Name: biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging
Uploaded: 2019-03-19T14:45:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging at JoVE.com

Il FIB-SEM e A.S. (la posizione dell'operatore FIB-SEM) sono finanziate con il Cluster di eccellenza e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center su scala nanometrica microscopia e fisiologia molecolare del cervello (CNMPB). Ringraziamo il laboratorio di Thomas Müller-Reichert per fornire i campioni di c. elegans . Ringraziamo Ulrich Weikert per la partecipazione nel film.

Tutti gli esperimenti tra cui campioni provenienti da animali descritti qui sono stati approvati dall'Animal Care istituzionali e l'ufficio di stato di Sassonia inferiore per la tutela dei consumatori e sicurezza alimentare (LAVES).
1. ad alta pressione di congelamento e congelare sostituzione
<ol><li>Sezionare il tibiale di nervus da un mouse (ad es., C57Bl6N, 12 settimane, donna)9.</li>
	<li>Immergere il tibiale di nervus in una gocciolina di polivinilpirrolidone 20% (1 g di PVP in 5 mL) in tampone fosfato salino (PBS) e tagliare pezzi di lunghezza di 2 mm. Quindi, inserirlo in una porta-campioni di metallo (tipo A, 0,2 mm di profondità) utilizzando una pinzetta. Aggiungere un altro elemento portante piatto (tipo B) rivestito con un sottile strato di esadecano come un coperchio ed inserire questo gruppo nella cartuccia esemplare.</li>
	<li>Trasferire diverse c. elegans sospesi in una goccia di 20% di albumina di siero bovino (BSA) in M9 (Vedi Tabella materiali) con una pipetta di plastica usa e getta nell'elemento portante del metallo (tipo A). Aggiungere un secondo vettore come coperchio sulla parte superiore (tipo B), quindi montare la cartuccia.</li>
	<li>Per entrambi i campioni, procedere con il seguente: ad alta pressione congelare gli assembly di vettore di esempio--uno di loro caricamento della cartuccia tre pezzi nella stazione di carico del congelatore ad alta pressione. Premere il pulsante di processo secondo istruzioni del produttore. Nota: Entrambi i tipi di campioni possono essere elaborati insieme nella sostituzione successiva freeze.</li>
	<li>Inserire i campioni cryovials contenente 2 mL di acido tannico di surgelati 0.1% in acetone. Eseguire il trasferimento in un bagno di azoto liquido senza fuoriuscita di azoto liquido in fiale. Trasferire il cryovials in un set di10 unità sostituzione automatica congelare a-90 ° C e avviare il programma. Nota: I campioni sono tenuti a-90 ° C per 100 h. acido tannico prima di osmification è usato come mordente per aumentare l'assorbimento di tetrossido di osmio11.</li>
	<li>Lavare manualmente i campioni 3 x per 30 min con 2 mL di acetone a-90 ° C dell'unità di sostituzione di congelare.</li>
	<li>Lasciare i campioni in 2 mL di 2% tetrossido di osmio, 0,1% acetato di uranile in acetone per la macchiatura continua in automatico congelare unità di sostituzione per 7 h a-90 ° C. Attenzione: tetrossido di osmio è tossico e deve essere maneggiato sotto una cappa aspirante e dispositivi di protezione devono essere indossati. Nota: L'unità di sostituzione freeze genera automaticamente la temperatura a-20 ° C a 5 ° C/h. I campioni sono conservati a-20 ° C per 16 h nell'unità di sostituzione di congelare. La temperatura verrà generata automaticamente a 4 ° C a 10 ° C/h.</li>
	<li>La soluzione di tetrossido di osmio con acetone puro di Exchange quando la temperatura ha raggiunto i 4 ° C. Rimuovere il cryovials dall'unità di sostituzione di congelare.</li>
</ol>2. assistita da microonde elaborazione
Nota: Eseguire tutti i passaggi seguenti a temperatura ambiente12 utilizzando un'unità di controllo temperatura per mantenere la temperatura stabile (Vedi Tabella materiali).
<ol><li>Lasciare i tappi delle provette di reazione aperte durante l'elaborazione nel microonde.</li>
	<li>Prendere i vettori di metallo campione fuori il cryovials e rimuovere i campioni dal supporto in metallo utilizzando una pinzetta o un ago, mantenendo i campioni immerso in acetone in un piatto di vetro d'orologio (150 mm).</li>
	<li>Trasferire i campioni in provette di reazione di 2 mL utilizzando una pinzetta o una pipetta e lavare con 1 mL di acetone quattro volte per 40 s a 250 w. Attenzione: Thiocarbohydrazide è tossico e deve essere maneggiato sotto cappa aspirante, dispositivi di protezione devono essere indossati.</li>
	<li>Macchia di campioni con 1 mL di 1% thiocarbohydrazide in acetone per 14 min a 150 W per aumentare il contrasto. Per eseguire la colorazione, dispensare la soluzione di thiocarbohydrazide nella provetta di reazione, collocare la provetta nel forno a microonde e impostare il programma per un livello di potenza di 150 W (con la funzione di vuoto accesa) per 2 min on/2 min fuori, l'iterazione per 14 min totale. Avviare il forno a microonde. Nota: Thiocarbohydrazide reagisce con il tetrossido di osmio è stato applicato durante la sostituzione di congelare. Forma un ponte, permettendo più tetrossido di osmio essere depositati sull'originale tetrossido di osmio siti13.</li>
	<li>Lavare i campioni 4 x con 1 mL di acetone per 40 s a 250 w. pipetta l'acetone in una provetta di reazione, collocare la provetta nel forno a microonde e selezionare 250 W per 40 s. Start il forno a microonde.</li>
	<li>Macchia in 1 mL di 2% tetrossido di osmio in acetone per 14 min a 150 w. pipetta la soluzione tetrossido di osmio in una provetta di reazione, collocare la provetta nel microonde e impostare il programma per un livello di potenza di 150 W (con la funzione di vuoto acceso) per 2 min min on/2 fuori , l'iterazione per 14 min totale. Avviare il forno a microonde.</li>
	<li>Lavare i campioni 4 x con 1 mL di acetone per 40 s a 250 W (come fatto nel passo 2.5).</li>
	<li>Infiltrarsi con 1 mL di aumento delle concentrazioni di resina in acetone (Vedi Tabella materiali) del 25%, 50%, 75%, 90%, 100% e 100% per 3 minuti ciascuno, a 250 w. pipetta la resina in una provetta di reazione, collocare la provetta nel microonde e impostare il programma a un leve di potere l di 250 W (con la funzione di vuoto acceso) per un minimo di 3 avviare il forno a microonde.</li>
</ol>3. minima resina incorporamento8
<ol><li>Prendere il nervus tibiale e c. elegans fuori dal tubo di reazione con uno stuzzicadenti e posto su un pezzo di plastica della pellicola (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Usare lo stuzzicadenti per spingere delicatamente il campione sul film plastico finché non viene rilevata nessuna resina rimanente. Utilizzare una lampada alogena per riscaldamento (Vedi Tabella materiali) quindi la resina diventa meno viscosa ed è in grado di essere rimossi più facilmente. Posto la lampada alogena vicino abbastanza per riscaldare la resina (facendo attenzione a non bruciare le mani).</li>
	<li>Polimerizzare i campioni per almeno 48 h a 60 ° C sopra la pellicola di plastica nel forno.</li>
</ol>4. preparazione per FIB-SEM
<ol><li>Tagliare fuori i campioni polimerizzati insieme con la pellicola di plastica usando una lama di rasoio a una dimensione raccordo lo stub di SEM e collegarli agli stub di SEM utilizzando una resina conduttiva argento (Vedi Tabella materiali). Polimerizzare nuovamente a 60 ° C per almeno 4 ore o tutta la notte.</li>
	<li>Cappotto di polverizza i campioni su SEM di stub con oro per 1 min a 35 mA utilizzando una macchina a polverizzazione (platino/palladio può anche essere usato; un rivestimento spesso di 10 nm è sufficiente) e inserirli all'interno di FIB-SEM.</li>
</ol>5. acquisizione all'interno il FIB-SEM
<ol><li>I campioni di immagine con il rivelatore di elettroni secondari utilizzando il software di base guida il microscopio (Vedi Tabella materiali). Il campione deve essere orientato in modo che la regione di interesse (ad es., la parte centrale di tibialis nervus o il c. elegans) è nel campo di vista. Nota: Per eseguire l'acquisizione di dati, inclinare il palcoscenico per una posizione così che il campione sia rivolto verso il fascio di ioni ad un angolo di 90° ad una distanza di lavoro appropriata (5 mm) nel punto cosiddetto coincidenza del fascio di ioni ed elettroni. Utilizzando il nostro strumento, questo si ottiene su un tilt di fase di 54° e distanza di lavoro di 5 mm.</li>
	<li>Per impostare la corretta posizione del campione, centrare una caratteristica comune a un'inclinazione di 0° mentre la formazione immagine con il rivelatore di elettroni secondari. Lentamente la inclinazione al 54° (5°, 20°, 54°), ricentrando lo stesso oggetto spostando l'asse M.</li>
	<li>Trova il punto di coincidenza di una funzione durante la formazione immagine di centratura con il rivelatore di elettroni secondari al 54°, seguita da spostando la funzionalità in posizione centrale nella modalità FIB. Eseguire questa operazione visualizzando il puntatore a croce nel software SEM per avere un'indicazione del centro. Quindi prima spostare la funzione del campione selezionato al centro dell'area dell'immagine utilizzando la funzione di punto di centro del software SEM. Poi centro la caratteristica lungo l'asse y spostando il palco in z. Qualsiasi offset finale tra FIB e SEM è corretto con lo spostamento del fascio di SEM.</li>
	<li>Aprire il software avanzato (Vedi Tabella materiali) per la registrazione di dataset 3D e segui la procedura guidata del software passo dopo passo.</li>
	<li>Presso la regione di interesse, di deposito di carbonio o di platino (400 nm) in cima il ROI utilizzando un nA 3 corrente per consentire anche fresatura e ridurre gli artefatti indotti da ricarica. Nota: Disegnando la regione di interesse di fresatura sulla superficie del campione imaged con la FIB (larghezza, altezza, profondità), il software calcola e sovrappone le dimensioni delle caratteristiche preparazione campione diverso, ad esempio le trincee da fresare o area per deposizione di platino/carbonio. Anche, essere cauti di imaging la superficie del campione con correnti troppo elevate FIB, come questo può danneggiare la superficie del campione. Una corrente di 50 pA è sufficiente per l'imaging.</li>
	<li>Utilizzare il fascio ionico focalizzato a fresare una trincea per esporre la regione di interesse (ROI) utilizzando un nA 15/30 corrente.</li>
	<li>Utilizzare il fascio ionico focalizzato per lucidare la sezione trasversale con un nA 7 corrente.</li>
	<li>Dopo aver terminato la preparazione del campione, impostare i seguenti parametri di imaging: FIB fresatura parametri nella scheda di impostazione FIB (FIB fresatura corrente); SEM imaging parametri nella scheda installazione e l'immagine di regolazione dei parametri nella scheda SEM AutoTune (eseguire la messa a fuoco automatica e autostigmation ogni 60 min, dimensione di pixel di 50 nm, tempo di sosta 3, linea 3 media). Ottimizzare questo per ogni campione.</li>
	<li>Per evitare qualsiasi deriva termica, causando il blocco-volto alla deriva durante l'esecuzione, è possibile lasciare la stanza per almeno 2 h prima di avviare l'acquisizione.</li>
	<li>Acquisire il dataset in un mulino continuo e acquisire modalità con un pA 700 FIB corrente. Uso 1.5 kV (modalità analitica, 900 V) rilevatore di ESB con una tensione di rete 400 V per acquisire immagini ciascuna con 5 pixel per nm utilizzando il software avanzato (Vedi Tabella materiali) e spessore della fetta 50 nm. Acquisizione di immagini di una dura circa 1,5 min con un tempo di permanenza di 6 µs.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dei dati. Un'immagine FIB presso la fresatura attuale viene acquisita per garantire che il campione non si mosse e la giusta regione di interesse è selezionata. Regolare se necessario.</li>
</ol>6. data visualization
<ol><li>Aprire le immagini in Fiji trascinando la cartella contenente tutte le immagini in Fiji e selezionare Stack virtuale.</li>
	<li>Ritagliare l'area di interesse utilizzando lo strumento rettangolo (immagine > Ritaglia).</li>
	<li>Invertire i dati per mostrare il contrasto di microscopia elettronica di trasmissione tradizionale con membrane rivelando nel buio (Edit > Inverti).</li>
	<li>Uso TrackEM214 (Fiji15) per l'allineamento. Caricare i dati in TrackEM2 (File > New > TrackEM2) facendo clic sul layer. Dopo tutte le immagini sono caricate, allinearle utilizzando la funzione multi-strato mosaico (tasto destro del mouse su immagine > Allinea > allineare multistrato mosaico). Dopo l'allineamento, le immagini vengono esportate come file tiff singoli (pulsante destro del mouse su immagine > Esporta > immagine piana marca). Selezionare tutte le immagini che devono essere esportate e scegliere Salva file.</li>
	<li>Per post-elaborazione, utilizzare una sfocatura gaussiana (processo > filtri > sfocatura gaussiana; sigma 2) e l'aumento di contrasto locale (processo > Migliora contrasto locale; CLAHE: blocksize 127, bidoni di istogramma 256, pendenza massima 1.5), che vengono applicate in Fiji per lisciare l'immagine e ottenere un migliore rapporto segnale-rumore.</li>
	<li>IMOD16 è utilizzato per eseguire una segmentazione manuale e visualizzare la struttura di interesse in 3D. Aprire il dataset in IMOD e selezionare gli strumenti di disegno (speciale > strumenti di disegno) per eseguire la segmentazione manuale. Diversi strumenti manuale possono essere utilizzati per seguire la struttura di interesse in tutto il volume (ad esempio Join, Sculpt). Utilizzare il Browser di immagini di microscopia (MIB17) per segmentazione semi-automatizzata.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>M&#246;bius, W., Nave, K. -. A., Werner, H. 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Conflitti di interesse non dichiarati.

Il protocollo è stato sviluppato per illustrare la conservazione ottimale e il contrasto per eseguire imaging seriale blocco-faccia con un FIB-SEM Pertanto, abbiamo scelto di applicare cryo-immobilizzazione seguita da post-colorazione mediante sostituzione di congelare ed elaborazione assistita da microonde. Di conseguenza, questo protocollo è limitato ai campioni che sono abbastanza piccoli per congelamento ad alta pressione. Le limitazioni delle dimensioni di 3-6 mm di larghezza e spessore di ~ 200 µm sono stabiliti dalla dimensione del vettore campione, cui corrisponde la dimensione del campione che può essere opportunamente congelata con questa tecnica. Ciò è rilevante per il campione del nervo del mouse, poiché il nervo sciatico è troppo grande in diametro per adattarsi i vettori di 0,2 mm che sono tenuti a garantire il corretto congelamento. Pertanto, si raccomanda un'attenta dissezione di un nervo più piccolo come il nervo tibial o altro nervo sottile come il nervo femorale. Poiché la guaina mielinica è sensibile allo stiramento, si deve prestare attenzione grande durante la dissezione del nervo fresca e vitale per evitare di gestire artefatti. In generale, solo praticabili campioni devono essere utilizzati per studi al microscopio elettronico.
Elaborazione assistita da microonde e l'incorporamento di resina minimal sono progettati per accelerare la preparazione e il processo di targeting. L'elaborazione assistita da microonde, l'applicazione di un protocollo di modificate OTO4 viene utilizzato per la fissazione chimica temperatura ambiente. Forno a microonde domestico non produrrà gli stessi risultati, poiché non c'è nessuna distribuzione omogenea delle microonde, la temperatura non è controllata e non c'è nessun vuoto che può essere applicato. Il più piccolo un campione, la migliore penetrazione delle sostanze chimiche; di conseguenza, i risultati migliori si ottengono dai campioni più piccoli. Per evitare danni al campione di surriscaldamento, controllo della temperatura e applicazione della potenza microonde minimamente richiesto sono fondamentali. Le fasi di lavorazione assistita da microonde possono essere eseguite in panchina se non c'è nessun forno a microonde disponibile, che porterà a tempi di elaborazione più lunghi. A direttamente strutture bersaglio nel SEM, è fondamentale per rimuovere quanto più resina come possibile dalla parte superiore del campione. Dopo aver registrato un set di dati, post-elaborazione dei dati grezzi è necessario ridurre la dimensione del file e migliorare il rapporto segnale-rumore. Tecniche di imaging volume moderno di produrre grandi quantità di dati. Pertanto, per eseguire l'elaborazione di dati in modo rapido e sufficiente, è necessario sufficiente RAM sulla workstation. Per le operazioni di allineamento è necessaria almeno due volte tanto RAM come la dimensione del dataset.
Questo protocollo è stato testato sul nervus tibiale del mouse anche come in c. elegans. Hall et al.. un simile passo di valorizzazione utilizzato 12 dopo la loro sostituzione di congelare in panchina per la preparazione di elegans del c. Per qualsiasi altro organismo di modello come zebrafish, regolazioni del protocollo sono probabilmente necessarie. Una eventuale modifica è quello di cambiare la composizione della sostituzione congelamento cocktail, come ad esempio tramite l'aggiunta di acqua che è usata per contrasto valorizzazione18. Inoltre, la durata della sostituzione di congelamento deve essere adattata al campione e può essere accorciata considerevolmente secondo il congelamento rapido sostituzione protocollo19. Una possibilità è l'applicazione di agitazione per accelerare il processo di sostituzione congelare20. Dopo la sostituzione di congelare, ulteriori modifiche sono possibili, come ad esempio l'applicazione ripetuta di valorizzare prodotti chimici e tetrossido di osmio21. Durante l'elaborazione del forno a microonde, la temperatura, tempi di incubazione e le impostazioni di alimentazione possono essere variate per ottimizzare i risultati per il rispettivo campione.
Questo protocollo viene illustrato che un simile rafforzamento possa essere combinato con altri protocolli di sostituzione di congelare e diversi tipi di campioni come descritto da padiglione12 che sono imaged in un FIB-SEM o di microscopia elettronica a scansione seriale blocco-faccia. Queste tecniche di imaging richiedono maggiore contrasto, che è meno importante per microscopia elettronica di trasmissione.

Il congelamento ad alta pressione è il metodo di preparazione del campione di scelta per l'ottenimento di conservazione ultrastrutturale di alta qualità, che rappresenta lo stato nativo di un campione molto meglio rispetto ai metodi convenzionali di preparazione mediante fissazione chimica1. Questo metodo di cryo-preparazione è utile per i campioni quali mouse myelinated tessuto2 e un requisito indispensabile per l'utilizzo dell'organismo modello Caenorhabditis elegans3. Dopo la sostituzione di congelamento e l'incorporamento di resina, questi campioni vengono analizzati solitamente di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o tomografia elettronica (ET). Se più grandi volumi devono essere imaged con FIB-SEM o formazione immagine seriale blocco-viso per ricostruzioni 3D su larga scala ad alta risoluzione, nella nostra esperienza adeguata formazione immagine di SEM è spesso ostacolata dalla mancanza di contrasto. Nel FIB-SEM, l'immagine è registrata solitamente tramite la rilevazione di backscattered gli elettroni dal fascio primario dell'elettrone. La resa di backscattered gli elettroni è proporzionale al contenuto di metalli pesanti nel campione. Pertanto, protocolli sono stati progettati specialmente per volume di imaging per migliorare il contrasto da impregnazione metalli pesanti supplementari. Tali metodi si basano su campioni fissati chimicamente e applicano una combinazione di tetrossido di osmio-thiocarbohydrazide-osmio tetrossido4, come descritto da Knott et al.5, per seriale blocco-face e concentra il fascio di ioni, microscopia elettronica a scansione. Modifiche tra le quali l'uso di formammide e pirogallolo aspartato a6 o piombo7 sono state applicate con successo per diverse tecniche di imaging.
Il protocollo fornito qui combina la cryo-preparazione dei campioni di HPF e congelare sostituzione con successiva elaborazione per contrasto migliorato utilizzando thiocarbohydrazide/OsO4 in acetone a temperatura ambiente assistita da microonde. Dimostriamo questa sul tibiale di nervus myelinated dei topi e in Caenorhabditis elegans, che rappresentano esempi che richiedono alta pressione congelamento per conservazione ultrastrutturale di alta qualità. Inoltre, è indicato come, dopo la disidratazione e l'infiltrazione, i campioni sono incorporati con come poco resina come possibile. Questa resina minimal incorporamento8 permette per il targeting più veloce della struttura di interesse e riduce il tempo dedicato all'elaborazione del campione, compreso meno tempo di esporre l'area di interesse con il fascio di ioni. Dopo l'esecuzione di ulteriori passaggi di preparazione del campione all'interno del microscopio, imaging e macinazione del campione avviene continuamente di acquisire una serie di immagini. Per la visualizzazione 3D, software (IMOD) elaborazione delle immagini viene utilizzata per ricostruire parti del dataset.
Il nostro flusso di lavoro viene descritto come il più adatto a contrasto dei campioni per imaging con volumi possa essere combinato con la migliore conservazione ultrastrutturale di sostituzione HPF e congelare. Questo è utile per i campioni che richiedono rigorosamente cryo-preparazione. Le applicazioni sono limitate a piccoli campioni che possono essere preparati da HPF. Nei campioni di diversa natura, come materiale vegetale o microrganismi, questo protocollo richiede adattamento.

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		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HPM100</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Freeze Substitution</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory microwave with temperature control unit</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM ACE600 with gold target</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp 12 V/ 20 W</td>
			<td>Osram</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze substitution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>science services</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>02624-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7884-450EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass dishes, 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2189H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM stubs</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E75200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>50425-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>512-3618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive silver resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12670-EE</td>
			<td>EPO-TEK EE 129-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SmartSEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas5 A3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>http://fiji.sc/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image visualization</td>
			<td>Open source</td>
			<td>IMOD</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging

La tecnica di preparazione del campione descritto è stata progettata per combinare le migliori qualità di conservazione ultrastrutturale con il contrasto più adatto per le modalità di formazione immagine in ionico focalizzato fascio microscopio elettronico a scansione (FIB-SEM), che viene utilizzato per ottenere pile di immagini sequenziali per la ricostruzione 3D e modellazione. Ad alta pressione di congelamento (HPF) permette vicino nativo conservazione strutturale, ma il successivo congelamento sostituzione spesso non fornisce sufficiente contrasto, soprattutto per un esemplare più grande, che è necessaria per l'imaging di alta qualità nel SEM richiesto per 3D ricostruzione. Pertanto, nel presente protocollo, dopo la sostituzione di congelare, a contrasto eseguite ulteriori operazioni sono a temperatura ambiente. Anche se queste operazioni vengono eseguite in un forno a microonde, è anche possibile seguire la lavorazione tradizionale panca, che richiede tempi di incubazione più lunghi. L'incorporamento successive in minime quantità di resina permette più veloce e precisa di targeting e di preparazione all'interno FIB-SEM. Questo protocollo è particolarmente utile per gli esempi che richiedono una preparazione di congelamento ad alta pressione per una conservazione ultrastrutturale affidabile ma non ottengono abbastanza contrasto durante la sostituzione di congelare per imaging con volumi utilizzando FIB-SEM In combinazione con l'incorporamento di resina minima, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro efficiente per l'acquisizione dei dati del volume di alta qualità.

Il flusso di lavoro inizia con un campione (qui, un topo appena dissecata nervus tibialis) essere immessi in elementi portanti metallici per congelamento ad alta pressione (Figura 1a). I vettori sono recuperati da azoto liquido (Figura 1b) e collocati in un'unità di sostituzione di congelamento sopra il congelato chimico primo cocktail (Figura 1C). Dopo un lungo congelamento protocollo sostituzione tra cui 2% tetrossido di osmio e 0,1% di acetato di uranile, i campioni vengono rimossi da parte dei vettori a temperatura ambiente (Figura 1D). Per migliorare ulteriormente il contrasto, i campioni vengono trasferiti per tubi di plastica per essere elaborati nel microonde (Figura 1e). La camera a vuoto e unità di controllo di temperatura vengono utilizzate per ottimizzare il processo (Figura 1f).
Per essere in grado di effettuare l'embedding di resina minima, sono necessari degli stuzzicadenti e fogli di pellicola di plastica (Figura 2a). Dopo i campioni di infiltrazione con resina utilizzando il forno a microonde, sono posizionati su pezzi di pellicola di plastica e spostati fino a quando la resina non è lasciata sulla superficie del campione. Una lampada alogena è usata per aiutare a drenare la resina restante e lasciare il campione minimamente incorporato (Figura 2b) sul film plastico. Si deve osservare che la resina più rimossa dalla parte superiore del campione è buona. Ci dovrebbe essere ancora una piccola quantità lasciato sotto il campione di tenerlo attaccato al substrato. Il campione viene polimerizzato sul film plastico è tagliato e montato sulla sommità dell'albero mozzo di SEM con resina conduttiva argento (Figura 2C). Lo stub è polimerizzato per almeno 4 ore a 60 ° C (figura 2d). I componenti devono essere miscelati accuratamente o la miscela non può polimerizzare correttamente. Per evitare di caricare all'interno del microscopio elettronico a scansione, lo stub è Polverizzi ricoperto di oro o platino/palladio (Figura 2e).
I campioni sono collocati nel FIB-SEM ed imaged con un rivelatore di elettroni secondari per raggiungere la regione di interesse (Figura 3ae). Un fascio di ioni viene utilizzato per rimuovere il materiale direttamente di fronte la regione di interesse per esporre una sezione trasversale (Figura 3b-d, 3f-h). Protocolli standard spesso soffrono di una mancanza di contrasto di membrana (Figura 3bf), considerando che il protocollo avanzato fornisce un contrasto forte membrana (Figura 3 c-d, 3 g-h).
I dati di EM (dopo il post-processing) vengono visualizzati utilizzando IMOD, un'immagine di elaborazione e modellazione programma. Per ottenere una migliore comprensione delle informazioni 3D, reslicing virtuale dei dati viene utilizzato (Figura 4a). Diverse strutture del dataset sono segmentate manualmente (Figura 4b-d).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig1.jpg"> Figura 1: alta pressione congelamento, congelamento-sostituzione ed elaborazione assistita da microonde. (un) del campione di vettore contenente il mouse nervus tibiale, scala bar 3 mm. vettore (b) campione contenente il mouse nervus tibialis dopo ad alta pressione congelamento, scala bar mm. 3 (c) automatico freeze sostituzione (AFS) unità con campioni. Inserto: su ordine del contenitore in metallo per fiale del campione fino a 23 e due grandi fiale contenenti prodotti chimici in AFS. (d) i campioni per essere rimosso dal vettori in un piatto di vetro in acetone, scala bar 3 mm. (e) i campioni in provette di reazione per essere messo nel microonde per l'elaborazione. unità (f) controllo di temperatura e alloggiamento di vuoto del forno a microonde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig2.jpg"> Figura 2: incorporamento di resina Minimal e preparazione per FIB-SEM. (a) pellicola e stuzzicadenti che vengono utilizzati per la resina minimal incorporamento, scala bar cm. 4 (b) Nervus tibialis svuotato di resina sopra la pellicola in plastica, scala bar 250 µm. (c) Nervus tibialis polimerizzato il film di materia plastica, poi tagliato e montato in cima lo stub di SEM con argento resina conduttiva, scala bar 250 µm. (d) campioni polimerizzati in cima lo stub di SEM, scala bar 3 mm. (e) campioni rivestiti in oro sullo stub di SEM, scala bar 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig3.jpg"> Figura 3: preparazione del campione all'interno di FIB-SEM. (a ed e) Immagine secondaria dell'elettrone all'interno il FIB-SEM del campione di superficie (a) scala di Nervus tibialis, bar 100 µm. (e) di c. elegans, scala bar 2 µm. (b-d) e (f-h) sezione trasversale attraverso campione mediante rivelatore di ESB per l'imaging. (b e c) Nervus tibialis, scala bar 2 µm. (f e g) c. elegans, scala bar 1 µm e 200 nm. (b e f) Vengono mostrati i risultati di congelamento ad alta pressione e la sostituzione di congelare senza miglioramento, mentre tutte le altre immagini mostrano risultati di sostituzione avanzata freeze. (d e h) Immagine dettagliata del campione utilizzando il rivelatore di ESB. (d) Nervus tibialis, scala bar 200 nm. (h) c. elegans, scala bar 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig4.jpg"> Figura 4: acquisizione e visualizzazione immagine. (a) dati EM mostrati in IMOD con virtualmente resliced x / y/z-aerei e z - scala bar 2 µm. (b) Segmented assoni su EM dati (blu), i pacchetti (rossi) Remak, foderi di myelin (giallo e arancione) e mitocondri (turchesi), scala bar 2 µm. (c e d) modello 3D, scala bar 2 µm e 500 nm . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Qui presentiamo un protocollo per la combinazione di due tecniche di elaborazione del campione, ad alta pressione congelamento e trattamento dei campioni assistita da microonde, seguita da minima resina incorporamento per l'acquisizione di dati con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Questo è dimostrato utilizzando un mouse del nervo tibial campione e Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Questa tecnica di preparazione del campione è progettata per combinare la migliore qualità di conservazione dell'ultrastruttura con il contrasto più adatto per la modalità di imaging in un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato. Questo protocollo è particolarmente utile per i campioni che richiedono la preparazione mediante congelamento ad alta pressione per una conservazione affidabile dell'ultrastruttura ma non ottengono abbastanza contrasto durante la sostituzione del congelamento per l'imaging del volume. Per un incorporamento minimo della resina è essenziale rimuovere quanta più resina possibile per consentire un corretto targeting in seguito nel microscopio elettronico a scansione del fascio ionico focalizzato.Per iniziare, utilizzare la pipetta per gocciolare una goccia di 20%PVP PBS sul tappetino da taglio. Immergere il nervus tibialis sezionato nella goccioline. Utilizzare il bisturi per tagliare due millimetri di lunghezza del campione.Utilizzare forcep fini per posizionare il campione in un portacampioni metallico di tipo A profondo 0,2 millimetri. Trasferire il supporto nella piastra centrale della cartuccia. Posizionare il supporto di tipo B rivestito con esadecano sulla parte superiore come coperchio.Chiudere l'assieme abbassando la metà superiore della cartuccia. Chiudere la cartuccia a tre pezzi nella stazione di carico del congelatore ad alta pressione. Premere il pulsante di processo e procedere secondo le istruzioni operative del produttore.In un bagno di azoto liquido, mettere i portatori di campioni in fiale crio contenenti due millilitri di acido tannico e acetone congelati allo 0,1% e chiudere i tappi. Posizionare le fiale criogeniche nell'unità di sostituzione del congelamento impostata a meno 90 gradi Celsius. Avviare il programma e conservare i campioni lì per 100 ore.Nell'unità di sostituzione del congelamento, lavare i campioni con due millilitri di acetone tre volte per 30 minuti. Inserire il 2%di tetrossido di osmio nell'acetato di 0,1% di uranil nell'unità di sostituzione del congelamento per il raffreddamento e aggiungerlo ai campioni per una colorazione continua di sette ore a meno 90 gradi Celsius. Quando la temperatura del programma nell'unità di sostituzione del congelamento raggiunge meno 20 gradi Celsius, tieni i campioni lì dentro per altre 16 ore.Quando la temperatura sale a 4 gradi Celsius, scartare il liquido nelle fiale e riempire l'acetone puro. Rimuovere le fiale criogeniche dall'unità di sostituzione del congelamento. La manipolazione del campione prima del congelamento e dopo l'osmoficazione è fondamentale poiché il campione può essere gravemente danneggiato.In una cappa aspirante, utilizzare forcep fini per rimuovere i supporti metallici dalle fiale criogeniche e trasferire i campioni dai supporti per sommergirli in un piatto di vetro da orologio profondo 150 millimetri pieno di acetone. Utilizzare forcep fini per trasferire i campioni in due tubi di reazione millilitro riempiti di acetone. Impostare il microonde a 250 watt per 40 secondi e avviare il microonde per lavare i campioni e ripetere quattro volte.Pipettare un millilitro di soluzione di tiocarboidrazide all'1% nel tubo di reazione e metterlo nel microonde. Accendere la funzione vuoto con due minuti di su e due minuti di riposo, iterando per un totale di 14 minuti e impostarla a 150 watt. Inizia il microonde.Lavare il campione quattro volte in acetone come in precedenza. Pipetta un millilitro di soluzione di tetrossido di osmio al 2% nel tubo di reazione. Posizionare il campione nel microonde e utilizzare le stesse impostazioni del microonde del tiocarboidrazide.Lavare il campione quattro volte in acetone come in precedenza. Pipetta un millilitro di 25% di resina in acetone nel tubo di reazione e metterlo nel microonde. Accendere la funzione di vuoto per tre minuti e impostarla a 250 watt.Inizia il microonde. Utilizzare uno stuzzicadenti per rimuovere il nervus tibialis dal tubo di reazione e posizionarli su un pezzo di pellicola di plastica. Posizionare una lampada alogena vicino ai campioni per riscaldare la resina.Utilizzando uno stuzzicadenti, spingere delicatamente il campione sulla pellicola di plastica fino a quando non viene rilevata alcuna resina rimanente. Mettere la pellicola di plastica con il campione sopra nel forno e impostare la temperatura a 60 gradi Celsius per polimerizzare i campioni per almeno 48 ore. Utilizzare una lama di rasoio per ritagliare i campioni polimerizzati insieme alla pellicola di plastica di dimensioni che si adattano allo stub SEM.Utilizzare uno stuzzicadenti per aggiungere resina d'argento conduttiva sugli stub SEM e attaccarti i campioni tagliati. E poi aggiungere resina intorno ai campioni. Mettere gli stub SEM nel forno per polimerizzare a 60 gradi Celsius per almeno 4 ore o durante la notte.Dopo la polimerizzazione, posizionare gli stub SEM in un rivestimento sputter. Impostare il rivestimento dello sputter a 35 milliampere e applicare un rivestimento o un cappotto in oro spesso 10 nanometri per un minuto. Dopo il rivestimento, posizionare gli stub SEM all'interno del microscopio elettronico a scansione del fascio ionico focalizzato.In questo studio, è stato eseguito un protocollo migliorato per il nervus tibialis del mouse e c.elegans per illustrare la conservazione e il contrasto ottimali per eseguire l'imaging del volume 3D con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato. I protocolli standard spesso soffrono di una mancanza di contrasto della membrana in cui, poiché il protocollo avanzato fornisce un forte contrasto della membrana. Le immagini a sezione trasversale di C.elegans con protocollo avanzato e protocollo standard mostrano una differenza distintiva.Così come per le immagini a sezione trasversale di nervus tibialis, il protocollo avanzato aiuta a mostrare un contrasto della membrana più forte rispetto al protocollo standard. Dopo la post-elaborazione, i dati del microscopio elettronico vengono visualizzati utilizzando IMOD, un programma di elaborazione e modellazione delle immagini. L'area evidenziata in blu mostra gli assoni segmentati.L'area evidenziata in rosso mostra i bundle Remak. Le aree evidenziate dal giallo e dall'arancione mostrano suone di mielina. E l'area evidenziata dal turchese mostra i mitocondri.La resliquiatura virtuale e il modello tridimensionale illustrano l'architettura dei tessuti fini e aiutano a comprenderne la funzione. Possono essere utilizzati anche altri metodi di microscopia elettronica a scansione di volume come la microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi e la tomografia array. Questo protocollo può anche essere utilizzato per la microscopia elettronica a trasmissione e altri tipi di campioni come campioni del sistema nervoso centrale.Il tetrossido di osmio, il tiocarboidrozide e l'acetato di uranile sono sostanze chimiche tossiche e devono essere usati con attenzione. Anche la resina è dannosa e deve essere utilizzata con cura. I dispositivi di protezione individuale come guanti e camice da laboratorio devono essere indossati per il protocollo completo.

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