विपरीत बढ़ाने के लिए, नमूनों प्लास्टिक ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर रहे है माइक्रोवेव में संसाधित किया जा (चित्रा 1e) । वैक्यूम चैंबर और तापमान नियंत्रण इकाई (चित्रा 1f) प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
करने के लिए ंयूनतम राल embedding प्रदर्शन करने में सक्षम हो, टूथपिक और प्लास्टिक की फिल्म की चादरें (चित्रा 2a) की जरूरत है । माइक्रोवेव का उपयोग कर राल के साथ नमूनों घुसपैठ के बाद, वे प्लास्टिक की फिल्म के टुकड़े पर रखा जाता है और कोई राल नमूना सतह पर छोड़ दिया है जब तक चारों ओर ले जाया जाता है । एक हैलोजन लैंप में मदद करने के लिए शेष राल नाली और नमूना ंयूनतम एंबेडेड (चित्रा 2b) प्लास्टिक की फिल्म पर छोड़ किया जाता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अधिक राल नमूने के ऊपर से हटा दिया गया है अच्छा है । वहां अभी भी एक छोटी राशि के नमूने के नीचे छोड़ दिया यह सब्सट्रेट से जुड़ी रखने के लिए किया जाना चाहिए । नमूना प्लास्टिक की फिल्म पर polymerized जा रहा है कट और चांदी प्रवाहकीय राल के साथ SEM ठूंठ के शीर्ष पर घुड़सवार (चित्र 2c) । ठूंठ ६० डिग्री सेल्सियस (चित्र 2 डी) में कम 4 एच के लिए polymerized है । घटक अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए या मिश्रण सही ढंग से polymerize नहीं हो सकता है. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंदर चार्ज करने से बचने के लिए, ठूंठ सोने या प्लैटिनम/पैलेडियम (चित्रा 2e) के साथ लेपित है ।
नमूने FIB-SEM में रखा जाता है और एक द्वितीयक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ imaged ब्याज के क्षेत्र को लक्षित करने के लिए (चित्रा 3a, ई) । एक आयन बीम एक क्रॉस सेक्शन को बेनकाब करने के लिए ब्याज के क्षेत्र के सामने सीधे सामग्री को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्रा 3b-d, 3b-h). मानक प्रोटोकॉल अक्सर झिल्ली के विपरीत की कमी से पीड़ित (चित्रा 3 बी, एफ), जबकि बढ़ाया प्रोटोकॉल एक मजबूत झिल्ली के विपरीत प्रदान करता है (चित्रा 3 सी-डी, 3 जी एच) ।
EM डेटा (पोस्ट-प्रोसेसिंग के बाद) imod, एक छवि प्रसंस्करण और मॉडलिंग कार्यक्रम का उपयोग कर कल्पना हैं । 3 डी जानकारी की एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए, डेटा के आभासी reslicing इस्तेमाल किया जाता है (चित्र 4a) । डेटासेट के विभिंन संरचनाओं मैंयुअल रूप से खंडित (चित्रा 4b-d) हैं ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig1.jpg"> चित्रा 1: उच्च दबाव ठंड, फ्रीज-प्रतिस्थापन, और माइक्रोवेव की मदद से प्रसंस्करण । (क) नमूना वाहक जिसमें माउस तंत्रिका टिबिएलिस, स्केल बार 3 मिमी होती है । (ख) उच्च दाब जमने के बाद माउस नर्जस टिबियल्स युक्त नमूना वाहक, स्केल बार 3 मिमी । (ग) नमूनों के साथ आटोमेटिक फ्रीज प्रतिस्थापन (एएफस) यूनिट । इनसेट: कस्टम निर्मित धातु कंटेनर के लिए अप करने के लिए 23 नमूना विल्स और दो बड़े विल्स रसायन युक्त एएफस में । (घ) एसीटोन, स्केल बार 3 मिमी में कांच के पकवान में वाहकों से नमूने निकाले जा रहे हैं । (ङ) अभिक्रिया में नमूनों को माइक्रोवेव में संसाधित करने के लिए रखा जाएगा । (च) माइक्रोवेव के निर्वात चैम्बर और तापमान नियंत्रण एकक <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig2.jpg"> चित्रा 2: ंयूनतम राल embedding और FIB-SEM के लिए तैयारी । (क) प्लास्टिक की फिल्म और टूथपिक है कि ंयूनतम राल embedding, स्केल बार 4 सेमी के लिए इस्तेमाल किया जाता है । (ख) प्लास्टिक फिल्म, स्केल बार २५० μm के शीर्ष पर राल का सूखा तंत्रिका तंत्रिका । (ग) प्लास्टिक की फिल्म पर नेवरी टिबियल्स पॉलीमराइज्ड हैं, फिर इसे काटकर और ऊपर की ओर चढ़कर SEM डिटेल के साथ चांदी प्रवाहकीय राल, स्केल बार २५० μm । (घ) नमूने SEM डिटेल, स्केल बार 3 मिमी के शीर्ष पर polymerized । (ङ) सोने के साथ लेपित नमूने SEM डिटेल, स्केल बार 3 मिमी पर । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> ।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig3.jpg"> चित्रा 3: FIB-SEM के अंदर नमूने की तैयारी । (ए और ई) नमूना सतह के fib-SEM के अंदर द्वितीयक इलेक्ट्रॉन छवि (क) तंत्रिका टिबियल्स, स्केल बार १०० μm. (ई) सी. एलिगेंस, स्केल बार 2 μm (बी-डी) और (एफ एच) नमूना के माध्यम से क्रॉस-सेक्शन इमेजिंग के लिए esb डिटेक्टर का उपयोग कर । (ख और ग) तंत्रिका टिबिआलिस, स्केल बार 2 μm (एफ और जी) सी. एलिगेंस, स्केल बार 1 μm और २०० एनएम । (ख और च) दिखाया उच्च दबाव ठंड और वृद्धि के बिना प्रतिस्थापन फ्रीज के परिणाम हैं, जबकि अंय सभी छवियों बढ़ाया फ्रीज प्रतिस्थापन के परिणाम दिखाते हैं । (डी एण्ड एच) ESB डिटेक्टर का उपयोग कर नमूना की विस्तृत छवि । (घ) तंत्रिका टिबिअल्स, स्केल बार २०० एनएम । (ज) सी. एलिगेंस, स्केल बार २०० एनएम । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig4.jpg"> चित्र 4: छवि अधिग्रहण और विज़ुअलाइज़ेशन । (क) आईएमओडी में दर्शाए गए आंकड़ों के अनुसार लगभग रेलीकेटेड एक्स/जेड और वाई/जेड-विमानों के साथ स्केल बार 2 μm । (ख) एम डाटा (नीला), रिबेक बंडलों (लाल), माइलिन शीथ (पीला और नारंगी), और माइटोकॉन्ड्रिया (फ़िरोज़ा), स्केल बार 2 μm पर विभाजित axons (ग और घ) 3 डी मॉडल, स्केल बार 2 μm और ५०० एनएम . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging at JoVE.com

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

यहां हम दो नमूना प्रसंस्करण तकनीकों, उच्च दबाव ठंड और माइक्रोवेव सहायता नमूना प्रसंस्करण, एक केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FIB-SEM) के साथ डेटा प्राप्त करने के लिए ंयूनतम राल embedding द्वारा पीछा के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है । यह एक माउस टिबियल तंत्रिका नमूना और caenorhabditis एलिगेंसका उपयोग कर प्रदर्शित किया जाता है.

उच्च दबाव ठंड, माइक्रोवेव की सहायता के विपरीत वृद्धि, और मात्रा इमेजिंग के लिए ंयूनतम राल Embedding द्वारा जैविक नमूना तैयारी

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

इस नमूना तैयारी तकनीक को एक केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में इमेजिंग मोडलिटी के लिए सबसे उपयुक्त विपरीत के साथ अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षण की सर्वोत्तम गुणवत्ता को संयोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह प्रोटोकॉल उन नमूनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जिन्हें विश्वसनीय अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षण के लिए उच्च दबाव ठंड द्वारा तैयारी की आवश्यकता होती है लेकिन वॉल्यूम इमेजिंग के लिए फ्रीज प्रतिस्थापन के दौरान पर्याप्त विपरीत नहीं मिलता है। न्यूनतम राल एम्बेडिंग के लिए ध्यान केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में बाद में उचित लक्ष्यीकरण की अनुमति देने के लिए जितना संभव हो उतना राल को हटाना आवश्यक है।शुरू करने के लिए, काटने वाली चटाई पर 20% पीवीपी पीबीएस की एक बूंद ड्रिप करने के लिए पिपेट का उपयोग करें। बूंद में विच्छेदित नेर्वस टिबिलिस विसर्जित करें। नमूने की दो मिलीमीटर लंबाई काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें।एक 0.2 मिलीमीटर गहरे प्रकार एक धातु नमूना वाहक में नमूना जगह करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें। वाहक को कारतूस की बीच की प्लेट में स्थानांतरित करें। हेक्साडेकेन-कोटेड टाइप बी कैरियर को ढक्कन के रूप में शीर्ष पर रखें।कारतूस के ऊपरी आधे हिस्से को कम करके विधानसभा बंद करें। हाई प्रेशर फ्रीजर के लोडिंग स्टेशन में तीन पीस कारतूस बंद कर दें। प्रक्रिया बटन दबाएं और निर्माता के ऑपरेटिंग निर्देशों के अनुसार आगे बढ़ें।तरल नाइट्रोजन के स्नान में, नमूना वाहकों को क्रायो शीशियों में रखें जिसमें जमे हुए 0.1% टैनिक एसिड और एसीटोन के दो मिलीलीटर होते हैं और टोपियां बंद कर देते हैं। क्रायो शीशियों को शून्य से 90 डिग्री सेल्सियस पर सेट फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में रखें। कार्यक्रम शुरू करें और नमूनों को 100 घंटे तक वहां रखें।फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में, 30 मिनट के लिए तीन बार एसीटोन के दो मिलीलीटर के साथ नमूनों को धोएं। ठंडा करने के लिए फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में 0.1% यूरेनिल एसीटेट में 2% ऑस्मियम टेट्रोएक्साइड रखें और इसे सात घंटे के लिए नमूनों में जोड़ें शून्य से 90 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला। जब फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में कार्यक्रम का तापमान शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, तो नमूनों को एक और 16 घंटे के लिए वहां रखें।जब तापमान 4 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ जाता है, तो शीशियों में तरल को त्याग दें और शुद्ध एसीटोन में भरें। फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई से क्रायो शीशियों को हटा दें। ठंड से पहले और ऑस्मोफिकेशन के बाद नमूना हैंडलिंग महत्वपूर्ण है क्योंकि नमूना गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो सकता है।एक धुएं हुड में, एनीमे की शीशियों से धातु वाहकों को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें और वाहकों से नमूनों को स्थानांतरित करने के लिए उन्हें एसीटोन से भरे 150 मिलीमीटर गहरे घड़ी ग्लास पकवान में पनडुब्बी करें। एसटोन से भरे दो मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में नमूनों को स्थानांतरित करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। माइक्रोवेव को ४० सेकंड के लिए २५० वाट पर सेट करें और नमूनों को धोने और चार बार दोहराने के लिए माइक्रोवेव शुरू करें ।पिपेट रिएक्शन ट्यूब में 1% थिओकार्बोहाइड्रेजाइड समाधान का एक मिलीलीटर और इसे माइक्रोवेव में डाल दें। वैक्यूम फ़ंक्शन को दो मिनट चालू करें और दो मिनट की छुट्टी दें, कुल 14 मिनट तक पुनरावृत्ति करें और इसे 150 वाट पर सेट करें। माइक्रोवेव शुरू करें।नमूना पहले की तरह एसीटोन में चार बार धोएं। पिपेट रिएक्शन ट्यूब में 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड समाधान का एक मिलीलीटर। नमूना माइक्रोवेव में रखें और थिओकार्बोहाइड्रेजाइड के साथ एक ही माइक्रोवेव सेटिंग्स का उपयोग करें।नमूना पहले की तरह एसीटोन में चार बार धोएं। पिपेट एटोन में 25% राल का एक मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में और इसे माइक्रोवेव में डाल दिया। वैक्यूम फ़ंक्शन को तीन मिनट के लिए चालू करें और इसे 250 वाट पर सेट करें।माइक्रोवेव शुरू करें। रिएक्शन ट्यूब से बाहर nervus टिबिलिस को हटाने के लिए एक टूथपिक का उपयोग करें और उन्हें प्लास्टिक फिल्म के एक टुकड़े पर रखें। राल को गर्म करने के लिए नमूनों के करीब एक हैलोजन लैंप रखें।एक टूथपिक का उपयोग करना, धीरे प्लास्टिक फिल्म पर चारों ओर नमूना धक्का जब तक कोई शेष राल का पता चला है । ओवन में शीर्ष पर नमूने के साथ प्लास्टिक फिल्म रखो और ६० डिग्री सेल्सियस पर तापमान सेट करने के लिए नमूनों को कम से ४८ घंटे के लिए बहुलक । एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें एक साथ बहुलक नमूनों को काटने के लिए एक आकार में प्लास्टिक फिल्म के साथ SEM स्टब फिटिंग ।एसईएम स्टब्स पर प्रवाहकीय चांदी राल जोड़ने के लिए टूथपिक का उपयोग करें और उसमें कट नमूने संलग्न करें। और फिर नमूनों के आसपास राल जोड़ें। कम से कम 4 घंटे या रात भर के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर बहुलक बनाने के लिए ओवन में एसईएम स्टब्स रखो।बहुलीकरण के बाद, एसईएम स्टब्स को एक स्पटर कोटर में रखें। 35 मिलीम्पर पर स्पनर कोटर सेट करें और एक मिनट के लिए 10 नैनोमीटर मोटी सोने की कोटिंग या कोट लगाएं। कोटिंग के बाद, एसईएम स्टब्स को केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंदर रखें।इस अध्ययन में, माउस के नेर्वस टिबिलिस के साथ-साथ सी एलिगेंस के लिए एक उन्नत प्रोटोकॉल किया गया था ताकि इष्टतम संरक्षण और एक केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ 3 डी वॉल्यूम इमेजिंग करने के विपरीत वर्णन किया जा सके। मानक प्रोटोकॉल अक्सर झिल्ली के विपरीत की कमी से पीड़ित होते हैं जहां उन्नत प्रोटोकॉल एक मजबूत झिल्ली विपरीत प्रदान करता है। बढ़ाया प्रोटोकॉल और मानक प्रोटोकॉल के साथ C.elegans के पार अनुभाग छवियों को एक विशिष्ट अंतर दिखाते हैं ।साथ ही नेर्वस टिबिलिस के क्रॉस सेक्शन छवियों के लिए, बढ़ाया प्रोटोकॉल मानक प्रोटोकॉल की तुलना में एक मजबूत झिल्ली विपरीत दिखाने में मदद करता है। पोस्ट-प्रोसेसिंग के बाद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप डेटा को आईओडी, एक इमेज प्रोसेसिंग और मॉडलिंग प्रोग्राम का उपयोग करके कल्पना की जाती है। ब्लू-हाइलाइट किए गए क्षेत्र खंडित एक्सॉन दिखाता है।लाल-हाइलाइट क्षेत्र रेमक बंडलों को दिखाता है। पीले और नारंगी-हाइलाइट किए गए क्षेत्र myelin म्यान दिखाते हैं । और फ़िरोज़ा-हाइलाइट किया गया क्षेत्र माइटोकॉन्ड्रिया को दिखाता है।वर्चुअल रिसाल का और त्रि-आयामी मॉडल ठीक-ऊतक वास्तुकला को दिखाता है और इसके कार्य को समझने में मदद करता है। अन्य वॉल्यूम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधियों का उपयोग किया जा सकता है जैसे सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और सरणी टोमोग्राफी। इस प्रोटोकॉल का उपयोग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और अन्य नमूना प्रकारों जैसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से नमूने के लिए भी किया जा सकता है।ऑस्मियम टेट्रोक्साइड, थिओकार्बोहाइड, और यूरेसिल एसीटेट जहरीले रसायन हैं और इसका उपयोग सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। राल भी हानिकारक है और देखभाल के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए। पूर्ण प्रोटोकॉल के लिए दस्ताने और प्रयोगशाला कोट जैसे व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहने जाने चाहिए।

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

आयरन ऑक्साइड के साथ hESCs और hMSCs लेबल vivo में ट्रैकिंग में गैर इनवेसिव के लिए एमआर इमेजिंग नैनोकणों के साथ

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

चरण कंट्रास्ट और अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (डीआईसी)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

माइक्रोवेव की मदद से एक पॉट संश्लेषण एन Succinimidyl-4-[<sup18></supFluorobenzoate> एफ] ([<sup18> फा] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

तैयारी, शोधन, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के लिए और कंट्रास्ट एजेंटों के रूप में उपयोग के लिए Lanthanide परिसर की विशेषता

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

एकल वीरीय परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

मिलकर उच्च दबाव बर्फ़ीली और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए संयंत्र के ऊतकों के त्वरित रुक प्रतिस्थापन

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

अधिनियम-सफ़ाई: जैविक ऊतक समाशोधन और मात्रा इमेजिंग के लिए immunolabeling के तरीके

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

SuRVoS (सुपर-क्षेत्र खंड विभाजन) कार्यक्षेत्र का उपयोग करते हुए जैविक सामग्रियों की मात्रा का विभाजन और विश्लेषण

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosomes की नमूना तैयारी और इमेजिंग

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...